关键词：枇杷叶；黄酮；假单胞菌
目前，植物叶中提取黄酮类化合物的探究及其功效的完善是国内外研究的热门课题。枇杷叶中黄酮体外抗氧化试验结果表明【1】，枇杷叶中黄酮对超氧自由基的清除率，随浓度的升高而增大，枇杷叶提取物黄酮类具有极强的生物活性【2】，是一种无害的天然提取物，具有降低心肌耗氧量、防治血管硬化等作用，在医药、食品等领域具有广阔的应用前景。
本试验的目的在于证实黄酮类提取物对假单胞茵有极其显著的抑制作用，如对其进行进一步的深化研究，有望将其生产成新的抑菌剂。这将为医学的发展提供重要的数据来源。
1材料和方法
1．1材料
取长沙枇杷叶的嫩叶、成熟叶、老叶、假单胞菌、无菌培养皿、管若干，粉碎器、水浴锅、真空泵等。
1．2方法
1.2.1黄酮的提取
取枇杷嫩叶、成熟叶、老叶 洗干净，去尘土类物质后烘干，分别粉碎枇杷叶，研碎，将粉碎样品分别贴标封口袋中保存。
分别称取枇杷嫩叶、成熟叶、老叶粉末各1g以50ml50°C乙醇为溶剂，置于80°C水浴锅浓缩，400r离心3min取上清液。
1.2.2培养基的制备
营养琼脂培养基：蛋白胨0.1g、牛肉膏0.3g、氯化钠0.5g、琼脂2g、蒸馏水100mL。将除琼脂以外的各成分溶解于蒸馏水内，并用1.5g/mL氢氧化钠溶液调pH至7.2~7.4，加入琼脂，加热煮沸使琼脂溶化，分装于烧瓶内，并于121℃下高压灭菌15min。
营养肉汤培养基的配制：蛋白胨0.1g，牛肉膏0.3g，氯化钠0.5g，蒸馏水50mL。将各组分混合、溶解后调节pH7.4，分装于各试管、烧瓶内，121℃下高压灭菌15min。
1.2.3黄酮对假单胞菌的抑制试验
将假单胞菌在培养基上活化后，用灭菌生理盐水配制成含菌数106 -107cfu／mL的菌悬液备用。一般挑取纯化的大小适中的菌落2个，无菌操作，加入9mL生理盐水中，搅拌均匀【3】。将厚度为1．5mm的滤纸用打孔机打成直径为6mm圆片，并放在培养皿中，干热灭菌备用。将配制好的灭菌培养基冷却至50℃-60℃，倾注于干热灭菌的培养皿内，制成平板待用。用无菌吸管分别吸取0.2mL各供试菌悬液于平皿内，用无菌玻璃三角涂棒将菌悬液涂布均匀。将滤纸片于黄酮抑菌液的不同溶液中浸泡5min，取出晾干，轻贴于平板上，每1个平皿均匀放5个滤纸片(以蒸馏水代替黄酮抑菌液作为空白对照)。不同的黄酮抑菌液做3个平板重复。然后将平皿倒置于恒温箱中，28℃培养48h。用游标卡尺测量各抑菌圈大小。
1.2.4黄酮对假单胞菌细胞膜通透性的影响
活化假单胞菌，28℃振荡培养，取适量菌液，加入黄酮使其最终浓度为0．3％，用蒸馏水代替黄酮溶液作为对照组，分别干O h，1h，2 h，3 h，4 h，5 h，6h测定培养液的电导率值，从而确定金属离子的渗出变化趋势。
1.2.5黄酮对培养液中蛋白质浓度的影响
方法同上，蛋白质含量按照Bradford的方法进行，实验重复3次【4】。
1.2.6黄酮对菌体细胞壁的影响
方法同上，3500r／min离心1Omin，取上清液用试剂盒方法测定碱性磷酸酶(AKP)的含量，随时间延长检测AKP的变化情况。
2结果与分析
注：抑菌圈直径为5次重复的平均值，其右上角的字母表示Duncan多重比较检验结果，具不同字母者，表示差异显著(p 从表1中可见不同时期黄酮溶液对假单胞菌均有显著的抑制效果，且随着时间往后推移，其抑菌效果逐渐增强。
由试验可知随着黄酮对菌体作用时间的延长，培养液电导率持续增加，且处理1h后电导率变化的速率明显升高，这说明经过黄酮处理的菌体细胞随着作用时间的延长均有细胞质渗漏，电解质的渗出量不断增大，可能造成细胞膜流动性降低，细胞内环境稳定性被破坏，从而导致原生质外渗，破坏菌体细胞，从而起到抑菌作用。黄酮还可改变细菌细胞的膜透性，致使细胞内的蛋白质渗漏到体外的培养液中。通过对碱性磷酸酶的测定，可知黄酮对假单胞菌的细胞壁有很强的破坏作用。
参考文献
[1]王建超. 枇杷叶多酚提取、纯化及其抗氧化、抑菌活性研究[D].福建农林大学,2015.
[2]吕寒,于盱,陈剑,李维林.枇杷叶黄酮类化学成分研究[J].中成药,2014,36(02):329-332.
[3]王仲礼．添加剂在低温肉制品保鲜中大有作为[J].肉类工业，2005(12)：27～29.
[4] Bradford，M．A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein—dye binding．Anal．Biochem[J]．1976，72：248～254.
论文作者:李微 陈文逸 邓佳文 罗琼
论文发表刊物:《大众医学》2018年12期
论文发表时间:2019/3/29
标签：黄酮论文; 琼脂论文; 培养基论文; 作用论文; 枇杷叶论文; 培养液论文; 蒸馏水论文; 《大众医学》2018年12期论文;