（四川大学华西口腔医学院正畸科 四川省成都市 610041）
摘要：目的 构建BMSCs/COL-HA复合体，考察BMSCs在两种材料上的黏附与增殖，为探索更适合牙周缺损再生的组织工程支架材料提供依据。方法 利用冷冻干燥仿生矿化的方法制备COL-HA。[结果] 本实验在王晓敏，林晓艳等学者研究的基础上采用冷冻干燥的方法制备胶原-羟磷灰石多孔复合材料，并对部分材料进行交联处理，比较两种材料的生物学性能，进一步利用犬骨髓间充质干细胞BMSCs作为种子细胞，构建BMSCs/COL-HA复合体，考察BMSCs在两种材料上的黏附与增殖，为探索更适合牙周缺损再生的组织工程支架材料提供依据。
关键词：组织工程；犬骨髓干细胞；牙周再生；胶原羟磷灰石支架材料
1.引言
随着人们生活质量的提高以及对美观的追求，寻求正畸治疗的成年人也日益增多，正畸医生面临着治疗不同牙周状况的成年正畸患者，部分患者甚至已有牙周缺损。对于牙周组织已有丧失的患者，即使在轻微的矫治力作用下，也可能导致牙齿的松动甚至脱落。此外由于不当的正畸力，导致牙根暴露，牙槽骨吸收以及骨开窗，骨开裂等时有发生。因此，恢复缺失的牙周组织，成为牙周医生与正畸医生共同关注的问题。尽量恢复患牙的生理功能并使其适宜进行正畸治疗，对患者生活质量的提高具有重要的临床意义以及社会意义。应用组织工程学的方法促进牙周再生是当前的研究热点，它能够将种子细胞、支架材料以及引导性组织再生融为一体，从而实现牙周再生的目的。
良好的生物材料可以为细胞生长提供依附的支架，促进细胞生长进而形成一定形状的组织和器官。理想的组织工程支架材料应具有以下几个特点[1-3]：1.具有良好的生物相容性，材料在植入体内后不引起机体的移植排斥反应或者炎症反应；2.具有良好的降解性，降解速率应该与植入体内后机体组织形成的速率相匹配；3.具有一定的坚韧性以及具有多孔性，能提供细胞渗透和组织生长的三维立体结构；4.具有良好的骨传导性以及骨诱导性，利于细胞的黏附与增殖；5.容易塑性，能根据需要加工成大小和形状。
以往，胶原-羟基磷灰石的制备方法主要有[4-6]：1.交替沉淀法：将戊二醛交联的胶原海绵经过冷冻干燥，制备出胶原支架。将该支架交替放入含磷酸根离子和钙离子的溶液中。改变循环次数得到羟基磷灰石含量不同的支架材料。羟基磷灰石晶体与胶原的羟基和羟基基团以及氨基形成有效结合，形成弱结晶羟基磷灰石。2.冷冻干燥仿生矿化法：王晓敏等利用胶原的自组装性能，通过原位矿化与冷冻干燥的方法，实现了用一步法完成胶原与羟基磷灰石的合成。并通过系统的研究表明通过控制凝胶体的脱水率，羟磷灰石的含量，以及冷冻介质的条件可控制支架的孔径，孔隙率及吸水率以及降解率。胶原羟基磷灰石复合材料在两者比例为4：6时具有良好的溶胀率，酶解率和生物力学性能，同时原位矿化得到的胶原羟基磷灰石复合材料还具有良好的钙磷释放能力。利用冷冻干燥仿生矿化的方法制备COL-HA 是目前较新的制备方法。
林晓艳等[48]采用戊二醛对复合的材料进行交联处理，并对比分析了交联前后复合材料的溶胀度，结合能，发现戊二醛交联能促使羟基磷灰石与胶原之间形成更多键，改变了材料的化学状态和结合能，增加了胶原纤维与羟基磷灰石之间的界面结合强度。
本实验在王晓敏，林晓艳等学者研究的基础上采用冷冻干燥的方法制备胶原-羟磷灰石多孔复合材料，并对部分材料进行交联处理，比较两种材料的生物学性能，进一步利用犬骨髓间充质干细胞BMSCs作为种子细胞，构建BMSCs/COL-HA复合体，考察BMSCs在两种材料上的黏附与增殖，为探索更适合牙周缺损再生的组织工程支架材料提供依据。
2.资料和方法
2.1 主要材料与仪器
2.1.1主要材料和试剂：
I型胶原蛋白（由胃蛋白酶消化乳牛皮制得）
CaCl2，（NH4）2HPO4，HCl，NaOH，NH3?H2O 均为分析纯（成都科龙化工试剂厂）
a-MEM培养基（Gibco，USA）
胎牛血清（Gibco，USA）
二甲基亚砜DMSO（Sigma，USA）
吖啶橙（国药集团化学试剂有限公司）
2.1.2 主要仪器设备
超净工作台（Speg air tech，中国）
37°CO2恒温孵箱（MCO-15AC型，Sanyo electric Co.Ltd，Janpa）
扫描电镜（HITACHI公司，日本，S4800型）
激光共聚焦显微镜（LEICA，德国，SP5型）
培养瓶、孔板（CONING，USA）
微量移液枪（Eppendorf，Germany）
2.2 实验方法
2.2.1 多孔COL-HA复合支架材料的合成
复合前驱液的形成：低温下向胶原酸性溶液中加入Na2HPO4 和 NaOH，胶原溶液浓度为7mg/ml，调节溶液的离子强度为0.02M，pH为7.2±0.2，形成中性胶原溶液。向溶液中依次加入（NH4）2HPO4 和 CaCl2 水溶液，NaOH调节溶液 pH 为 9 左右，此时，溶液变为白色复合乳状前驱液；
制备合成COL-HA 复合乳液后，倒入管状模具中，制成棒状复合凝胶，将复合前驱液升温至 25°C，胶原在热驱动下由分子自组装形成纤维，同时磷酸钙进一步生长；
复合凝胶体形成：胶原纤维进一步生长，搭建成具有网络结构的凝胶体，无机相磷酸钙在纤维网络中生长成熟转变为羟基磷灰石，凝胶网络充满大量水分；
复合凝胶的清洗脱水：复合凝胶在去离子水中清洗去除反应残留物，经预先脱水与冷冻干燥后形成多孔复合材料。将复合凝胶置于冻干机中，随机降温至-60°C后，抽真空至低于1Pa，开始冻干，冻干时间约40小时。复合支架COL与HA比例为 4/6。
COL-HA 的交联：将冻干的COL-HA 浸泡于0.25%的戊二醛溶液中，96h后取出干燥。
2.2.2 多孔COL-HA复合支架材料的性能检测
2.2.2.1多孔COL-HA复合支架材料的形貌
材料与方法：
材料：多孔COL，交联的COL-HA，未交联的COL-HA
测试方法：将多孔材料用刀片切开，切面喷金，S-4800型扫描电镜（SEM）进行形貌观察。Ruler 软件测量孔的长度l及宽度w，计算孔径d：
d=
孔径计算结果采用平均值±标准差。
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2.2.2.2 多孔COL-HA复合支架材料的细胞形貌观察与细胞增殖
材料的消毒：将制备好的交联与未交联的两种COL-HA切成约3mm厚的圆片，用75%酒精浸泡消毒24h，取出置于a-MEM 培养基中浸泡12h后取出，换新鲜a-MEM 培养基继续浸泡12h，除去残余的酒精。将准备好的材料置于24孔板中待用，每种材料重复八个孔。
细胞接种：将前面培养的犬BMSCs用 0.25%胰酶消化后，用 a-MEM 培养液配成浓度为 2×105个/ml 细胞悬液，再分别把混匀的细胞悬液1ml/孔依次接种到准备好的材料中，置于 5% CO2，37°C 培养箱中培养，每两天换液一次。
细胞形貌观察：分别在培养 1、3、5、7天后将材料从培养基中取出。
用于SEM观察的材料处理：用PBS（pH=7.2）将材料分别清洗两遍，再用2.5%戊二醛固定3 小时，依次用30%，50%，70%，90%，100% 乙醇溶液梯度脱水，临界点干燥，喷金后 SEM 观察。
用于激光共聚焦观察的材料处理：将材料取出后置于0.01%吖啶橙溶液中染色 3mins，然后从吖啶橙中取出放入PBS溶液中清洗 2-3mins，在激光共聚焦显微镜下观察。激光共聚焦扫描方式为沿z轴方向从上至下逐层扫描，每层间隔5μm，扫描深度500μm（即100层）。
细胞增殖MTT测试：细胞增殖在培养1、3、5、7 天后用 MTT法测试，每个样品每个时间点 5 个平行样。吸去培养基，PBS 清洗材料两遍，加入新鲜培养基，每孔加入420μl MTT（5mg/ml），37°C孵化3.5h后弃去上清，每孔加入 1mlDMSO，振荡 5 分钟后，转入96孔板中，在酶标仪上 490nm处测试吸光度（OD）。
统计分析：MTT结果采用平均值 ± 标准偏差，并用t 检验法分析材料间是否存在显著性差异。
3.结果
3.1多孔COL-HA复合支架材料的形貌
多孔的COL 和交联与非交联的COL-HA支架的切面形貌，与对照组COL相比，交联与非交联的COL-HA均具有贯通性良好的多孔。多孔COL的孔径270-650μm，平均孔径415±20μm，孔大小不均匀，孔壁薄；交联型COL-HA 的孔径171-247，平均孔径203±18μm；未交联COL-HA的孔径175-245μm，平均孔径205±21μm，孔较均匀，孔壁明显比COL支架厚。将COL-HA的孔壁较致密处放大至60000倍，可观察到孔壁是由紧密排列编织的纤维构成，纤维上有颗粒的附着，分布均匀，将纤维包裹，显示COL-HA是矿化的胶原纤维。
3.2 BMSCs/COL-HA复合体SEM形貌观察
BMSCs在交联与非交联的COL-HA材料上生长3天时的SEM图。低倍镜下见细胞生长状态均良好，梭形的BMSCs清晰可见，细胞呈梭形，星形或多边形，胞体扁平，伸出伪足与支架紧密黏附。高倍下可见细胞在材料表面贴和紧密，甚至可见细胞钻入材料缝隙中，与材料紧密结合。
3.3 BMSCs与交联和非交联的COL-HA 复合后激光共聚焦显微镜CLSM观察
材料在1、3、5、7天的激光共聚焦照片。两种材料在1天时已黏附在材料上，梭形的细胞形态清晰可见。其中经过交联的材料上细胞密度较于非交联的COL-HA材料上的细胞密度大。随时间的增长各材料上的细胞均越来越密集，第7天时两材料上细胞相互接连，细胞密度最为密集。但非交联型材料的细胞密度稍小于交联型材料。
BMSCs在交联型COL-HA上生长7天后，扫描100层的三维叠加图。细胞已经分布在整个支架表面，并且细胞沿着支架孔壁生长。z轴方向从上至下的单层CLSM图，可看出细胞先在支架表层生长，并且在不断的向支架内部渗透，7天的时候细胞已经渗透到500 μm处。
3.5 细胞增殖MTT结果
利用MTT法可对材料的细胞相容性作出可靠的定量评价。交联型COL-HA材料上的BMSCs增殖速度与未交联过的COL-HA材料相比较快，但两者的差异没有统计学意义（P＞0.05），表明交联型材料与非交联型材料均具有良好的细胞相容性。交联型与非交联型COL-HA均在第7天显示了最快的增殖速度，两种材料之间没有显著性差异（P＞0.05）。细胞在交联型复合材料中显示了比非交联型材料更快的增殖速度这一结果与复合材料的其他体外测试结果一致，但MTT结果表明两者之间的差异没有统计学意义。
4.讨论
随着寻求正畸治疗的成年患者的增多，正畸医生面临着治疗不同牙周状况的成年正畸患者，部分患者甚至已有牙周缺损。对于牙周组织已有丧失的患者，即使在轻微的矫治力作用下，也可能导致牙齿的松动甚至脱落。恢复缺失的牙周组织，是牙周医生与正畸医生共同关注的问题。然而治疗后再生的牙周组织是否能够承受正畸力是正畸医生极为关注的问题。应用组织工程学的方法促进牙周再生是当前的研究热点，它能够将种子细胞、支架材料以及引导性组织再生融为一体，从而实现牙周再生的目的，为牙周再生后牙移动打下基础。牙周组织工程材料作为组织工程学的核心内容之一，在组织工程中起着重要的作用，良好的支架材料能够为种子细胞提供良好的生长环境，提高细胞的培养效率，组织工程材料植入体内，机体能够良好的适应，结合并修复是组织工程化成功构建的关键因素。
本实验是基于王晓敏等学者研究基础上，进一步将仿生原位矿化的COL-HA进行交联，再通过生物学检测对比两种材料是否均具有良好的生物学性能。
细胞在材料上的黏附和增殖是检测材料生物相容性的重要手段。细胞接触材料后形态发生变化，并随细胞-材料界面的形成而稳定下来。胰蛋白酶消化后，细胞悬液中细胞成圆形，与材料接触后随即吸附在材料上并逐渐伸出伪足，形成梭形细胞，黏附于材料后细胞再进一步分裂增殖。细胞相容性好的材料，细胞吸附快，增殖速度也相应较快。细胞在材料上的黏附和增殖是检测细胞在材料上生物相容性的重要指标。同时组织工程支架材料与种子细胞复合体的体外构建也是组织工程中重要的环节。
本研究将犬BMSCs接种于交联型与非交联型多孔支架材料上，SEM结果显示其在两种材料上均能够迅速黏附，增殖，细胞呈梭形，伸展良好；而CLSM结果亦显示细胞在交联与非交联的COL-HA复合材料上均具有良好的黏附性，细胞分散均匀，密度均一，生长良好，随时间的增长，细胞密度增大。MTT结果与SEM及CLSM结果一致，均显示交联与非交联型材料具有良好的生物相容性，细胞在材料上具有良好的粘附性。但MTT检测为定量检测，其统计学结果显示细胞在两种材料上的增殖差异无统计学意义。综合以上对两种材料的研究，交联型与非交联型COL-HA均具有良好的生物相容性，能够为细胞提供良好的生长环境，体外BMSCs与两种支架材料的复合均能获得成功，由于非交联型COL-HA的制作工艺较交联型COL-HA简单，因此我们选择非交联型多孔材料作为后续试验的材料。
5.小结
1.交联型与非交联型COL-HA多孔支架材料均具有适合于骨组织工程修复支架材料的孔径，孔隙率；
2.交联型与非交联型COL-HA多孔支架材料均具有良好的生物形容性，BMSCs在COL-HA多孔支架材料上具有良好的增殖性、粘附性与渗透性，能够与支架材料在体外构建良好的支架材料种子细胞复合体。
参考文献
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作者简介：刘泽萍（1983-），女，博士，主治医师。
论文作者:刘泽萍
论文发表刊物:《航空军医》2017年第14期
论文发表时间:2017/9/21
标签：交联论文; 材料论文; 细胞论文; 支架论文; 多孔论文; 磷灰石论文; 胶原论文; 《航空军医》2017年第14期论文;