肖建华[1]2003年在《猕猴复合麻醉剂的实验研究》文中研究指明为了研制一种专用于猕猴的复合麻醉剂，本实验按照复合麻醉理论，针对猕猴的生理特点及生物学特性，利用科学、合理的医学实验方法进行了系统的研究。 通过预实验在多种麻醉剂中筛选出氯胺酮、静松灵等对猕猴敏感的药物，并初步探索了各药的比例。根据预实验结果以小白鼠为实验动物进行叁因素叁水平正交实验、正交设计决定性验证实验确定了复合麻醉剂的试用组方。 以试用组合方剂对猕猴进行临床麻醉实验研究，观察麻醉效果、动物的生理反射情况，同时利用Datex循环呼吸监护仪和生理多导仪进行麻醉过程中循环、呼吸及脑功能的连续动态监测。结果表明：麻醉效果确实，达到外科麻醉的深度，镇痛、镇静、肌松效果均衡，对生理功能影响轻微。由此可见该试用组合方剂能满足猕猴临床麻醉的需要。 利用序贯法以小白鼠为实验动物进行急性毒性实验，测得猕猴复合麻醉剂试用组方的半数有效量ED_(50)为21.70mg／kg、半数致死量LD_(50)为99.55mg／kg。麻醉指数(即安全系数)AI=LD_(50)／ED_(50)=99.55／21.70=4.58，此结果表明试用组合方剂具有很大的安全范围。 以兔为实验动物进行局部刺激性实验。结果合剂肌肉注射无刺激性，点眼仅见轻微刺激。合剂符合肌肉注射剂的临床应用标准。 综上所述，本实验研制的猕猴复合麻醉剂试用组方具有麻醉效果确实，对生理功能影响小，安全范围广，可通过肌肉注射给药，使用方便等特点。该组方能满足临床麻醉需要，可应用于临床实践。
魏丹[2]2010年在《静松灵复合制剂对犬麻醉效果的研究》文中研究表明临床上用于犬的麻醉药物种类繁多,各有优点,也各存缺陷。当前,任何一种单一的麻醉药物都不能达到理想的麻醉效果,存在着使用剂量大,毒副作用高,安全范围窄等问题。尽管吸入麻醉具有麻醉效果确实,麻醉深度可控性强等优点,但因价格昂贵以及需要特殊的仪器设备辅助使用,临床上很少应用,因此,复合麻醉便理所当然地成为了动物临床麻醉研究的主流。然而,目前已有复合麻醉药物麻醉效果不理想,并有一些药物的生产受到限制。基于上述情况,尽快研制与探索专用于犬的理想的麻醉制动剂成为当务之急。本实验以动物复合麻醉理论为依据,针对犬的生理特点,利用科学合理的实验方法对犬复合麻醉制剂进行了全面系统的研究。本实验首先通过预实验确定静松灵、强痛宁、氟哌利多、咪达唑仑做为复合方剂的试验用药,并初步确定了各种药物的大致比例;通过对小白鼠进行四因素叁水平正交试验,正交决定性验证最终确定出实验组方的最佳组方和最佳比例为2.5:0.2:0.4:0.25 (V:V);由小白鼠急性毒性试验可知,静松灵组方合剂的半数有效量、半数致死量和麻醉指数(即安全系数)分别为7.41 mg/kg、64.57 mg/kg和8.71,表明该组方合剂具有很大的安全范围,暂命名为静松灵复合制剂;将静松灵复合制剂应用于试验犬麻醉,利用呼吸监护仪、重症监护仪和脑电图进行连续监测,结果各项监测指标均在正常生理范围之内,并通过手术验证试验进一步证实静松灵复合制剂具有良好的镇静、镇痛、肌松效果;在与犬眠宝合剂麻醉效果对比试验中,发现静松灵复合制剂对循环呼吸及脑功能影响均比QMB合剂轻微,本试验结果表明,静松灵复合制剂的麻醉效果显着优于QMB合剂。综上所述,静松灵复合制剂应用于临床具有诱导平稳迅速,良好的镇静、镇痛和肌松效果,对生理功能影响小,安全范围广,使用方便等优点,能满足临床麻醉需要,可应用于临床实践。
胡文[3]2013年在《人工神经移植物修复周围神经缺损与功能重建应用基础研究》文中研究表明第一部分：人工神经移植物修复前臂正中神经30mm缺损的临床研究目的：了解壳聚糖/聚乙醇酸人工神经移植物修复人体混合神经大段缺损后运动、感觉和植物神经功能恢复及安全性，为该移植物向临床转化应用奠定基础。方法：患者男性，55岁，外伤致右前臂远段正中神经30mm缺损，受伤12小时内接受壳聚糖/聚乙醇酸人工神经移植物桥接修复术。术后采用握力、捏力测定和拇指外展、对掌、对指等检查评价运动功能恢复，采用两点辨别觉、Semmes-Weinstein单丝触觉检查评价感觉恢复水平，通过记录拇短展肌复合肌动作电位评价再生神经电生理传导功能和靶肌重支配，采用茚叁酮试验、激光多普勒血流灌注成像分析植物神经功能恢复情况。术后1、2、4周检测血常规、尿常规和血生化(肝、肾功能)。结果：术后18个月，患者术侧手基本能完成日常活动，大鱼际轻度萎缩，握力、捏力分别恢复达正常侧的15.8%和6.3%，拇指与其余各指皆能完成对指动作，示指、中指末节指腹静止两点辨别觉均大于15mm。术后36个月，术侧手日常活动自如，拇指屈伸、展收及对掌自如，运动幅度接近正常侧，可完成拾硬币、持筷子等动作，书写较自如，术侧握力、捏力分别恢复达正常侧的93.3%和83.3%，拇指末节指腹静止两点辨别觉为14mm、示指9mm、中指9mm，均能感知规格4.56的单丝触压，出汗功能部分恢复。术后7年，术侧手活动较前更自如，患区异常畏寒现象消失，握力、捏力均超过健侧，两点辨别觉较36个月时略有进步，单丝触觉无进步，拇短展肌复合肌动作电位波幅约为健侧的1/4，患区血流灌注水平及其对冷、热刺激的血流灌注应变接近健侧。术后血常规、尿常规和血生化检查未见异常。结论：采用壳聚糖/聚乙醇酸人工神经移植物修复人前臂正中神经30mm缺损后，患者运动、感觉恢复优良，BMRC评级达M4S3+水平，植物神经功能恢复良好，受损神经支配区皮肤血管运动调节功能得到明显恢复。第二部分：人工神经移植物修复大、小鼠坐骨神经缺损后再生与功能重建的监测及评价目的：了解壳聚糖/聚乳酸乙醇酸人工神经移植物(以下简称“人工神经移植物”)修复啮齿类动物坐骨神经缺损后修复段神经纤维再生速度、修复不同距离缺损所需时间、修复后感觉与运动功能重建的进程以及经历较长时程后再生神经纤维的成熟度，为阐明人工神经移植物修复周围神经缺损的机理提供科学内容。方法：(1)采用人工神经移植物桥接修复大鼠坐骨神经不同距离(2,3,4,6,8,10mm)缺损，以自体神经桥接和神经钳夹伤为对照，术后定期进行神经捏压试验，测定感觉神经纤维生长距离，分析大鼠不同距离神经缺损修复后再生神经纤维跨越缺损段所需时间。同法分析人工神经移植物桥接修复小鼠坐骨神经不同距离(2,4mm)缺损后缺损段再生所需时间。(2)用人工神经移植物桥接修复小鼠坐骨神经不同距离(2,4mm)缺损，以自体神经桥接、神经钳夹伤和缺损组为对照，同时，另一组小鼠坐骨神经4mm缺损用人工神经移植物结合神经组织碎片桥接。术后定期进行运动展趾试验、皮肤捏压试验和静态展趾试验，动态监测神经修复后靶区运动、感觉与感觉-运动协调功能的恢复进程。(3)采用人工神经移植物桥接修复小鼠坐骨神经2mm缺损，以自体神经桥接和缺损组为对照，术后1年进行足底热痛阈测定、腓肠肌复合肌动作电位测定、腓肠肌和胫前肌湿重比、移植物远侧再生神经组织学与电镜观察及形态计量等分析，评定神经功能恢复情况和再生神经纤维的成熟度。结果：(1)人工神经移植物桥接修复大鼠坐骨神经不同距离缺损后，再生感觉神经纤维通过缺损段所需时间与缺损长度呈正相关，长过2mm缺损耗时10天左右，6mm缺损约需17天，10mm缺损则耗时33.5天左右；再生感觉神经纤维在人工神经移植物桥接的2mm缺损段内平均生长速度为0.21mm/天，而当缺损长度为4～10mm时，该速度为0.30～0.35mm/天。感觉纤维在损伤段远侧神经内的生长速度为2～3mm/天。(2)小鼠坐骨神经2mm缺损人工神经移植物桥接修复与自体神经修复后运动展趾功能重建进程相近，约在术后20～26天开始重现运动展趾(较神经钳夹伤组延迟10～15天)，而后经历15～20天恢复到最大程度(但仍明显不及钳夹伤组)；人工神经移植物修复4mm缺损后运动展趾功能重建速度与程度均明显不及自体神经修复，但辅加神经组织碎片可明显改善运动展趾功能的重建。(3)小鼠坐骨神经缺损无论用自体神经还是用人工神经移植物桥接修复，术侧第5趾皮肤感觉恢复速度很慢，术后80天左右才出现较明显恢复(总体反应强度仍低于正常)，而钳夹伤后3～4周即可恢复正常。(4)小鼠坐骨神经不同距离缺损/修复后，静态展趾功能仅缺损2mm人工神经移植物修复组有轻度恢复，其余各修复组截至术后139天仍无明显恢复。(5)小鼠坐骨神经2mm缺损人工神经移植物修复术后1年，足底痛觉反射潜伏期、腓肠肌和胫前肌湿重比、再生有髓纤维数量与自体神经修复组差异无统计学意义，腓肠肌复合肌动作电位潜伏期、再生轴突直径分布、髓鞘平均厚度与自体神经修复组相当，但均未达到正常侧水平。结论：(1)采用人工神经移植物桥接修复大鼠坐骨神经缺损后再生神经跨越缺损段所需时间与缺损长度呈正相关，在缺损距离较长时修复耗时较自体神经长；(2)神经缺损修复后感觉功能恢复速度和进程均较运动恢复慢，感觉-运动协调功能很难恢复；(3)采用人工神经移植物桥接修复小鼠坐骨神经2mm缺损后，神经组织修复缺损耗时、运动和感觉功能恢复以及再生有髓神经纤维数与自体神经修复相近，且更有利于静态展趾功能的恢复；(4)小鼠坐骨神经2mm缺损修复术后1年，再生有髓神经纤维的成熟度未达到正常水平。第叁部分：大鼠坐骨神经缺损自体神经桥接修复后靶皮肤血流灌注成像研究目的：了解大鼠坐骨神经缺损自体神经桥接修复后靶皮肤血流灌注调节功能的变化特点，初步探讨周围神经修复后血管运动调节的重建，建立采用激光多普勒血流灌注成像(LDPI)评价植物神经功能的方法。方法：采用自体神经桥接修复大鼠坐骨神经10mm缺损，以缺损组和假手术组为对照，每组6只大鼠。术后立即采用LDPI分析足部血流灌注变化以及对0°C冰水浴应激的反应，并且于术后1、3、6个月重复LDPI检测。术后6个月，通过足趾痛觉测定、电生理学检测、靶肌湿重比、神经和皮肤免疫组织化学等方法评价运动、感觉神经功能恢复和神经再生情况。结果：大鼠坐骨神经缺损立即引起相应足部皮肤血流灌注显着增加(约为正常侧的4.79倍)，但冷刺激后的足部皮肤血流灌注增加反应消失。术后1~3个月，自体神经修复组大鼠术侧足部冷刺激所致血流灌注增加反应逐渐恢复，于术后6个月接近正常水平，而缺损组冷刺激所致血流灌注增加反应明显低于自体神经修复组。术后6个月自体神经修复组的足趾痛觉反应潜伏期、腓肠肌复合肌动作电位波幅、再生神经轴突密度与正常侧差异无统计学意义，足趾皮肤中可见大量再生神经纤维。缺损组足趾痛觉反应潜伏期明显延长，远侧“神经”内未见再生神经纤维，腓肠肌和胫前肌严重萎缩，复合肌动作电位未引出。结论：大鼠坐骨神经缺损自体神经桥接修复后靶皮肤血流灌注调节功能逐渐恢复，术后6个月冷刺激血管扩张反应恢复到正常水平；大鼠坐骨神经缺损后足部冷刺激血管扩张反应明显减低；利用激光多普勒血流灌注成像检测靶皮肤血流灌注调节变化，可反映植物神经功能恢复状况。
陆健花[4]2012年在《小脑间位核调节免疫功能的作用途径研究》文中研究表明目的：我们实验室以往的研究表明小脑间位核可调节免疫功能。由于小脑与免疫系统之间没有直接的结构上的联系，因此阐明小脑调节免疫功能的信息传递途径对于更好地理解小脑的免疫调节功能具有重要作用。本研究以小脑—下丘脑的神经投射为切入点来揭示其在传递小脑免疫调节信息中的作用，为小脑神经免疫调节提供新的资料，有助于拓宽小脑功能的知识，促进临床上对小脑神经免疫调节异常疾病的思考和研究。方法：1.在一侧小脑间位核内微量注射顺行神经束路追踪剂葡聚糖-德克萨斯红（dextran-texas red, dextran-TR），观察小脑间位核至下丘脑神经投射的路径及终止部位。2.在一侧下丘脑外侧区（顺行追踪显示下丘脑内终止纤维最丰富的区域）微量注射逆行神经束路追踪剂红色荧光金（fluoro-ruby, FR），观察小脑间位核内FR逆行标记的神经元，同时，结合谷氨酸荧光免疫组织化学法探讨小脑间位核投射至下丘脑的神经元中是否存在谷氨酸能神经元。3.在双侧小脑间位核内微量注射谷氨酰胺酶抑制剂6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸（6-diazo-5-oxo-L-norleucine, DON），以抑制间位核内谷氨酸能神经元合成谷氨酸，并以双侧小脑间位核内注射等量生理盐水及未经任何处理的动物作为对照。在上述叁组（未处理对照组、生理盐水对照组、DON组）大鼠的单侧下丘脑外侧区微量注射逆行神经束路追踪剂FR，5天后，在双侧小脑间位核内注射DON或生理盐水，3天后，同一层面的间位核脑片应用谷氨酸荧光免疫组织化学技术，观察小脑间位核—下丘脑外侧区谷氨酸能神经投射的数量变化。4.在双侧小脑间位核内注射DON后第3天，用高效液相色谱法（high performanceliquid chromatography, HPLC）测定下丘脑内谷氨酸含量的变化。5.在双侧小脑间位核内注射DON后第3天，用血细胞计数法检测动物外周血白细胞中淋巴细胞百分比的变化；用羧基二乙酸荧光素琥珀酰亚胺酯（carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester, CFSE）和结合PE的抗大鼠CD3抗体双标肠系膜淋巴结细胞，流式细胞仪检测T淋巴细胞对刀豆蛋白A（concanavalinA,Con A）刺激的增殖能力的变化；用酶联免疫吸附测定法（enzyme-linked immunosorbentassay, ELISA）检测血清中抗绵羊红细胞IgM抗体水平的变化。结果：1.小脑间位核内微量注射dextran-TR后示踪可见间位核神经元发出离核纤维，行走于同侧小脑上脚中，经小脑上脚交叉到达对侧，然后继续走行于小脑上脚中，进入下丘脑后较多纤维终止于下丘脑外侧区，少数纤维终止于下丘脑室旁核和下丘脑后区。说明小脑间位核神经元发出纤维直接投射至下丘脑（主要是外侧区）。2.下丘脑外侧区内微量注射FR后可逆行追踪到对侧小脑间位核具有FR标记的神经元，这进一步证明了小脑间位核与下丘脑之间存在直接的神经投射；利用谷氨酸荧光免疫组织化学法染色小脑间位核，发现这些FR标记的神经元中有许多谷氨酸阳性神经元。表明小脑间位核投射至下丘脑外侧区的神经纤维中有谷氨酸能神经。3.双侧小脑间位核内注射DON（50mM）后第3天，间位核内FR和谷氨酸双标神经元的数目明显少于生理盐水对照组和未处理对照组，而两组对照之间无明显差异，说明小脑间位核DON注射减少了小脑间位核—下丘脑外侧区的谷氨酸能神经投射。4.双侧小脑间位核内注射DON（50mM）后第3天，下丘脑内谷氨酸含量显着低于生理盐水对照组和未处理对照组，而两组对照之间无显着性差异。双侧小脑间位核内注射低剂量DON（5mM）后，下丘脑内谷氨酸含量没有明显改变。此结果进一步证明双侧小脑间位核内注射DON（50mM）减少了小脑—下丘脑的谷氨酸能神经投射。5.在小脑间位核—下丘脑谷氨酸能神经投射减少的同时，即在双侧小脑间位核内注射DON（50mM）后的第3天，动物外周血中淋巴细胞的百分比、淋巴结T细胞对Con A的增殖能力和血清中抗绵羊红细胞的IgM抗体水平均显着降低，而两组对照（生理盐水对照和未处理对照）之间无显着性差异。然而，低剂量的DON（5mM）注射没有明显改变上述免疫功能。说明减少小脑间位核—下丘脑的谷氨酸能神经投射可导致免疫功能减弱。6.在小脑皮质内注射DON（50mM），没有改变下丘脑内谷氨酸的含量也不影响外周血中淋巴细胞百分比、淋巴结T细胞对Con A的增殖能力和血清中抗绵羊红细胞的IgM抗体水平。这一阴性结果进一步证明上述免疫功能的变化确实由小脑间位核—下丘脑的谷氨酸能神经投射所介导。结论：1.小脑间位核至下丘脑外侧区存在直接的谷氨酸能神经投射。2.小脑间位核内注射DON减弱了间位核至下丘脑的谷氨酸能神经投射。3.减弱小脑间位核—下丘脑的谷氨酸能神经投射导致免疫功能的抑制，提示小脑的免疫调节信息由小脑间位核—下丘脑的谷氨酸能神经投射所传递。第二部分小脑间位核GABA能神经投射调节免疫功能的途径目的：我们在本文的第一部分研究中已说明小脑间位核—下丘脑的谷氨酸能神经投射可调节免疫功能。在这部分工作中，我们探讨小脑间位核的另一传出途径——GABA能神经投射对免疫功能的影响，以更深层次地理解和解释小脑间位核调节免疫功能的作用途径。方法：1.在一侧下丘脑外侧区微量注射逆行神经束路追踪剂FR，观察小脑间位核内FR逆行标记的神经元，同时，结合GABA荧光免疫组织化学法探讨小脑间位核投射至下丘脑的神经元中是否存在GABA能神经元。2.双侧小脑间位核内分别微量注射GABA合成酶抑制剂3-巯基丙酸（3-mercaptopropionic acid,3-MP）、GABA转氨酶抑制剂氨己烯酸（vigabatrin, VGB）以分别减弱或增强间位核的GABA能神经投射，并以双侧小脑间位核内注射等量生理盐水及未经任何处理的动物作为对照。同时，腹腔注射小牛血清白蛋白（bovineserum albumin, BSA）免疫大鼠。术后第3天，流式细胞仪检测动物外周血单个核细胞中T和B淋巴细胞百分比的变化；用CFSE和结合PE的抗大鼠CD3抗体双标肠系膜淋巴结细胞，流式细胞仪检测T淋巴细胞对ConA刺激的增殖能力的变化；ELISA检测血清中抗BSAIgM抗体水平的变化。3.双侧小脑间位核注射3-MP或VGB后第3天，HPLC测定下丘脑内GABA、淋巴结和脾脏中去甲肾上腺素（norepinephrine, NE）含量的变化。4.双侧小脑间位核注射3-MP或VGB后第3天，ELISA试剂盒检测血清中促肾上腺皮质激素（adrenocorticotropic hormone, ACTH）、皮质醇（cortisol）、促甲状腺激素（thyroid stimulating hormone, TSH）、叁碘甲状腺原氨酸（3,5,3’–triiodothyronine,T3）、四碘甲状腺原氨酸（3,5,3’,5’–tetraiodothyronine, T4）水平的变化。结果：1.下丘脑外侧区微量注射FR后逆行追踪至对侧小脑间位核，可见到FR标记的神经元；利用GABA荧光免疫组织化学法染色小脑间位核，发现这些FR标记的神经元中存在GABA阳性神经元，此结果证明小脑间位核与下丘脑外侧区之间存在直接的GABA能神经投射。2.双侧小脑间位核内注射3-MP后第3天，外周血单个核细胞中的T和B淋巴细胞百分比、淋巴结T细胞对ConA的增殖能力、血清中抗BSA的IgM抗体水平均较两组对照显着升高；而双侧小脑间位核内注射VGB后第3天，外周血单个核细胞中的T和B淋巴细胞百分比、淋巴结T细胞对ConA的增殖能力、血清中抗BSA的IgM抗体水平均较两组对照显着降低。在两组对照之间，即双侧间位核内注射生理盐水的对照组和未作任何处理的对照组之间，上述免疫指标无显着性差异。这些结果表明减弱小脑间位核的GABA能神经投射促进了T和B细胞的功能，而增强小脑间位核的GABA能神经投射则抑制了T和B细胞的功能。3.在免疫功能发生变化的同时，即在双侧小脑间位核内注射3-MP后第3天，下丘脑内GABA含量明显降低；而注射VGB后第3天，下丘脑内GABA含量显着升高。在两组对照之间，下丘脑内的GABA含量无显着性差异。这些结果表明间位核内注射3-MP减弱了间位核—下丘脑的GABA能神经投射，而间位核内注射VGB则增强了间位核—下丘脑的GABA能神经投射。因此提示，上述间位核内注射3-MP或VGB导致的免疫功能改变可由间位核—下丘脑的GABA能神经投射介导。4.在免疫功能发生变化的同时，即在双侧小脑间位核内注射3-MP后的第3天，肠系膜淋巴结和脾脏中的NE含量降低，而注射VGB后的第3天，肠系膜淋巴结和脾脏中的NE含量升高，两对照组之间无显着性差异。这些结果表明，间位核内注射3-MP或VGB导致的免疫功能改变可由交感神经这一外周途径介导。5.在免疫功能发生变化的同时，即在双侧小脑间位核内注射3-MP或VGB后的第3天，血清中的ACTH、皮质醇、TSH、T3和T4的水平与两对照组相比无显着性差异，说明腺垂体—肾上腺皮质/甲状腺途径可能不参与介导小脑间位核GABA能神经投射的免疫调节作用。结论：1.小脑间位核至下丘脑外侧区存在直接的GABA能神经投射。2.小脑间位核的GABA能神经投射可调节T和B细胞的功能，其作用是负性调节这些细胞的功能。3.小脑间位核GABA能神经投射通过下丘脑—交感神经的途径实现其免疫调节作用。
魏捷[5]2009年在《器官培养法保存角膜的内皮细胞活性研究及在基因转染和移植排斥研究中的应用》文中研究说明目的1.对两种新型培养基—内皮细胞培养基(Endothelial Cell Medium,ECM)和无动物细胞成分培养基(Animal compound free medium,ACF)在无血清器官培养保存角膜内皮细胞活性方面的效果进行综合评估,对其在无血清角膜培养保存领域的应用前景进行初步探索。2.观察新型人造胶体羟乙基淀粉(Hydroxyethyl Starch,HES)的最新剂型HES130/0.4对器官培养保存角膜片的脱水效果,并与葡聚糖T500相比较,探讨其成为新型角膜脱水剂的可行性。3.为控制移植术后排斥反应发生,阻止内皮细胞损失,探索腺病毒载体对器官培养法保存的离体兔角膜片上内皮细胞的转染效率,以检测报告基因增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)的荧光表达来明确腺病毒的转染效率和动态过程。4.建立不同类型器官培养法保存角膜植片的大鼠角膜移植模型,检测移植后数种参与两大类辅助性T细胞因子Th1因子和Th2因子平衡调节作用的细胞因子和T细胞亚群在眼局部和(或)全身的表达,分析其在器官培养保存角膜移植相关免疫排斥反应中的作用。方法1.将兔和大鼠角膜各80只平均分为5组,在5种含或不含胎牛血清(fetal calf serum,FBS)的培养基中(MEM+2%FBS、高糖DMEM+2%FBS、ECM+2%FBS/ECM、ACF)密闭保存3周后,进行角膜内皮细胞(corneal endothelial cells,CEC)计数和活性染色、兔角膜厚度测量、免疫组织化学染色法(immunohistochemistry,IHC)、免疫印迹法(western blotting,WB)和反转录-聚合酶链反应法(reverse transcription polymerase chain reagction,RT-PCR)定性或半定量检测兔角膜内皮层中肌动蛋白微丝(filament actin,F-actin)和大鼠角膜内皮层中紧密连接蛋白-1(zonula occludens-1,ZO-1)的表达来衡量CEC间连接的紧密程度以及透射电镜(Transmission electron microscopy,TEM)下CEC超微结构的观察。2. 18对配对兔角膜片,一半于无血清ACF培养液中保存21d,葡聚糖T500脱水48h作为对照组;另一半于含10%HES 130/0.4的ACF培养液中保存21d作为实验组,不再另外行脱水程序。保存前后进行CEC计数及活性染色、角膜厚度和含水量的测定、角膜透明度和后弹力层皱褶程度的评估、IHC和WB法分别定性和半定量检测兔角膜内皮层中F-actin的表达以及TEM下CEC超微结构的观察。3.去上皮兔角膜片24只随机分为4组,每组6只角膜,在添加2%FBS的ECM培养液中保存2~3周后与编码增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的腺病毒载体Ad5(滴度范围5×106 vp/uL～5×109vp/uL)37℃下共同孵育3h进行基因转染,随后31℃下继续器官培养观察角膜2周。检测前剥离大部分植片基质,倒置荧光显微镜下观察不同时间点EGFP在CEC中的表达强度,比较不同滴度组腺病毒载体的转染效率、CEC计数,TEM观察CEC超微结构变化。4.选用Wistar大鼠24只,SD大鼠54只,新西兰大白兔12只。将54只SD大鼠随机分为5组:①为正常角膜组成的对照组,②为新鲜大鼠角膜同种异体穿透性移植组(penetrating keratoplasty,PKP),③为去CEC同种异体大鼠角膜+器官保存兔角膜后弹力层和内皮细胞复合体(DM+CEC)移植组,④为器官培养法保存大鼠角膜同种异体PKP组,⑤为去CEC同基因大鼠角膜+器官保存兔角膜DM+CEC移植组。兔角膜保存时间2~3周不等。②～④组制备Wistar→SD大鼠PKP模型,⑤组制备SD→SD大鼠PKP模型。术后观察各组植片的排斥情况和存活时间,酶联免疫吸附实验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)定量检测房水和血清中白细胞介素2(IL-2)、干扰素-gamma(IFN-γ)、白细胞介素4(IL-4)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)的表达,IHC法定性检测术后植片内CD25+ T细胞的表达,RT-PCR半定量检测植片内TNF-α、IFN-γ、IL-4和CD25 mRNA的表达,流式细胞术检测外周血中CD25和CD28亚群的表达。结果1.结果显示,ECM和ACF保存组角膜的ECD最高,细胞超微结构与正常角膜间的区别最小,MEM组的ECD值则最低,降幅最大,细胞器等超微结构破坏较严重。F-actin和ZO-1在各组兔和大鼠角膜内皮层都有表达。WB显示F-actin蛋白在ECM和ACF组表达水平最高,DMEM组次之,MEM组最低, RT-PCR法证实ZO-1 mRNA在各组的表达趋势与兔F-actin的结果一致。2.保存结束时含10%HES130/0.4的实验组植片较薄,但ECD值略低于对照组。对照组经葡聚糖T500脱水后,厚度和透明度与实验组差别变小,但ECD值明显降低。IHC和WB证实F-actin蛋白在两组内皮层都表达,实验组表达水平高于对照组。3.在有效浓度范围内,EGFP的荧光在器官保存的兔角膜内皮层强烈表达,随时间延长强度逐渐降低。5×107~5×108vp/μL AdV是载体滴度最为适宜的转染组,转染组中EGFP在角膜内皮细胞中的表达面积为67～84%,相对表达强度为34～75。过高浓度AdV(5×109vp/μL)导致ECD值显着下降。4.④和⑤组(即器官培养保存的同种异体全角膜和单纯异种异体内皮层移植组)的植片存活时间明显长于②和③手术组(即新鲜同种异体PKP组和联合器官培养保存的异种异体内皮层移植组),又以⑤组的存活期最长。术后各组血清和房水中IL-2、IFN-γ、IL-4和TNF-α的含量与排斥反应程度成正比,以②组最高,⑤组最低;各组植片内CD25的表达无显着差别;IFN-γ、TNF-α、IL-4和CD25mRNA在植片内的表达水平也与植片排斥程度成正比;外周血淋巴细胞中CD25亚群表达水平升高不明显,而CD28亚群的表达明显增强并与植片排斥程度成正比。结论1.无血清的ECM和ACF培养基在保持内皮细胞活力方面体现出了比常规含低浓度血清的MEM基础培养基更好的保护作用,在无血清器官培养保存角膜方面极具发展潜力。2. HES能有效避免器官培养过程中角膜过度水肿,且细胞毒性小可以成为器官保存液中的持续添加组分。它的应用也简化了保存程序,在一定程度上减轻了感染风险,有希望成为角膜器官培养保存法中的新型脱水剂。3.器官培养法保存后的角膜内皮细胞层可以同新鲜角膜一样被腺病毒载体高效率、特异性地转染成功并持续表达,转染效率只略低于新鲜角膜片。EGFP是监测这一转染过程的理想标记物。4. Th1/Th2平衡调节机制和CD28+T细胞亚群在器官培养法保存角膜移植后的免疫排斥反应中发挥了重要作用;动态检测外周血CD28和IFN-γ等Th1因子和Th2因子的表达有助于临床了解局部免疫反应进程并预测排斥反应的发生。器官培养法保存的角膜,无论是以全层还是单纯DM+CEC复合体形式进行移植,术后植片的存活时间都得以延长。促进Th2因子表达,抑制Th1类因子表达可能有益于降低排斥反应。同基因大鼠去CEC角膜联合器官保存兔异种CEC移植取得了最佳效果,为深层角膜病患者及时有效复明提供了新思路。
参考文献：
[1]. 猕猴复合麻醉剂的实验研究[D]. 肖建华. 东北农业大学. 2003
[2]. 静松灵复合制剂对犬麻醉效果的研究[D]. 魏丹. 东北农业大学. 2010
[3]. 人工神经移植物修复周围神经缺损与功能重建应用基础研究[D]. 胡文. 苏州大学. 2013
[4]. 小脑间位核调节免疫功能的作用途径研究[D]. 陆健花. 苏州大学. 2012
[5]. 器官培养法保存角膜的内皮细胞活性研究及在基因转染和移植排斥研究中的应用[D]. 魏捷. 第二军医大学. 2009