山西省人民医院眼科
【摘 要】目的：研究Metformin通过NRF2对人眼脉络膜黑色素瘤细胞放疗敏感性的调节机制。方法：采用siRNA构建低表达NRF2的OCM-1细胞；RT-PCR检测NRF2表达；平板集落形成法比较各组细胞对 X 射线的敏感性。结果：RT-PCR证实了siNRF2/OCM-1细胞NRF2的表达明显低于NC/OCM-1细胞，细胞经Metformin和X射线处理后，siNRF2/OCM-1较NC/OCM-1细胞明显降低了存活分数，结论：Metformin通过抑制NRF2对人眼脉络膜黑色素瘤起到了放疗增敏的作用。
【关键词】人眼脉络膜黑色素瘤；Metformin；NRF2；放疗敏感性
二甲双胍（Metformin）是2型糖尿病患者常用口服降糖药。2005年Evans等研究发现Metformin可降低糖尿病患者恶性肿瘤的发生率[1]。有研究证实Metformin对于多种实体肿瘤均有不同程度的增殖抑制的作用[2]。核因子E2相关因子2（nuclear factor-E2-related factor2，NRF2）是Keapl-NRF2-ARE信号转导通路中重要的转录因子，有报道其在细胞抗氧化应激损伤、肿瘤发生发展及肿瘤放化疗抵抗等多方面发挥作用[3]。放射治疗是治疗人眼脉络膜黑色素瘤重要的治疗方式，本研究通过Metformin对人眼脉络膜黑色素瘤细胞OCM-1细胞放射敏感性的研究，探讨Metformin通过调节NRF2调节人眼脉络膜黑色素瘤细胞放疗敏感性。
1 材料
1.1 细胞株 人眼脉络膜黑色素瘤细胞株OCM-1由中科院上海细胞生物研究所细胞库提供。
1.2 试剂与仪器 胎牛血清（FBS）、DMEM 培养基为美国GIBCO 公司产品，Metformin，siNRF2和NC购自上海Genepharma公司，lipofectamine 2000 购自美国Invitrogen公司，RT-PCR采用TaqMan试剂盒，细胞照射采用直线加速器X射线（瑞典瓦里安）。
2 方法
2.1 构建低表达NRF2的OCM-1细胞
使用商品化的 siRNA靶向干扰OCM-1细胞中的NRF2基因，以NC（Negative control）作为对照组，利用lipo2000试剂转染siNRF2小分子片段进入OCM-1细胞，构建低表达NRF2的siNRF2/OCM-1细胞。
2.2 RT-PCR检测NRF2表达
提取细胞总RNA，反转录引物采用带茎环结构的引物，引物序列：for 5' aagcactaatatatcgccacc 和 rev 5' agccatcgccgcactt，内参选用actin。分别加入反转录体系：42°C 30 min，95°C 5min，4°C 5min。取出cDNA后进行PCR反应；分别加入RT-PCR体系，共45个循环，重复3次实验，结果用2-△△Ct值表示。
2.3 平板集落形成法比较各组细胞对 X 射线的敏感性
siNRF2/OCM-1细胞和NC/OCM-1细胞经Metformin处理 48 h，采用 6 MV X 射线进行照 射，剂量率 400 cGy/min。设定 0，2，4，6，8，10Gy 照射剂量点，每个剂量点 设 3 个平行样本，细胞经照射后培养 5d，克隆形成后采用平板集落形成法用甲 醛固定细胞集落 15 min，Giemsa 染色 30 min，自然晾干后进行克隆计数，细胞 数≥50 个的集落被作为存活克隆予以计数。
2.4 统计学方法
数据处理数据保留两位尾数，计量资料以均数±标准差表示，RT-PCR检测结果采用两独立样本T检验，采用SPSS19.0 统计软件包。
3 结果
3.1 低表达NRF2的OCM-1细胞株的建立
RT-PCR测定NRF2的表达，结果显示siNRF2/OCM-1细胞NRF2的表达明显低于NC/OCM-1细胞（图1）。
图2 细胞接受 X 射线照射后存活曲线（n=3）
4. 讨论
NRF2是细胞氧化应激反应中的关键因子，受Keap1的调控，通过与抗氧化反应元件ARE（antioxidant response element）相互作用，调节抗氧化蛋白和II相解毒酶的表达[4]。本研究证实了经Metformin处理后，siNRF2/OCM-1较NC/OCM-1细胞明显降低了存活分数，表明NRF2表达降低可提高人眼脉络膜黑色素瘤细胞对射线的敏感性。
综上所述，Metformin能够抑制人眼脉络膜黑色素瘤细胞的增殖并且通过抑制NRF2对人眼脉络膜黑色素瘤起到了放疗增敏的作用，这为下一步人眼脉络膜黑色素瘤放疗抵抗的临床和基础研究提供了重要的实验依据，NRF2参与的人眼脉络膜黑色素瘤放射调节下游相关的分子机制还有待进一步研究。
参考文献：
[1] Evans J M，Donnelly L A，Smith A M et al．Metformin and reduced risk of cancer in diabetic patients[J]. BMJ 2005，330（7503）：1304-1305．
[2] de Barros Machado A，Dos Reis V，Weber S，Jauckus J，Brum IS，von Eye Corleta H，Strowitzki T，Capp E，Germeyer A. Proliferation and metastatic potential of endometrialcancercells in response tometformintreatment in a high versus normal glucose environment. Oncol Lett. 2016 Nov；12（5）：3626- 3632.
[3] Kim EH，Jang H，Roh JL. A Novel Polyphenol Conjugate Sensitizes Cisplatin-resistant head and neckcancercells to cisplatin viaNrf2inhibition. Mol Cancer Ther. 2016 Nov；15（11）：2620- 2629.
[4] Liu M，Yao XD，Li W，Geng J，Yan Y，Che JP，Xu YF，Zheng JH. Nrf2sensitizes prostatecancercells to radiation via decreasing basalROSlevels. Biofactors. 2015 Jan；41（1）：52- 57.
论文作者:韩牧园
论文发表刊物:《航空军医》2017年第7期
论文发表时间:2017/6/20
标签：细胞论文; 脉络论文; 敏感性论文; 黑色素瘤论文; 射线论文; 细胞株论文; 引物论文; 《航空军医》2017年第7期论文;