郭明[1]2004年在《喹诺酮药物与血清蛋白和DNA结合反应的研究方法及作用机制》文中研究指明血清白蛋白、脱氧核糖核酸(DNA)是生物体的基本物质,对一切生命现象都起着至关重要的作用。在分子水平上阐明这些生物大分子与小分子、离子,特别是靶向药物分子的相互作用,是当前生命科学、临床医学、药物化学及化学等众多领域的重要研究课题。本论文作为国家自然科学基金资助项目(No.:20173050)“生物大分子结合喹诺酮抗菌素的热力学与机制研究”的部分工作,其主要内容有以下几部分工作组成。1.用光谱技术开展了牛血清白蛋白(BSA)与几种喹诺酮药物的相互作用机制研究。根据位点结合模型,在前人工作及本实验室已有工作的基础上,提出了一个基于荧光猝灭法确定小分子与生物大分子作用结合参数的公式,并测定了所研究的蛋白质与药物之间的结合常数和结合位点。基于F?rster非辐射能量转移理论测定了药物与蛋白质分子之间的结合距离及能量转移效率,用同步荧光法考察了药物对蛋白质分子构象的影响,提出了药物-蛋白质复合物的结合模型。2.应用叁维荧光光谱技术研究了几种喹诺酮药物与牛血清白蛋白发生非共价结合反应后对其构象的影响,扩展了用普通荧光技术研究该体系的内容。在前人已有的工作基础上通过紫外光谱实验进一步研究金属离子对牛血清白蛋白构象变化的影响,不仅验证了金属离子对牛血清白蛋白构象的滞后效应,而且观察到了金属离子对牛血清白蛋白构象的驰豫效应,扩充了金属离子对牛血清白蛋白相互作用的内容。3.根据生物大分子与小分子作用的位点结合模型,用光谱技术研究了喹诺酮抗菌素与人血清白蛋白(HSA)的相互作用机制,确定了所研究的蛋白质与药物之间的结合参数、结合距离和能量转移效率,考察了药物对蛋白质分子构象的影响。在提出了药物-蛋白质复合物结合模型的基础上,进行了喹诺酮药物与HAS结合反应的定位区域的初步探讨。4.用微量热法测定了几种喹诺酮药物与牛血清白蛋白发生非共价
范成平[2]2005年在《喹诺酮药物与牛乳铁蛋白、人血清蛋白的相互作用机制研究》文中指出对于蛋白质的各类研究是当前生命科学、化学、药学及临床医学等众多领域的重要研究课题。其中,特别是对蛋白质分子与药物小分子之间的相互作用研究,不仅有助于从分子水平认识蛋白质与药物小分子的作用机理和规律,而且有助于认识药物药效作用的药理,为药物分子的设计和筛选及新药的开发提供有益的启发和重要的指导。本论文以两种蛋白质分子牛乳铁蛋白和人血清蛋白与四种喹诺酮类药物作为研究对象,根据生物大分子与药物小分子相互作用的位点模型,采用光谱技术结合微量热技术对牛乳铁蛋白(Bovine Lactoferrin,BLf)和人血清白蛋白(Human SerumAlbumin,HSA)与氧氟沙星(OFLX)、加替沙星(GTFX)、洛美沙星(LMF)、甲磺酸培氟沙星(PFLX)的相互作用机制进行了探讨和研究。 在光谱分析方面,利用药物分子对蛋白质分子的荧光具有猝灭性这个性质,对蛋白与药物相互作用的机理和作用强度进行了探讨。利用荧光光谱法测定了所研究蛋白质与药物之间的结合常数和结合位点数。另外还采用了同步荧光分析技术,对蛋白和药物结合时蛋白质分子构象的变化进行了研究。在研究蛋白质与药物分子的结合距离时则采用了紫外吸收光谱与荧光光谱相结合的方法,基于Forster非辐射能量转移理论测定了药物与蛋白质分子之间的结合距离及能量转移效率。光谱分析结果表明,上述喹诺酮类药物都可以与牛乳铁蛋白或人血清白蛋白之间形成亲和力较强的复合物。药物分子不仅可以和蛋白质分子结合,而且对蛋白质分子的构象都有一定的影响。此外,对比考察牛乳铁蛋白和人血清白蛋白对同一药物分子的相互作用结果发现,牛乳铁蛋白与药物分子间可形成接近两个结合位点,而人血清白蛋白与药物分子间仅有一个结合位点,这可能与牛乳铁
边平凤[3]2008年在《生物大分子与小分子相互作用研究》文中进行了进一步梳理蛋白质是细胞内重要的生物大分子、功能分子,它具有运载和储存功能,其生物功能与其特定结构密切相关,在所有的生命过程中起着关键的作用。血清白蛋白是血浆中含量最丰富的重要载体蛋白,药物进入血浆后,首先与血清白蛋白结合,然后再被运送到身体的各部位发挥药效。从分子水平上研究血清蛋白与药物小分子的相互作用,有助于了解药物的转运和代谢过程,可以为高活性药物小分子的设计与开发提供有价值的信息。在分子水平上阐明这些生物大分子与小分子、离子,特别是靶向药物分子的相互作用,是当前生命科学、临床医学、药物化学及化学等许多领域的热门研究课题。本论文是浙江省自然科学基金资助项目(No.202056)“抗癌药物与血清白蛋白、DNA的相互作用研究”和国家自然科学基金资助项目(No.20273061)“氨基酸在模拟体液中的热力学性质研究”的部分工作,其主要内容由以下几部分工作组成:1.综合应用多种方法研究了血清蛋白与喹诺酮类药物的结合反应及作用机制,研究方法文中得到了进一步的拓展。在研究方法上分别应用了紫外光谱法、荧光光谱法、同步荧光光谱法、叁维荧光光谱法、叁维偏振荧光光谱法、共振Rayleigh散射法及毛细管电泳法,从不同角度对所涉及体系进行研究,充分发挥了每种方法的优势,各方法相互补充、相互印证,较全面反应了喹诺酮药物与所研究靶标生物大分子的结合反应。2.利用紫外-可见吸收光谱、荧光猝灭光谱和同步荧光光谱等技术,研究了pH=7.36的Tris-HCl缓冲溶液中盐酸洛美沙星(LMFX)与人血清白蛋白(HSA)的相互作用,研究了不同温度下LMFX与HSA的猝灭情况,分别用Stern-Volmer方程和Scatchard法、Lineweaver-Burk双倒数方程、双对数方程等模型进行处理,并利用热力学公式推导了两者之间的相互作用力。研究表明,在实验浓度范围内和300、310K温度下,LMFX与HSA可相互作用形成复合物;荧光猝灭作用符合静态猝灭作用特征;并得到了相互作用的相关参数,结合常数K_A为10~4～10~5L·mol~(-1),说明HSA对该药物有中等强度的亲和性;结合位点数大于1,因而LMFX可被人血清白蛋白贮存和运输。其中该结合反应用双对数方程处理,线性吻合更好,得到ΔG＜0,ΔH＜0,ΔS＜0,故盐酸洛美沙星与HSA之间的作用主要是氢键或者范德华力作用,且反应能自发进行。此外,LMFX会导致人血清蛋白色氨酸残基附近微环境极性增加,疏水性略有降低,使得人血清白蛋白的肽链伸展。根据F(o|¨)ster偶极-偶极非辐射能量转移原理,计算得到HSA中色氨酸残基与已结合的盐酸洛美沙星分子间的距离为2.85nm,小于7nm,符合能量转移理论,说明在盐酸洛美沙星与HSA之间发生了能量转移。3.用荧光光谱法、共振Raylei曲散射研究了金属离子对HAS-LMFX间结合反应的影响,Fe~(3+)会改变LMFX药物与HSA结合体的构象,促使共振Rayleigh散射强度明显增大。结果表明,Fe~(3+)能和LMFX与HSA结合,引起荧光猝灭,共振瑞利散射强度大大增强,其荧光猝灭程度(△F)以及RRS增强的程度(△I_(RRS))均与Fe~(3+)的浓度成正比,反应具有高灵敏度。共振Rayleigh散射技术是二十世纪九十年代发展起来的一种分析技术,由于其在研究生色团与生物大分子的聚集作用以及具有相反电荷的离子之间的离子缔合作用时显示出高的灵敏度和选择性,特别是对于生物大分子的一些非键合作用特别敏感,而成为生物大分子的测定和表征的一种非常有用的技术。4.利用叁维荧光、叁维偏振荧光光谱技术研究了人血清白蛋白(HSA)与盐酸洛美沙星(LMFX)、甲磺酸培氟沙星(PFLX)、司帕沙星(SPFX)和加替沙星(GTFX)四种喹诺酮药物非共价结合作用前后自身荧光强度、偏振度P以及各向异性值r的变化,及对其构象的影响。由相应的荧光指纹图谱得到的荧光峰位置、荧光强度、Stokes位移等指纹信息,说明HSA的色氨酸残基处于蛋白质内部的疏水区域,所处周围微区环境性质由于药物分子的插入引起较大的变化,极性明显增强,从而导致HSA构象的改变,引起其叁维荧光光谱发生较大的变化,荧光峰红移,Stokes位移增大,荧光强度降低;同时,由相互作用后的荧光偏振度P及各向异性r的增大,定量地证明HSA与喹诺酮药物之间确实发生了相互结合反应。5.利用荧光猝灭法和动态光散射法测定尿素-水混合溶剂中牛血清白蛋白(BSA)与荧光素的结合距离和BSA的流体动力学半径,并通过分析BSA和荧光素在BSA-尿素-水和荧光素-尿素-水叁元体系以及BSA-荧光素-尿素-水四元体系中荧光光谱的变化,探讨尿素与蛋白质分子在水溶液中相互作用的机理及其对蛋白质构象的影响。结果显示,BSA的3个结构域在尿素-水混合溶剂中具有不同的稳定性,其中结构域Ⅲ在尿素-水混合溶剂中是不稳定的,而结构域Ⅰ和结构域Ⅱ分别在尿素浓度大于3.0和4.0 mol·L~(-1)的混合溶剂中发生去折迭。试验发现,BSA结构域Ⅱ在低于去折迭浓度的尿素-水混合溶剂中形成更为紧密的构象,这一现象可以归因于尿素与BSA结合引起的“蛋白质粘稠效应”。6.利用Anton Paar DMA55精密数字密度计测定了288.15,298.15和308.15 K甘氨酸、甘氨酰甘氨酸、甘氨酰甘氨酰甘氨酸在蔗糖-水混合溶剂中的密度,计算了它们的表观摩尔体积V_Φ和极限偏摩尔体积V_Φ~O,得到了其由纯水溶剂转移至混合溶剂中的迁移偏摩尔体积△_(trs)V_Φ~O和理论水化数N_h。根据共球交盖模型,讨论了迁移偏摩尔体积和水化数的变化规律。结果表明,这些模型化合物带电中心与蔗糖之间的结构相互作用对其迁移体积有正贡献,且占主导地位。模型化合物的迁移偏摩尔体积为正值,且随着蔗糖浓度的增大而增大;理论水化数随温度升高、蔗糖浓度的增大而减小;温度升高,极限偏摩尔体积增大,迁移偏摩尔体积变化很小。
谭非[4]2005年在《喹诺酮药物与生物大分子相互作用的研究》文中研究说明蛋白质、核酸等基本的生命物质,对一切生命现象都起着至关重要的作用。在分子水平上研究这些生物大分子与小分子的作用以及金属离子存在时对这种作用的影响,是当前生命科学、药物化学以及化学等众多领域的重要研究课题。其主要内容有以下几部分组成: 甲磺酸培氟沙星(PFLX)、加替沙星(GTFX)、氟罗沙星(FRLX)是广谱的氟喹诺酮药物,能够抵抗各种微生物,包括革兰氏阳性和革兰氏阴性菌第的侵扰。第一部分用荧光光谱法考察了PFLX、GTFX、FRLX等与金属离子铜和铁的相互作用,分别确定了它们的结合常数和配位关系;以光谱技术和微量热技术相结合的方法研究水溶液中甲磺酸培氟沙星、加替沙星分子、氟罗沙星及金属离子存在时与人血清白蛋白之间结合作用的机制,用荧光猝灭法测得各反应的结合常数和结合位点数。PFLX、GTFX、FRLX对HSA的猝灭属于静态猝灭。依据Forster非辐射能量转移机制,得到PFLX、GTFX、FRLX与人血清白蛋白间的结合距离,用同步荧光技术考察FRLX、GTFX、FRLX对人血清白蛋白构象的影响。微量热法测得PFLX、GTFX、FRLX与人血清白蛋白反应的ΔH≈0,ΔS>0,PFLX、GTFX、FRLX分子在金属离子存在时与人血清白蛋白反应的ΔH<0并且AS>0表明它们的作用主要为静电力,由于焓熵互补的作用,两反应的自由能没有发生大的变化。考察了PFLX与人血清白蛋白的位点结合域,并结合计算方法对此进行了解释。 第二部分考察了喹诺酮药物与DNA的相互作用情况。用光谱法和电化学方法研究了PFLX、GTFX、FRLX与小牛胸腺DNA的作用。尽管吸收光谱显示有减色效应发生,但没有明显的红移现象。DNA对PFLX、GTFX、FRLX的荧光猝灭为静态猝灭,进而确定了它们的结合常数,荧光法的结果还表明单链DNA的猝灭效应大于双链DNA,这意味着喹诺酮药物与DNA的作用不属于嵌入结合。随着钠离子浓度的增大,喹诺酮药物与DNA的结合常数也逐渐减小,说明其间存在静电作用。考察了铜离子及镁离子和铁离子对反应的影响,发现金属离子对喹诺酮药物与DNA之间起到了介导作用。并在固体电极上用循环伏安法对存在和不存在DNA时,甲磺酸培氟沙星等喹诺酮药物的电化学特性进行了考察,发现它们是扩散控制,以电化学扩散控制理论为基础,考察了喹诺酮药物与DNA的作用。 第叁部分用电化学方法的吸附理论研究了没有荧光光谱的喹诺酮药物司帕
马国正[5]2006年在《喹诺酮药物与生物大分子相互作用的计算化学研究》文中研究指明本论文主要围绕喹诺酮药物与生物大分子如蛋白质和核酸的相互作用来展开研究。论文主要包括叁个部分:第一部分,药物与生物大分子相互作用中的一种常见作用力-阳离子-π作用的量子化学理论研究;第二部分,喹诺酮药物与人血清白蛋白和DNA的相互作用、结合机理研究;第叁部分,芳香二脒化合物与DNA小沟结合的分子动力学模拟及热力学自由能计算研究。现概述如下:对生物体系中的阳离子-π作用的理论研究,我们以锂离子为探针,对一系列简单的芳香杂环化合物与锂离子形成的复合物进行了量子化学计算。通过复合物中锂离子距芳环中心的距离、NPA电荷转移数、结合能以及静电势等信息,探讨了阳离子-π作用的特点和本质。并且,采用结合能和芳环体系表面静电势的计算解释了阳离子-π作用与阳离子-杂原子作用的竞争。为了进一步探讨阳离子-π作用结合能和静电势的关系,采用MP2/6-311+G**,B3LYP/6-31G**以及HF/6-31G*方法计算了芳环单体中心上方172 pm处一个点的静电势并对复合物未经校正的结合能作图,发现有很好的线性相关,相关系数R2>0.9412,说明阳离子-π作用和芳环体系的表面静电势密切相关。同时表明,利用HF/6-31G*方法提供的静电势对结合能的线性相关模型,提供了一种定量预测较大和较复杂体系中阳离子-π作用的结合能大小的方法。对喹诺酮药物与蛋白质相互作用的研究,采用以甲磺酸培氟沙星与人血清白蛋白相互作用为体系进行研究。本论文以实验结合计算的方法研究了该体系,荧光法测得甲磺酸培氟沙星与人血清白蛋白形成一种类型的复合物,结合常数为1.7×105 L·mol-1,有1.05个平均结合位点;微量热法测得该药物-蛋白结合过程中焓变为1.03 kJ·mol-1,熵变为101.28 J·K-1·mol-1,反应为熵驱动。用分子对接的方法预测了甲磺酸培氟沙星与人血清白蛋白的结合模式,计算表明,甲磺酸培氟沙星可结合在人血清白蛋白的两个药物结合位点,疏水作用即熵效应在药物与蛋白的结合中起重要作用,预测结合自由能和实验值基本一致。通过DOCK分子模建,具体指出了两个药物结合位点起主要作用的氨基酸残基。
吴远远[6]2013年在《毛细管电泳法用于药材有效成分和体液内药物的分析研究》文中认为药物分析研究的主要内容包括中药有效成分分析、体内药物活性成分监测、手性药物拆分、药物与生物大分子的相互作用等。毛细管电泳技术是正在迅速发展的一种高效液相分离分析技术，具有分辨率高、分析速度快、分析成本低、应用范围广等优点，在药物分析中得到了广泛应用。本文基于高效毛细管电泳技术，采取毛细管区带电泳（CZE）、非水毛细管电泳(NACE)、亲和毛细管电泳(ACE)等叁种分离模式，以气相色谱-质谱法（GC-MS）、化学发光法（CL）、叁维荧光光谱作为补充方法，重点对药物分析的中药有效成分分析、体内药物活性成分分析、药物与人血清白蛋白相互作用等方面开展应用研究，建立了多种药物的简便、灵敏的分离检测方法，将ACE用于抗癌药物与人血清白蛋白的相互作用机理研究，获得满意结果。第一章绪论部分简要阐述了毛细管电泳的基本原理，对毛细管电泳的不同分离模式及其在药物分析中的应用进行了综述。第二章对中药材决明子的有效成分蒽醌和脂肪酸类化合物进行分析研究。采用非水毛细管电泳对决明子中的蒽醌化合物进行分离，研究了不同缓冲液、非水介质和添加剂对分离的影响，对多种蒽醌化合物实现了有效分离；通过电泳条件优化，提出了NACE测定大黄素和橙黄决明素的新方法，两种组分的标准曲线线性范围分别为2.04—204μg/mL和3.32--332μg/mL，检出限分别为0.61和1.0μg/mL。另外，采用超声辅助-石油醚提取决明子中脂肪酸类成分，并以GC-MS法进行了分析测定。研究表明，以石油醚为提取剂，不饱和脂肪酸的提取率高于传统回流方法。提取物中共检测出7种脂肪酸，其中亚油酸含量丰富，其质量分数为44.45%。第叁章采用毛细管电泳法对人体液中的头孢类抗生素及其配伍药物进行分析研究。首先，采用毛细管区带电泳法同时分离测定了人血清和尿液液中的头孢孟多和丙磺舒。在优化条件下，被测药物在6min内实现有效分离。以水杨酸为内标物，头孢孟多和丙磺舒的标准曲线分别在10～200和5～110mg/L范围内具有良好线性关系（r＞0.999）。其次，采用毛细管区带电泳分离模式，建立了一种快速、灵敏的同时测定头孢哌酮、舒巴坦和丙磺舒的新方法。实验结果表明叁种药物的标准曲线均具有良好线性，检出限(S/N=3)分别为3.2、15和1.6μg/mL。第四章采用毛细管电泳-电化学发光法和流动注射化学发光法对人体液和药物制剂中氟喹诺酮药物进行分析研究。将毛细管电泳分离技术与电化学发光法检测方法结合，建立了毛细管电泳-电化学发光法同时测定人尿液中氟罗沙星和脯氨酸，两种药物的检出限分别为0.06和0.02μg/mL，线性范围分别为0.4～80和0.1～60μg/mL。本文还以流动注射化学发光法对喹诺酮类药物依诺沙星的在不同发光体系中的独特作用进行了研究，建立了高灵敏的化学发光测定依诺沙星的新方法，检出限达到10-10g/mL数量级，灵敏度远高于CE-ECL法（10-8g/mL）和CE法（10-6g/mL）。第五章采用亲和毛细管电泳法对抗癌药物5-氟尿嘧啶与人血清白蛋白的相互作用进行研究，对FU与HSA在接近生理条件下的缔合作用进行分析，结果表明FU与HSA亲和力较低，结合常数为9.19×104M-1。实验测得缔合过程的焓变（H）和熵变（S）均为正值，说明FU与HSA缔合是一个吸热的熵驱动过程，疏水作用在缔合过程中发挥着主要作用。法华林和酮洛芬对FU的竞争性置换试验表明，FU与蛋白质HSA的结合部位是位点Ⅰ。叁维荧光光谱研究证实5-氟尿嘧啶在与血清蛋白的结合过程中能够改变血清蛋白的构象。第六章总结了本文研究工作主要内容、成果及创新点，对毛细管电泳及其在药物分析中的应用研究发展趋势进行了展望。
刘阳[7]2007年在《心肌肌球蛋白的提纯及与柔红霉素作用的荧光研究》文中认为柔红霉素是一种重要的蒽环类抗肿瘤抗生素,能与DNA结合,抑制核酸合成,表现出抗癌活性。但长期使用有心脏毒性,确切的发病机制尚无统一认识。不过,有研究表明,柔红霉素破坏心肌收缩蛋白肌球蛋白-肌动蛋白的横桥循环系统,造成心脏损害。心肌肌球蛋白是心肌细胞的主要结构蛋白和收缩蛋白,其ATP酶活性决定了心肌收缩能力。这是本文研究柔红霉素与心肌肌球蛋白作用的选题依据。此外,柔红霉素存在给电子体,可与蛋白质形成配合物。柔红霉素和蛋白质的研究主要集中于与牛血清白蛋白和人血清白蛋白的相互作用,鲜见与心肌肌球蛋白作用的报道。从心肌肌球蛋白荧光光谱和ATP酶活力的角度出发,探讨柔红霉素与肌球蛋白的结合机理,了解柔红霉素引起心肌收缩功能变化、产生心肌损害的原因,为合理解释柔红霉素引起心脏毒性的分子机制提供依据,是本研究的目的和意义。论文介绍了几种药物与蛋白质作用的近代研究方法,其中,灵敏简便的荧光光谱法是重要的手段。总结了心肌肌球蛋白提取的一般方法和纯化效果,并对这些方法加以改进,从猪心肌组织中提取纯化了肌球蛋白。考察了柔红霉素对肌球蛋白ATP酶活力的影响,讨论了柔红霉素与心肌肌球蛋白作用的荧光猝灭行为。研究内容如下:1.心肌肌球蛋白的分离纯化及其ATP酶活力测定用硫酸铵沉淀法,即用饱和度36%～41%的硫酸铵,从猪左心室中提取肌球蛋白。测定了各分级段肌球蛋白的含量,根据酶反应ATP分解释放的无机磷含量,绘制了酶动力学曲线,检测了Ca~(2+)激活肌球蛋白ATP酶活性。求得肌球蛋白活力收得率和纯化倍数分别为39.4%和4.7。用不连续的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和反相高效液相色谱表达了肌球蛋白的纯化程度。该结果与传统方法相比,有操作简单、耗时少,得率高并保持了酶活的优点。2.柔红霉素对肌球蛋白ATP酶活力的作用纯化的另一重要部分是测定目标蛋白的活力,肌球蛋白Ca~(2+)激活ATPase酶是最有用的测活方式之一。因此,研究了柔红霉素对肌球蛋白Ca~(2+)激活ATPase活力的作用。实验结果表明,肌球蛋白酶活性的损失随柔红霉素浓度和作用时间的增加而增大,直至影响肌球蛋白的生理功能。考察了Mg~(2+)浓度对肌球蛋白和柔红霉素-肌球蛋白两种体系Ca~(2+)-ATP酶活力的影响。研究发现,Mg~(2+)浓度相同时,柔红霉素-肌球蛋白体系酶活力小于肌球蛋白体系;低浓度的Mg~(2+)即可抑制柔红霉素造成的肌球蛋白ATP酶活力下降。研究了pH值对柔红霉素-肌球蛋白体系ATP酶活力的影响。结果表明,pH值相同时,体系的Mg~(2+)-ATP酶活力大于Ca~(2+)-ATP酶活力;弱酸环境下,Ca~(2+)-ATP酶活性较高,是导致癌症患者心力衰竭的原因之一。3.柔红霉素对心肌肌球蛋白的荧光猝灭行为研究了20℃,pH7.4的Tris-HCl缓冲液中,柔红霉素对肌球蛋白的荧光猝灭作用。结果表明,肌球蛋白的Stern-Volmer曲线呈非线性,证实柔红霉素与肌球蛋白的作用不是动态猝灭而是静态猝灭。求得猝灭常数1.337×10~5 L·mol~(-1),结合常数2.649×10~2 L·mol~(-1)。二者的作用是自由能降低的分子自发过程。考察了pH值、缓冲体系和温度对柔红霉素与肌球蛋白荧光猝灭的影响。不同pH值对猝灭常数有较大影响,并按照pH6.5～7.4(中性)、pH8.0～9.0(弱碱)、pH4.0～6.0(弱酸)顺序递增。此外,pH小于5.5时,结合常数比其它pH时大。Tris-HCl缓冲体系中,柔红霉素对肌球蛋白荧光强度的猝灭程度比在Citric acid-Na_2HPO_4和KH_2PO_4-K_2HPO_4缓冲体系中的强;并在pH6.5～7.4时,猝灭常数保持不变。15℃～37℃范围内,求得体系的荧光猝灭常数,并以此推断肌球蛋白的荧光猝灭类型。同时发现,生理温度下,柔红霉素与肌球蛋白的作用增强,荧光猝灭程度比其它温度时大。4.金属离子对柔红霉素与肌球蛋白荧光体系的作用Ca~(2+)、Mg~(2+)不仅对肌球蛋白的荧光有猝灭作用,并能增强柔红霉素对肌球蛋白的荧光猝灭。求出了不同Ca~(2+)、Mg~(2+)浓度下,体系的猝灭常数和结合常数;解释了异常离子浓度引起柔红霉素心脏毒性的原因。Zn~(2+)对肌球蛋白的猝灭机理比Cu~(2+)复杂,同时包含了动态和静态两种猝灭方式。Zn~(2+)、Cu~(2+)浓度比为10︰1时,金属离子与柔红霉素竞争结合肌球蛋白,降低了柔红霉素对肌球蛋白的猝灭作用,抑制其心脏毒性。Zn~(2+)、Cu~(2+)浓度比为100︰1时,两者的作用增强,体系猝灭常数最大,影响肌球蛋白的正常生理功能。这一结果与癌症患者体内Zn~(2+)、Cu~(2+)比值较高的报道相吻合。不同浓度的Se~(4+)均使肌球蛋白的荧光强度降低,且高浓度时的△F比低浓度时小。而对柔红霉素-肌球蛋白体系,随Se4+浓度的增大,荧光强度表现出猝灭、增敏和无变化叁种趋势。Se~(4+)浓度1.2×10~(-5) mol·L~(-1)时,增敏作用最强,且△F与柔红霉素浓度线性关系良好,可建立一种测定柔红霉素浓度的新荧光方法。Se~(4+)浓度超过2.0×10~(-5) mol·L~(-1)时,体系的荧光强度不再随DNR浓度的增加而变化,说明一定浓度的Se4+能减轻DNR毒副作用对心脏的损害。
费燕[8]2008年在《创新药物西那沙星与生物大分子的相互作用机制研究》文中提出蛋白质、脱氧核糖核酸(DNA)是组成生命重要的生物大分子,具有各自的生物功能,对一切生命现象都起着至关重要的作用。在分子水平上阐明这些生物大分子与小分子、离子,特别是药物分子的相互作用,是当前生命科学、临床医学、药学及化学等众多领域的重要研究课题,引起了许多学者的关注。建立药物-生物大分子结合的体外模型,了解结合的模式、程度、结合部位、结合力等问题,不仅有助于在分子层次的水平上认识生物大分子与小分子的作用机理和规律,了解大分子结构与功能的关系,为生命科学研究提供有用的信息和数据,而且有助于认识药物药效作用的药理、毒物毒性作用的毒理之微观机制,为药物分子的设计与筛选及新药的开发提供有益的启发与重要指导,其中以蛋白质为作用靶和以核酸为作用靶的药物设计正是目前药物化学和生命科学的前沿研究课题。此外,这方面研究的许多成果还应用于临床医学检验和生命科学中的生物大分子分离检测。光谱法尤其是荧光光谱法是研究生物大分子与小分子、离子相互作用的重要手段。荧光测试中的发射峰特征、能量转移(即发生了荧光的加强或猝灭)等指标可以对分子中荧光生色基团的结构及其所处的微环境提供有用的信息。在生物大分子与有机小分子作用机理的研究中可以引入外源性荧光作为指示探针,也可利用大分子自身的内源性荧光作为探针(蛋白质中色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸的存在,使其具有内源荧光)。紫外-可见光谱法也是研究药物分子与生物分子相互作用机理常用的技术,因为有些药物分子与生物大分子结合后,它们的吸收光谱会有一定的改变,出现吸收峰位移或谱峰宽度变化。蛋白质中的某些芳香氨基酸如色氨酸、苯丙氨酸等在紫外区存在吸收峰,当所处的环境发生变化时,其紫外吸收光谱随之发生变化:吸收峰红移或者蓝移,吸光度及谱带亦有变化。DNA分子由于含有碱基生色团的双螺旋结构,在260nm附近处有强吸收,可根据相互作用前后DNA或其靶向分子的吸收谱带的变化对二者相互作用模式进行判断。因此,利用光谱方法通过蛋白质和DNA分子结合药物分子后结构上的变化来研究结合机理,是非常有效、简便且应用最广泛的方法。喹诺酮类药物以其高效、广谱、服用方便等优点在临床上发挥了越来越重要的作用。但是,因为仍存在一系列缺点,有关其药效作用机理、毒副作用等方面还需不断深入研究,开发高活性、低副作用的新型喹诺酮类药物也一直是研究热点。西那沙星(sinafloxacin)是我国自主研发的第四代喹诺酮类抗感染新药,其作用机理是通过抑制细菌DNA促旋酶和Ⅳ的活性,从而抑制细菌DNA的合成,导致细菌死亡。母核的7位具有氮杂螺环结构,扩大了抗菌谱、增强了抗菌活性,尤其对盐酸环丙沙星耐药金葡球菌、表葡球菌、大肠埃希菌等抗菌活力强,且细胞毒性显着低于同类产品中的加替沙星和左氧氟沙星,8位上的甲氧基能提高其光稳定性,减少光解产物带来的不良反应,为临床抗感染治疗提供了新的选择。为了探讨西那沙星的生物体内作用机制,本论文研究了西那沙星与生物大分子的相互作用,主要包括以下两大部分:第一部分以牛血清白蛋白(BSA)为研究对象,利用西那沙星对蛋白质分子的荧光具有猝灭作用这个特征,用荧光光谱和紫外光谱相结合的方法对BSA与西那沙星相互作用的机理进行了探讨。西那沙星能使BSA的内源荧光产生规律性的猝灭,根据Stern-Volmer方程,西那沙星对BSA的猝灭速率常数Kq远大于各类猝灭剂对于生物大分子的最大扩散碰撞猝灭速率常数2.0×10~(10)L·mol·s~(-1),且随温度升高,Stern-Volmer猝灭常数K_(sv)减小;紫外光谱亦显示BSA吸收峰发生了明显的红移(△λ=8nm),因此其荧光猝灭机制属于因复合物的形成而引起的静态猝灭。利用荧光猝灭Lineweaver-Burk双倒数方程计算了不同温度与pH条件下西那沙星与BSA之间的结合常数K_D,基于F(?)rster非辐射能量转移理论分别将一定浓度BSA的荧光光谱数据和与BSA等物质的量的西那沙星的紫外吸收光谱数据输入Matlab软件,测定计算了两者之间的结合距离r和能量转移效率E。根据热力学参数由于△G＜0,结合反应可以自发进行,△S均为正值、△H均为负值确定了西那沙星与牛血清白蛋白之间的主要作用力类型为静电作用力,采用同步荧光、叁维荧光技术考察了西那沙星对BSA构象的影响,结果显示色氨酸残基的最大发射波长略有蓝移,表明其所处环境的疏水性增加,从而揭示药物分子不仅可以和蛋白质分子结合,而且对蛋白质分子的构象都有一定的影响,使BSA形成一种新的无序结构。生物体内含有多种金属元素,它们不仅参与许多重要的生命过程,而且能与喹诺酮药物发生配位作用形成配合物,也可与蛋白质等生物大分子发生结合反应,成为相互作用研究的一个重要方面。为此,本文还进一步考察了金属离子(Cu~(2+),Fe~(3+),Zn~(2+),Mg~(2+))对西那沙星-BSA间结合的影响。研究表明,在金属离子存在的情况下,减小了药物与蛋白质间的结合常数,缩短了药物在血浆中的潴留时间,增大了药物的最大作用强度,这对希望短期提高药效的临床治疗有一定的作用。第二部分以小牛胸腺DNA为研究对象,采用光谱检测技术,结合离子强度考察、单双链DNA实验、偏振实验、KI猝灭实验、DNA热变性实验、粘度法等多种方法研究了西那沙星与DNA之间的相互作用模式。实验结果表明,加入DNA后西那沙星紫外吸收峰位置并未出现明显红移,Stern-Volmer方程计算荧光猝灭常数K_(sv)随温度增加而降低;随着以Na~+表征的离子强度的增加,DNA对西那沙星的荧光猝灭程度变化甚小,说明西那沙星与DNA之间不存在非特异性的静电作用;单链DNA(ssDNA)对西那沙星的猝灭作用略大于双链DNA(dsDNA);不同DNA浓度时,西那沙星的荧光偏振值没有明显改变;KI猝灭数据显示西那沙星并未受到DNA碱基对的有效保护,DNA热变性温度(T_m)、粘度也没有显着升高;以上结果可以判断西那沙星与DNA间的结合作用为沟槽结合,其荧光猝灭亦是由形成复合物的静态猝灭过程所致。根据荧光强度变化求得结合常数与结合位点数。同时考察了镁离子对相互作用的影响,镁离子和DNA均能使西那沙星的荧光强度出现降低现象,且镁离子的存在能使DNA对喹诺酮药物的猝灭作用显着增强。推测该叁元体系形成了稳定的叁元复合物,镁离子起了桥梁的作用。
吕达[9]2017年在《典型全氟类化合物的生态毒性效应研究》文中研究表明全氟化合物(Perfluoroalkyl Substances,PFASs)的全球性污染,带来的生态系统稳定维护和人类健康安全保障问题使其成为生态环境领域的持续的研究热点;评价其健康风险,研究其毒性效应以及探索能够有效监测、管控、减除PFASs污染的方法等研究内容,已经成为研究焦点。本研究通过选取典型的全氟化合物,在细胞水平,蛋白质水平及基因水平,利用生态毒理学、细胞生物学、生物化学与分子生物学等学科交叉手段,进行全氟化合物毒性效应的综合分析研究;并模拟生理条件下,开展全氟化合物毒性作用分子机制的探索研究。主要内容为以下七个部分:1、紫外分光光度法测定了全氟辛酸(Pentadecafluorooctanoic Acid,PFOA),全氟辛基磺酸钾盐(Perfluorooctane Sulfonate-k,PFOS-k),全氟-1-辛烷磺酰氟(Perfluoro-1-Octanesulfonyl Fluoride,POSF)叁种典型全氟类化合物与生物活性大分子人血清白蛋白(Human Serum Albumin,HSA)/小牛胸腺DNA(Calf Thymus DNA,CtDNA)的结合常数,表明了PFASs与HSA/CtDNA之间存在结合强度适中的结合作用。2、荧光光谱结果获知,PFOA与HSA之间生成静态复合物,造成HSA发生荧光猝灭效应;热力学参数计算表明,HSA与PFOA间的相互作用力以疏水作用力为主;同步荧光光谱表明,PFOA可以引起HSA的构象发生改变;荧光偏振光谱数据证明PFOA与HSA两者间确实存在强度适中的结合作用,生成非共价结合物。3、运用毛细管电泳技术,采用淌度法及简化的Hummel-Dreyer法、区段-区段动力学法等方法研究了PFOA/PFOS-k/POSF与HSA的相互作用。应用Scatchard方程、Klotz方程、非线性拟合方程、结合速率相比法测定了PFOA/PFOS-k/POSF与HSA相互作用体系的结合常数K和结合位点n。不同的实验方法及理论方程都能够反映体系的作用效果:结合常数K数量级在10~3-10~4之间。结合位点数n平均皆为1,结合作用只有单一类型的结合位点。有效构建PFOA/PFOS-k/POSF与HSA结合作用分析模型。4、通过计算机模拟技术对PFOA/PFOS-k/POSF-HSA体系进行分子对接。分子模拟从理论上揭示PFOA/PFOS-k/POSF在HSA上的结合部位及体系内作用力类型,从分子水平上直观清楚的呈现体系内相互作用机制。结果与光谱学和毛细管电泳实验结果一致:体系内存在结合强度适中的相互作用,作用力主要有疏水作用力承担。5、利用PFOA/PFOS-k/POSF对SMMC-7721肝癌细胞作用后进行形态学观察可发现,PFASs对细胞具有显着毒性效应。应用MTT比色分析法对PFASs的毒性作用进行定量分析,结果表明作用具有一定的剂量效应特征。细胞经PFOA处理后,通过流式细胞术检验,实验表明随PFOA浓度增高,凋亡细胞数目相应增加,结果与形态学及MTT法实验结果一致:PFASs在细胞水平上,具有显着的毒性作用,且毒性作用具有一定的剂量效应特点。6、利用蛋白免疫印迹技术(Western blot),研究全氟化合物在细胞活性蛋白水平上的毒性表现。SMMC-7721细胞经不同浓度的PFOA/POSF处理后,细胞内的表达量出现明显的异常:Bax蛋白表达量显着上升,同时Bcl-2蛋白表达量明显下降,表明全氟化合物可能干扰细胞的正常蛋白表达功能。7、基因水平上,对全氟化合物的毒性表现进行深入探究。SMMC-7721细胞经PFOA处理后,利用实时荧光定量法发现,Bax mRNA与Bcl-2 mRNA表达水平出现明显差异:Bax mRNA表达上调,Bcl-2 mRNA表达下调。通过细胞内两种关键的基因Bcl-2、Bax的表达水平的变化情况,反映出全氟类化合物可能具有直接影响细胞的正常的基因表达的能力。
吴光红[10]2007年在《恩诺沙星在中华绒螯蟹中的代谢动力学及其休药期研究》文中提出江苏的中华绒螯蟹已发展成为超过100亿元人民币的大产业,名牌大闸蟹畅销国内外。但是,与此同时,中华绒螯蟹的质量安全也经受着越来越严重的疾病暴发、兽药残留、种质退化的困扰。本工作侧重研究了中华绒螯蟹养殖过程中使用恩诺沙星的使用问题,旨在对该药品在中华绒螯蟹中的应用和推广提供科学的依据。研究主要分为如下几个部分:(1)中华绒螯蟹体内恩诺沙星等喹诺酮药物残留检测方法的研究;(2)恩诺沙星在中华绒螯蟹体内的药物代谢动力学研究;(3)水温对恩诺沙星在中华绒螯蟹体内药物代谢动力学的影响;(4)恩诺沙星与中华绒螯蟹血浆蛋白结合率的研究;(5)恩诺沙星在中华绒螯蟹体内使用修药期(withdrawal time)的研究。具体如下:1、建立了中华绒螯蟹体内恩诺沙星、环丙沙星和诺氟沙星残留量同时检测的反相高效液相色谱法(RP-HPLC)方法。考察了叁种喹诺酮类药物残留的分离与流动相组成、pH值及乙腈含量的关系,优化了色谱条件。中华绒螯蟹肝脏成分复杂,脂肪类化合物含量高,色素等干扰物质多,极易干扰目标物的检测。通过改进前处理过程,采用振荡萃取-浓缩-高速离心萃取的前处理过程,有效地减少了干扰物质对检测结果的影响。研究表明,该方法线性关系和重复性良好,样品中叁种喹诺酮类药物残留的回收率在73%～86%之间,相对标准偏差2.01%～4.29%(n=5),最低检测限为10μg·kg~(-1)。用该方法对肌肉注射给药后72小时内中华绒螯蟹肝脏组织进行检测,恩诺沙星及其主要代谢物环丙沙星都可以检测到,为弄清楚恩诺沙星在中华绒螯蟹体内的分布、代谢的研究提供了检测方法。2、在17±2℃条件下,研究了中华绒螯蟹肌肉注射每只蟹0.1 mL恩诺沙星(恩诺沙星原粉用双蒸水配成6.25 mg·mL~(-1))的药代动力学。中华绒螯蟹肌肉注射恩诺沙星后,血液中药物浓度很快达到峰值,并迅速向组织中分布,血药经时过程符合一级吸收二室开放代谢模型,主要药动学参数为:T_(1/2α)5.29h,T_(1/2β)92.42h,K_(21)0.078h~(-1),K_(12)0.048 h~(-1),K_(10)0.012h~(-1),AUC304.80μg·ml~(-1)h~(-1),CLs0.016 L·kg~(-1)h~(-1)。药物在血液中的药时曲线方程为C_(blood)=6.68e~(-0.49t)+3.38e~(-0.013t)。在中华绒螯蟹的血液及肌肉、肝胰腺、鳃组织中均能检测到恩诺沙星的代谢物环丙沙星残留,最低检测限为10μg·kg~(-1)。3、研究在17、23和29℃水温下,恩诺沙星(ENR)在中华绒螯蟹血淋巴、肌肉和肝脏组织中的代谢规律和组织分布的影响。以3.0 mg·kg~(-1)剂量单次肌肉注射给药,于给药后1、10 min及0.5、1、2、8、16、24、48、72和168 h取各组织样品,药物含量由高效液相色谱法同时测定。研究结果表明,在3个温度下,血淋巴和肌肉组织中ENR含量瞬时达到峰值,而肝脏中ENR含量则随给药时间,先上升后下降,各组织含量从大到小依次为:血淋巴、肝脏、肌肉。水温23和29℃下,CIP含量及CIP与两种药物含量之比从大到小依次为:肝脏、血淋巴、肌肉;各组织中CIP含量及CIP与两种药物含量之比与水温呈正相关。应用药代动力学计算软件3P97分析结果表明:肝脏组织中ENR的代谢规律符合二室开放模型,在给定3个温度下,吸收半衰期(分别为:1.81、0.97和0.14 h)、消除半衰期(分别为:240.27、60.57和37.59 h)、药时曲线下总面积(分别为:2148.7、324.2和264.5μg·mL~(-1)·h~(-1))与温度呈负相关,而总消除率与温度呈正相关,分别是0.0014、0.0093和0.011 L·kg~(-1)·h~(-1)。4、研究了恩诺沙星与中华绒螯蟹血浆的蛋白结合率。实验结果显示:恩诺沙星与牛血清白蛋白(1.0mg·mL~(-1))的蛋白结合率在13.0%～29.0%之间。实验测定的中华绒螯蟹血浆蛋白浓度为64.0±0.3mg·mL~(-1),蛋白分子量主要集中在66.2KDa～97.1KDa之间,恩诺沙星与中华绒螯蟹血浆蛋白的结合率在50.0～78.8%之间。实验结果认为,恩诺沙星与中华绒螯蟹血浆50%左右的蛋白结合率能充分保证其药效的发挥,可以在中华绒螯蟹养殖过程中考虑使用。5、研究了单次肌肉注射恩诺沙星在中华绒螯蟹体内的休药期。实验数据通过药代动力学分析软件3P97在电脑上进行分析。中华绒螯蟹在肌肉注射恩诺沙星后经时过程符合二室开放模型,并计算出其主要药动学参数。以Michaelis-Menten动力学理论作为基础,以中国药理学会数学药理专业委员会编写的3P97实用药动学计算程序计算出的参数作为条件,建立了利用迭代法推算渔药休药期的方案。并确定,中华绒螯蟹肌肉注射恩诺沙星的休药期定在600度日(天*℃)。综上所述,本文较系统研究了恩诺沙星应用于中华绒螯蟹的药物残留检测方法、代谢动力学、蛋白结合率,并确定了休药期,对中华绒螯蟹质量安全生产具有明确的指导作用,实际效益显着。
参考文献：
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[9]. 典型全氟类化合物的生态毒性效应研究[D]. 吕达. 浙江农林大学. 2017
[10]. 恩诺沙星在中华绒螯蟹中的代谢动力学及其休药期研究[D]. 吴光红. 南京农业大学. 2007
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