郑玲[1]2007年在《“逆针灸”对更年期大鼠热休克蛋白及应激相关机制影响的研究》文中研究说明“治未病”是中医基础理论的重要组成部分,是《内经》以预防为主的学术观点的具体体现,对后世影响深远。“逆针灸”作为中医“治未病”的重要方法之一,即在机体无病、疾病发生之前或疾病发展轻浅之时,预先应用针灸的方法,以激发经络之气,扶助正气,调动机体内在调衡阴阳的能力,从而达到防止疾病的发生、减轻随后疾病的损害或保健延年的目的。逆针灸防病保健的作用已被大量研究证实,但其确切的作用机制尚在探询中。随着现代应激理论研究的深入,机体具有内源性保护机制已被广泛证实,利用人为手段使机体适度应激,预防或减轻随后疾病正引起医学界的高度重视。其特点在于:并非向机体补充大量的外源性物质,而是采取一些理化的预处理手段激发机体应激,启动机体内源性保护机制,加强机体对随后疾病损伤的抵抗与耐受力,是一种充分重视机体自身潜力激发与调动的整体调节方法。这正是“逆针灸”防病保健的特色所在,因而极具研究与开发潜力。更年期是妇女衰老进程中的关键启动期,此期由于肾元渐衰,天癸将竭,导致机体内环境急剧变化,多系统出现动荡与紊乱,机体处于一种生理性应激状态,在调整过程中不能适应而造成的由生理性应激转变成的病理性应激,致使70%～90%的更年期妇女出现繁杂多变的更年期综合征。更年期综合征的发生机理尚未完全明了,而应激反应中诱导生成的热休克蛋白与更年期时机体诸多环节如神经内分泌、免疫、抗氧化、雌激素受体、胰岛素受体功能等密切相关,因此探讨热休克蛋白在更年期机体中的作用,对于防治更年期综合征具有重要意义。本课题结合中医“治未病”的学术思想和现代应激医学理论,以自然更年期大鼠为模型,采用免疫组化、原位杂交、放射免疫、免疫比浊等方法,观察逆针灸关元穴对随后不同月龄自然更年期大鼠热休克蛋白、应激激素、神经递质、抗氧化相关因子及免疫因子等的影响,试图从HSP70及HSP70mRNA的角度探询逆针灸关元穴防治更年期综合征的相关应激机制。主要实验结果及结论如下:1.大鼠进入更年期后下丘脑不同核团HSP70及mRNA的表达随着月龄的增长表现不同的分布趋势,即视上核呈波动性升高,而室旁核和弓状核升高的幅度随着月龄的增长有下降的趋势。提示下丘脑不同核团在介导更年期中枢应激反应中发挥着不同的作用。下丘脑CRH含量的波动性降低和血浆ACTH、皮层5-HT含量的波动性升高,提示更年期大鼠HPA轴处于异常活跃状态,应激激素可能通过受体结合途径激活中枢吲哚类神经递质的大量合成。同时下丘脑抑制性应激激素β-EP含量却呈增龄性波动下降,皮层NE含量呈波动性升高,提示机体抑制性激素降低增强应激兴奋性的同时,也削弱了对儿茶酚胺神经元的紧张性抑制作用。预先针灸关元穴可不同程度的下调视上核HSP70及mRNA的表达,上调弓状核HSP70及mRNA的表达。提示逆针灸能够降低应激兴奋性因素,提高抑制性因素,有利于减缓应激中枢异常活跃状态。而对于应激反应中心核团的室旁核作用复杂,表现为各月龄HSP70mRNA的表达增强,说明逆针灸能够提高下丘脑室旁核应激调节中枢的警觉状态,转录大量HSP70mRNA以增强细胞应激保护能力。而12、14月龄HSP70表达的下调,可能与逆针灸提前诱导的HSP70在组织细胞中发挥保护效应减轻组织损伤、减缓应激反应程度有关;16月龄HSP70表达的升高,可能由于细胞内有害物质蓄积增多,逆针灸作用后使得机体翻译合成更多的HSP70以加强机体防御适应反应的能力,从而表现出双向性的调节作用。逆针灸下调CRH的作用主要表现在12、14月龄,对于血浆ACTH的调节表现为12月龄升高,14月龄降低,以缓和14月龄骤然升高的ACTH水平。而对于β-EP的上调和NE、5-HT的下调作用则主要体现在12月龄。提示逆针灸对中枢应激激素及神经递质的调节以早期效应为主。而逆针灸是否通过调节下丘脑重要核团HSP70及mRNA的表达及功能活动影响相应核团应激激素的合成和释放从而调节中枢神经递质的水平及其他神经内分泌功能,改善更年期精神及植物神经紊乱状态,有待于进一步研究。2.更年期机体应激反应使得CRH大量释放,能够造成对GnRH、垂体促性腺激素及卵巢雌激素合成的抑制作用,同时也可诱导细胞内热休克蛋白的生成。本实验观察到随着大鼠月龄的增长子宫HSP70及mRNA的表达呈先增后降的变化,早期热休克蛋白的增加可能与CRH的增加及局部雌激素水平下降对HSP抑制作用的降低有关,但随着组织器官的衰退,其蛋白合成能力下降,因而表现出晚期热休克蛋白及基因表达下调。同时随着机体进入更年期子宫SOD、NOS活性明显降低,而经逆针灸作用能增强各月龄组HSP70及mRNA的表达;且提高SOD、NOS的活性,主要表现在12、16月龄。提示逆针灸关元穴对随后更年期大鼠子宫产生保护作用机制可能通过减缓应激中枢的异常活跃状态,提高不同月龄外周子宫组织细胞HSP70及mRNA的表达,以促进组织SOD、NOS活性的增强,对抗应激激素及卵巢功能衰退引起的子宫靶器官的结构及功能的改变,提高机体抗氧化能力,增强NO/NOS的局部调节作用,减轻随后更年期衰老过程中自由基对组织器官的损害及组织器官功能紊乱,对于维持子宫正常的结构和功能,延缓子宫退行性变具有重要作用。3.更年期时机体的应激状态不仅引起机体神经内分泌系统的应答,同时也对免疫系统功能活动产生重要影响。本实验观察到更年期早期血清免疫因子IL-2、TNF-α的含量的下降,可能与机体应激导致血液和组织中神经递质及肽类激素含量升高,对免疫细胞产生的抑制性调节作用有关。而同时这些神经递质和肽类激素也能够诱导免疫细胞HSP的表达,因而表现出更年期大鼠早期脾脏HSP70mRNA表达的增高。随着月龄的增长,脾脏HSP70及mRNA的表达、血清IL-2的含量呈增龄性下降,而血清TNF-α的含量显著升高,提示机体在更年期衰老进程中由于自身保护能力和免疫功能的降低,可能导致有害物质在体内的蓄积,刺激TNF-α大量合成。而预先运用逆针灸的方法后,不同月龄更年期大鼠脾脏HSP70及mRNA的表达明显增强,血清IL-2含量显着升高,以14、16月龄尤为明显,且能提高更年期早期血清TNF-α的含量,降低更年期晚期TNF-α的过度表达。提示逆针灸关元穴对随后更年期大鼠免疫系统功能调整作用的机制可能与其调节应激中枢的功能状态,增强脾脏组织细胞HSP70及其基因表达,进而调节IL-2、TNF-α的合成、分泌及其生物学效应等相关,从而提高机体对外源性抗原的免疫应答能力,降低自身免疫炎性反应和组织器官损伤,减轻更年期应激状态下机体免疫系统功能的抑制或紊乱状态,对于延缓免疫系统退变和功能紊乱造成的机体衰老加速具有重要意义,并表现出良性、双向性的调整作用。综上所述:逆针灸关元穴可能通过调节中枢(下丘脑)及外周(子宫、脾脏)组织细胞热休克蛋白及基因的表达,调动了机体内在的抗病与应变能力;从而减缓中枢应激过度活跃状态,一定程度上降低脑内神经递质的异常分泌,提高子宫SOD、NOS的活性,调节血清免疫因子IL-2、TNF-α的含量,对于维持机体内环境稳定,调整更年期植物神经及免疫功能紊乱,改善子宫退行性变化具有一定作用。
张燏[2]2007年在《谷氨酰胺诱导热休克蛋白减轻大鼠肾脏缺血再灌注损伤》文中研究说明目的:肾脏缺血再灌注损伤在临床上很常见。减轻和避免肾缺血再灌注损伤在临床上有重要意义。本实验通过以下叁个方面来研究谷氨酰胺对大鼠肾脏缺血再灌注的保护作用。为临床上用药提供参考。1观察大鼠应用谷氨酰胺后体内血药浓度的变化以论证谷氨酰胺的最佳作用剂量和时间。2通过应用谷氨酰胺(Gln)后并设立对照组,利用病理切片和免疫组化的方法观察大鼠肾脏缺血再灌注损伤的变化和大鼠肾脏小管细胞凋亡的变化。观察谷氨酰胺是否减轻大鼠肾脏缺血再灌注损伤。3通过应用热休克蛋白阻滞剂栎黄皮桐(Quercetin)并设立对照组,探讨谷氨酰胺减轻大鼠肾脏缺血再灌注损伤与诱导大鼠肾脏热休克蛋白产生的关系。论证其对大鼠肾缺血再灌注损伤的保护作用的机理。方法:1, 12只S-D大鼠,雌雄不限,随机分为2组,每组6只,分别给予不同剂量谷氨酰胺(0.75g/kg和0.375g/kg)运用液相法测量0,15,30,45,60,120分钟大鼠体内的血药浓度。2 , 48只S-D大鼠,雌雄不限,随机分为4组,每组12只,分别不同的方法进行干预:A组:谷氨酰胺(Gln)组。经尾静脉给与谷氨酰胺(Gln)0.75g/kg.B组:生理盐水对照组。给予生理盐水作为对照,剂量和推注速度不变。C组:栎黄皮桐(quercetin)组。提前六小时腹腔注射给予栎黄皮桐(quercetin)一种热休克蛋白阻滞剂,剂量400mg/kg。然后同A组方法给予谷氨酰胺。D组;栎黄皮桐对照溶剂组。提前六小时腹腔注射对照溶剂。然后同A组方法给予谷氨酰胺。A,B,C,D四组药物干预后1小时内建立大鼠肾脏缺血再灌注模型,分别于再灌注6小时,24小时处死动物,抽血离心生化分析血肌酐和尿素氮,并取双侧肾脏标本,HE染色光镜下观察肾脏损伤情况并计分统计肾小管损伤程度。免疫组化和Western-Blot观察热休克蛋白(HSP-70)的表达。Tunel法观察肾脏细胞凋亡并统计凋亡指数。结果:1、谷氨酰胺血药浓度变化本实验测谷氨酰胺的血药浓度变化:在应用0.75g/kg的谷氨酰胺给大鼠尾静脉注射后一小时内血药浓度为3-7mmol/l。一小时后血液中谷氨酰胺浓度下降于3mmol/l以下。而在应用0.375g/kg的谷氨酰胺给大鼠尾静脉注射时,血药浓度达不到3 mmol/l。由于文献报道谷氨酰胺诱导热休克蛋白的最大有效浓度为3-7 mmol/l。故本实验发现在大鼠静注0.75g/kg的谷氨酰胺后一小时之内的血药浓度为诱导热休克蛋白的最大有效浓度。2肾缺血再灌注后两时间点的肌酐,尿素氮变化:各组实验结果表明大鼠肾脏缺血再灌注24小时后肌酐和尿素氮显着高于缺血再灌注6小时后(P<0.05)。A,D两组运用了谷氨酰胺干预后,肌酐,尿素氮与B组相比明显下降(P<0.05)。而C组与其他叁组相比肌酐,尿素氮明显增高(P<0.05)。3肾缺血再灌注后两时间点病理切片HE染色结果:镜下观察可见A,D两组损伤情况类似,主要表现为肾小管上皮细胞变扁平,刷状缘脱落,组织轻微充血,有少量细胞坏死和脱落。B组表现为肾上管上皮坏死,细胞脱落,蛋白管型形成。组织有比较严重的充血。C组表现较多的肾上管上皮坏死,细胞脱落,细胞管型形成。组织大面积充血。Paller氏计分结果表明:A,D两组与B组比较损伤明显减轻(P<0.01)。C组损伤重于B组(P<0.01)证明应用谷氨酰胺对肾脏缺血再灌注损伤有保护作用,在应用了热休克蛋白阻滞剂(Quercetin)后这种保护作用消失,同时可能由于阻滞了缺血再灌注损伤本身诱导热休克蛋白产生的作用。导致损伤进一步加重。A,D两组组内计分有统计学差异(6小时损伤重于24小时),而B,C组组内没有这种差异,表明B,C两组随着时间的延长损伤没有显着差别(P>0.05)。而A,D两组可能是由于谷氨酰胺诱导了大量热休克蛋白的产生而起到了修复损伤的作用。随着再灌注时间的延长,损伤渐渐减轻。(P<0.05)。4肾缺血再灌注后两时间点免疫组化热休克蛋白染色结果:镜下见A,D两组HSP-70呈强阳性,呈棕褐色,细颗粒状,弥漫分布于细胞浆。B组6小时组HSP-70呈弱阳性,呈淡黄色,细颗粒状,弥漫分布于细胞浆,24小时组HSP-70呈阳性,呈棕黄色,细颗粒状,弥漫分布于细胞浆,相对于A组表达弱,但相对于B组6小时表达明显。C组棕黄色染色区域很少,几乎没有表达。热休克蛋白染色镜下评分结果:统计结果表明A,D两组与B组比较热休克蛋白表达明显增强(P<0.01),而C组与B组相比热休克蛋白表达明显减弱(P<0.01)。A,C,D组组内比较没有统计学差异,证明热休克蛋白在6小时和24小时表达量没有时间上的差异。而B组24小时的热休克蛋白表达要高于6小时,证明正常大鼠肾脏缺血再灌注后热休克蛋白的表达似乎24小时要比6小时有所增强。5肾缺血再灌注后两个时间点Westen-blot检测结果:6小时A,D两组表达最强,B组表达弱于A,D组,强于C组。24小时A,D两组表达最强,B组弱于A,D组,强于C组。热休克蛋白表达两个时间点结果一致,和免疫组化结果也一致。由于不是同一时间下电泳,因此无法比较同一组的组内差异。6 Tunel法观察细胞凋亡结果:镜下观察所见:A,D两组见散在凋亡细胞。C组凋亡细胞数量多见。B组凋亡细胞可见。数量多于A,D组,少于C组。凋亡指数统计结果:A,D两组与B组相比凋亡指数明显降低,有统计学意义(P<0.01)。C组与B组相比凋亡指数明显升高,有统计学意义(P<0.01)。A,D两组相比没有差异(P>0.05)。A,B,C,D四组凋亡指数组内比较没有差异。(P>0.05)。这一结果说明谷氨酰胺诱导热休克蛋白可以减轻细胞凋亡。而应用Quercetin阻滞热休克蛋白产生后,这种抑制细胞凋亡的作用消失,而且由于抑制了细胞本身缺血再灌注后正常热休克蛋白的产生,导致抑制凋亡的作用进一步下降。细胞凋亡加重。结论:本实验研究得出相关结论如下:1,本实验测得的谷氨酰胺的血药浓度与文献研究结果是一致的,大鼠在应用0.75g/kg的谷氨酰胺尾静脉注射后一小时内血药浓度为3-7mmol/l。此为诱导大鼠器官热休克蛋白表达的最佳有效浓度。一小时后谷氨酰胺血药浓度下降,达不到诱导大鼠器官热休克蛋白表达的最佳有效浓度。同样应用0.375g/kg的谷氨酰胺静注后的血药浓度也达不到最佳有效浓度。2,在大鼠肾缺血再灌注前一个小时内应用谷氨酰胺证明对肾脏功能有保护作用。肌酐,尿素值测定,HE染色下观察和记分统计,Tunel法检测细胞凋亡等实验证据都支持应用谷氨酰胺后损伤减轻。3,经过免疫组化和Westen-blot的方法实验证据表明在谷氨酰胺组肾脏损伤减轻的同时肾脏大量表达热休克蛋白即Hsp-70。4,通过设立Quercetin组即C组为对照,表明谷氨酰胺的这种对大鼠肾脏缺血再灌注损伤的保护作用主要是诱导了肾脏产生大量的热休克蛋白,即Hsp-70。这种保护作用是通过热休克蛋白来发挥作用。阻滞了热休克蛋白即Hsp-70的产生,这种保护作用消失。5,免疫组化染色镜下观察和计分统计结果都发现大鼠肾缺血再灌注后自身可以诱导热休克蛋白,在24小时热休克蛋白的表达要大于6小时,而应用谷氨酰胺后这种时间上的差异没有统计学意义。说明谷氨酰胺诱导热休克蛋白的表达6小时已经达到或接近最大量。6,HE染色镜下观察和计分统计,应用谷氨酰胺组的24小时的损伤情况要轻于6小时。而对照组则没有明显的损伤差异。由此推测谷氨酰胺诱导肾脏产生的大量热休克蛋白已经起到了修复损伤的作用。7. Tunel法检测细胞凋亡等实验结果表明:谷氨酰胺诱导热休克蛋白可以抑制细胞凋亡。阻滞了热休克蛋白,这种抑制作用消失。总之,本实验似乎支持谷氨酰胺可以减轻大鼠肾脏的缺血再灌注损伤,其机理可能与诱导大鼠肾脏表达热休克蛋白,即Hsp-70有关。
王志刚[3]2003年在《小型猪胰腺移植缺血/再灌注损伤的实验研究》文中研究表明背景与目的：胰腺移植已成为Ⅰ型糖尿病伴有晚期肾病的标准治疗方法，能够使大多数的病人恢复血糖的正常水平，移植疗效和生存率不断改善，但移植胰腺炎仍然是困扰临床的一个重要问题，发生率约为35%，水肿性胰腺炎可以得到有效的控制，但出血坏死性胰腺炎往往造成很严重的后果，致使移植胰腺失活。研究发现缺血/再灌注损伤是引起移植胰腺炎的主要原因，而且缺血/再灌注损伤和术后胰腺功能的恢复、排斥反应的发生、血栓形成、感染等并发症也密切相关。缺血/再灌注损伤的发生是多种因素共同参与，相互影响、相互促进形成的一个错综复杂的损伤过程，近年的研究表明细胞凋亡是缺血/再灌注损伤的主要表现之一。目前探讨内源性的保护机制是防治缺血/再灌注损伤研究领域内一热点。热休克蛋白70(Heat shock protein 70 HSP70)作为一种应激诱导的保护蛋白，在移植器官遭受缺血/再灌注损伤时会出现高表达，发挥其分子伴侣的各种保护作用，研究表明HSP70的一个重要的保护功能还在于其能抑制细胞凋亡的发生。本实验的目的是通过建立小型猪胰腺移植模型，探讨胰腺移植缺血/再灌注损伤过程中细胞凋亡的发生，以及移植胰腺组织HSP70的表达及其对细胞凋亡的抑制作用，为临床胰腺移植缺血/再灌注损伤的防治提供必要的基础理论依据。材料和方法：封闭群健康小型猪共40只，供受体各20只，前后共行20 次同种异体单纯胰腺移植(肠引流外分泌)，氯胺酮、依托咪酯和速眠新全身麻醉，6％HAES-Sterial液行低温原位灌注。于原位灌注前、胰腺离体后、冷缺血2 小时和再灌注1 小时分别取胰腺组织行组织病理学、透射电镜超微结构检查，HSP70、Bcl-2、Bax免疫组化，TUNEL法检测原位凋亡及DNA 琼脂糖电泳，以及HSP70免疫组化和原位凋亡的双重染色；于再灌注0 分钟、30分钟、1 小时取外周血测血清淀粉酶和脂肪酶。免疫组化结果用生物医学图像分析仪行光密度分析(Optical density OD)，原位凋亡结果用凋亡指数(Apoptosis index AI)计量。以重复资料的方差分析、t检验统计结果，并行HSP70与凋亡指数的偏相关性分析。结果：⑴18只受体猪术后存活＞1天，手术成功率90％(18/20)，9只受体猪术后存活＞5天；⑵再灌注30分钟、1小时血清淀粉酶和脂肪酶比再灌注0分钟明显升高(P < 0.01)；⑶正常原位灌注前的胰腺组织也存在着凋亡，离体后、冷缺血2 小时及再灌注1 小时凋亡指数较原位灌注前明显增加(P < 0.01)；DNA琼脂糖电泳可见典型的DNA梯带；⑷组织病理学检查可见移植胰腺在原位灌注、冷缺血及再灌注过程中<WP=8>受到不同程度的损伤，冷缺血2小时和再灌注1小时均可见明显的凋亡细胞，再灌注1小时可见水肿、出血和白细胞浸润等炎症反应；组织病理学评分可见离体后、冷缺血2小时及再灌注1小时较原位灌注前明显升高(P < 0.01)；⑸HSP70在原位灌注前表达较低，离体后、冷缺血2小时及再灌注1小时较原位灌注前表达明显增强(P < 0.01)；Bcl-2在原位灌注前表达较高，离体后、冷缺血2小时及再灌注1小时较原位灌注前表达明显减低(P < 0.01)；Bax在原位灌注前表达较低，离体后、冷缺血2小时及再灌注1小时比原位灌注前表达明显增强(P < 0.01)； HSP70免疫组化和原位凋亡双重染色可见同一组织切片HSP70表达较高的区域凋亡细胞相对较少，而HSP70表达较低的区域凋亡细胞相对较多；⑹HSP70与凋亡指数偏相关性分析：相关系数﹣0.4730，P < 0.05，在显着水平上HSP70和凋亡呈负相关。结论：⑴缺血/再灌注损伤可以引起移植胰腺细胞凋亡的发生，细胞凋亡是移植胰腺缺血/再灌注损伤早期的主要表现，抗凋亡治疗在防治胰腺移植缺血/再灌注损伤中应该得到一定重视；⑵Bcl-2蛋白在移植胰腺缺血/再灌注损伤细胞凋亡过程中表达减低；Bax蛋白则表达升高；⑶HSP70在胰腺移植缺血/再灌注损伤过程出现增强表达，并且HSP70表达与细胞凋亡呈负相关，HSP70具有抑制细胞凋亡的作用。
袁志强[4]2004年在《HSP70在烧伤早期肠粘膜损害中的保护作用及其机制研究》文中认为多器官功能障碍综合征(Multiple Organ Dysfunction Syndrome，MODS)是烧伤后叁大死亡原因之一，业已证实缺血缺氧是导致烧伤各种脏器损害的主要始动因素之一。缺血缺氧导致细胞氧利用及能量代谢障碍，进一步可引发失控性炎症反应，最终广泛损害细胞的功能，导致细胞凋亡或死亡。肠道是对缺血、缺氧损伤最敏感的器官之一，其缺氧性损伤普遍存在于严重烧、创伤后的病理生理过程中，严重烧伤后，由于肠粘膜屏障损害、免疫功能受抑和肠道菌群紊乱，肠道中的微生物和内毒素可通过受损的肠粘膜屏障侵入到体循环及其它脏器，形成肠源性感染。后者可成为导致全身性炎症反应综合征(Systematic Inflammatory Response Syndrome，SIRS)乃至MODS的启动因素。因此，如何减轻烧伤早期肠粘膜损伤，保护肠粘膜屏障功能已成为目前烧、创伤防治研究的重要课题。 热休克蛋白(Heat Shock Proteins，HSPs)是一组生物体(或离体培养细胞)在应激情况下由热休克基因所编码合成的序列高度保守的伴随细胞蛋白，并能对抗随后更为严重的应激损伤。应激情况下，热休克因子(heat shock factor,HSF)激活，HSF与热休克基因上游的一段DNA序列热休克元件(heat shock element，HSE)结合启动HSPs的转录。几乎所有的细胞均能合成HSPs，其中HSP70是HSPs家族中最保守、含量最丰富，也是研究最广泛的一种。近年来研究发现HSP70作为一种非特异性的细胞内源性保护蛋白，在防止应激引起的细胞损害或者使受损的细胞恢复方面起着重要作用。有研究表明通过诱导HSP70表达增加可增强心、肺、肝等器官对缺血缺氧的拮抗作用，其诱导的数量与保护作用的强弱呈正相关，提示上调器官组织内HSP70的含量有助于其免受或少受缺血缺氧性损伤。 严重烧伤本身及随后出现的缺血缺氧和失控性炎症反应对于机体组织细胞而言均为严重的应激，对于HSP70在严重烧伤后的变化规律及其在烧伤早期脏器损害中的作用目前尚不明确，本课题拟通过烧伤大鼠模型及体外培养肠上皮细胞缺氧复氧模型，研究烧伤后早期肠粘膜组织HSP70表达变化规律，通过上调组织细胞内HSP70的表第叁军医大学博士学位论文达，分别从细胞凋亡、线粒体功能变化等方面探讨HSP7O在严重烧伤早期肠粘膜缺血缺氧性损害中的作用及其机制，旨在探讨细胞的内源性保护机制在烧伤早期脏器损害中的作用，为烧伤后缺血缺氧和失控性炎症反应等病理生理过程中细胞和器官的保护提供一个新的思路和可能的应用前景。 一、材料方法: 1.采用大鼠111“30%TBSA烧伤模型，检测伤后3、6、12、24、48h不同时相点肠粘膜组织内HSP7O及 HSFI的表达分布情况。 2.通过亚砷酸钠预处理诱导大鼠肠粘膜HSP70表达增加，检测大鼠m 030%TBSA烧伤后血浆内毒素、二胺氧化酶(Dian五ne oxidase，n^0)、D一乳酸、肠粘膜组织MDA、SOD含量及肠上皮细胞凋亡的变化，烧伤后肠粘膜组织病理学改变及HSP70、Bel一2表达的情况。 3.全长HsP70基因与cosmid质粒pAxCAwt连接构建穿梭质粒。然后与腺病毒DNA一TPC共转染293细胞，通过同源重组成功构建了Ad一HSP70腺病毒重组体，扩增后获得高滴度的Ad一HSP7O病毒液。将Ad一HSP70腺病毒重组体体外转染肠上皮细胞IEC一6，观察目的基因在肠上皮细胞中的表达。利用肠上皮细胞体外缺氧复氧模型，观察Ad一HSP70转染细胞后对LDH漏出、细胞活力、细胞凋亡、细胞内游离钙浓度、细胞内ATp含量、能荷及线粒体膜电位的影响，检测HsP70，Bd一2，Caspase一3及CytochromeC的表达和分布情况0 二、主要结果: 1.烧伤后3h肠粘膜组织内HSP7OmRNA及蛋白表达显着增加，分别在伤后6h、12h达高峰，在伤后48h仍高于正常对照;伤后3h大鼠肠粘膜组织HSFI出现一过性降低，伤后6h其表达显着高于正常对照，并呈逐渐增加的趋势持续到伤后48h。 2.在伤后早期即可出现明显的肠粘膜损害病理学改变，在伤后12、24h损害最为严重。细胞器中线粒体损害最为明显。伤后血浆D一乳酸、DAO及内毒素水平较正常对照明显升高，在伤后6一12h达高峰，持续到伤后48h仍高于正常;烧伤后肠上皮细胞凋亡率明显增加，在伤后12h达高峰。 3.亚砷酸钠预处理对大鼠严重烧伤后早期肠粘膜屏障的损害存在保护作用，表现为粘膜损害评分减低，肠上皮细胞线粒体损伤减轻，肠上皮细胞凋亡减少，伤后血浆D一乳酸、DAO及内毒素水平显着低于单纯烧伤组，组织过氧化损伤也减轻，该保护作用伴随着亚砷酸钠预处理诱导肠粘膜组织HSP7O表达的增强，而用榭皮酮抑制亚砷酸钠对肠粘膜组织HSP7O表达的诱导后，亚砷酸钠对烧伤大鼠肠粘膜的保护作用被抵消;亚砷酸钠预处理可显着增加烧伤后肠粘膜组织内Bd一2蛋白的表达。第叁军医大学博士学位论文 4.成功构建了复制缺陷型腺病毒重组体Ad一HSP70，体外转染肠上皮细胞后可诱导细胞内HSP7O基因的高表达。Ad一HSP7O转染组肠上皮细胞缺氧复氧后的细胞活力明显增强，LDH漏出及细胞凋亡减少。 5.Ad一HSP7O转染可显着增加肠上皮细胞缺氧复氧后细胞内ATP的含量及能荷，保护线粒体整体功能，Ad一HsP7O转染组细胞缺氧复氧后细胞内游离caZ+浓度?
戴四发[5]2012年在《谷氨酰胺和γ-氨基丁酸对肉鸡抗热应激和肉品质的影响及机理探讨》文中研究表明本文通过体内试验研究了循环热应激(30-34℃)对肉鸡生长性能、屠宰性能、胴体性状、血清生化指标、肌肉品质、骨骼肌中G1n和GABA代谢、HSP70、AMPK信号通路相关指标的影响及外源性Gln和GABA的添加效果和互作效应,探讨了可能存在的机理,分析了骨骼肌部分指标与肌肉品质间的相关性。并进一步通过体外试验探讨了热应激条件下家禽骨骼肌细胞HSP70、AMPK问的调控关系及外源性Gln、GABA的干预作用,为氨基酸用于家禽抗热应激提供理论基础。1.体内试验：按照2因素2水平(2×2)加正对照组(PC组)的实验设计进行。选择健康的10日龄(d)健康AA公鸡360只,在适温条件下,常规饲养至21d时随机分为5组(每组6重复,每重复12只)。其中,四个热应激组(2×2)在22-42d进行循环热应激处理(每日9：00-14：00,温度从30℃升至34℃,14：00-18：00温度从34℃降至30℃,其他时间平均23℃左右),在基础日粮中分别添加Gln(0、5g/kg)和GABA (0、100mg/kg)。PC组在适温条件饲养(约23℃),饲喂基础日粮。于28、35、42d进行生长性能分析,并分别从各重复组抽取3只接近平均体重的样鸡用于屠宰性能、胴体品质、血清生化指标、肌肉品质、骨骼肌中Gin和GABA代谢、HSP70、AMPK信号通路相关组分的分析,对部分指标与肌肉品质之间的相关性进行分析,结果如下：1.1循环热应激降低了22-42d肉鸡增重(WG)和采食量(FI),42d时的屠体重(CW)、半净膛重(HEW)、全净膛重(EW)、胸肌重(BMW)、胸肌率(BMY)、腿肌重(LMW)、腹脂重(AFW)、腹脂率(AFY)、肌间脂肪宽(IFW)、皮下脂肪厚(SFT)；增加了肉鸡料重比(F/G)和腿肌率(LMY)。日粮添加5g/kg Gln增加了22-42d热应激肉鸡WG、FI、CW、HEW、EW、BMW、BMY、LMW、AFW、AFY、 IFW、SFT;降低了F/G,对LMY有降低趋势。日粮添加100mg/kg GABA增加了22-42d热应激肉鸡WG、FI、EW、BMW、BMY、AFW、AFY、SFT;对CW、HEW、IFW有增加趋势。两种氨基酸在影响循环热应激肉鸡WG、FI、F/G、EW、EY、BMW、 BMY、AFW、AFY、IFW和SFT方面存在协同效应。在影响生产性能方面,Gln的作用具有较好的持续性,GABA在第1周时作用较强,随后明显减弱。1.2循环热应激降低了28d、35d、42d肉鸡血清TP、葡萄糖、甘油叁酯、Gin、Glu、T4、Ins水平、ALP活性,22d、35d血清GABA水平；增加了22d、35d、42d肉鸡血清CS、GN水平、GOT、GPT、LDH、CK、NOS活性。日粮添加5g/kg Gln增加了22d、35d、42d热应激肉鸡血清TP、Gln、Ins水平,降低了血清甘油叁酯、CS、GN水平、GOT、CK、NOS活性。日粮添加100mg/kg GABA增加了22d、35d、42d热应激肉鸡血清TP、Gln、GABA、T3水平、ALP活性,对甘油叁酯、Gln、T4、 CS、Ins、GN水平、GOT、GPT、LDH、CK、NOS活性的影响存在明显的时间特异性。两种氨基酸在影响循环热应激肉鸡血清TP、甘油叁酯、GABA、Gln、T3、T4、 Ins、GN水平、ALP、LDH和CK活性方面存在明显的协同效应,在影响转氨酶(GOT、 GPT)和NOS方面仅在第1周时较显着。1.3循环热应激增加了28、35、42d肉鸡胸肌pH、L*、水分、CP、CF、CA、 TL、F、MFDS,腿肌pH、L*、CA, DL、SF、MFDS;降低了肉鸡胸肌DL、CLMFDM,腿肌a*、b*、CP、CF、CL、TL、CL、MFDM。日粮添加5g/kg Gln降低了胸肌L*、SF、MFDS,腿肌L*、DL、SF、MFDS,增加了胸肌CP、CF、CA、TL、 DL、MFDM,腿肌a*、CP、CF、水分、CL、MFDM.日粮添加100mg/kg GABA降低了胸肌pH、TL、SF、腿肌pH、DL、SF,增加了胸肌a*、水分、CP、CF,腿肌a*、CF。两种氨基酸在影响循环热应激肉鸡胸肌pH、b*、水分、CP、WHC、TL、SF,腿肌pH、L*、a*、水分、CP、WHC、TL、SF方面存在明显的协同效应。此外,通过日粮Gln和GABA可以提高肌肉在冷藏过程中的色泽稳定性。1.4循环热应激降低了28d、35d、42d肉鸡胸肌、腿肌的Gln、Glu、GABA含量、Glnase、GAD活性,增加了胸肌、腿肌的GS、GABA-T活性。日粮添加5g/kg Gln增加了胸肌的Gln、Glu含量、Glnase、GAD活性,腿肌的Gln、Glu、GABA含量、GAD活性；降低了胸肌、腿肌的GS活性,对胸肌的GABA含量、GABA-T活性、腿肌的Glnase、GABA-T活性有不同程度的影响。日粮添加100mg/kg GABA增加了胸肌的Gln、Glu含量、Glnase、GAD活性,腿肌Gln含量、GAD活性；降低了胸肌的GABA-T活性、腿肌的GS活性。两种氨基酸对循环热应激肉鸡胸肌、腿肌的Gln、 GABA含量、Glnase、GS、GABA-T活性的影响存在明显的协同效应。42d肉鸡胸肌、腿肌的Gln、GABA含量、Glnase、GS活性与L*、CP、CF、CL、MFDS和MFDM间存在显着的相关性。1.5循环热应激降低了28d、35d、42d肉鸡胸肌、腿肌糖原、葡萄糖、乳酸含量,增加了胸肌、腿肌的AMP/ATP、AMPK含量、AMPK活性、HSP70含量、AMPKa2mRNA、HSP70mRNA表达量。日粮添加5g/kg Gln增加了胸肌、腿肌的HSP70含量、HSP70mRNA表达量、胸肌的葡萄糖、腿肌的糖原；降低了胸肌、腿肌的AMP/ATP、 AMPK含量、AMPK活性。日粮添加100mg/kg GABA增加胸肌的糖原、葡萄糖、腿肌的葡萄糖、乳酸,降低了胸肌、腿肌的AMP/ATP、AMPK活性、腿肌的HSP70含量、HSP70mRNA表达量。两种氨基酸对循环热应激肉鸡胸肌的葡萄糖、乳酸、腿肌的糖原、乳酸、胸肌和腿肌的AMP/ATP、AMPK活性、HSP70mRNA表达量存在明显的协同效应。42d肉鸡胸肌和腿肌的糖原、葡萄糖、乳酸与水分、CP、CF, AMP/ATP. AMPK含量、AMPK活性与L*、水分、CP、CF、WHC、DL、CL、MFDS和MFDM间,HSP70含量与WHC、TL、DL间存在较为显着的相关性。2.体外试验：研究热应激影响家禽骨骼肌细胞HSP70、AMPK的调控关系及外源性Gln. GABA的干预作用。以1-2×106个/mL密度的成肌细胞进行试验。处理后置于37℃水浴中进行3h修复,收集细胞供分析。2.1热应激条件下HSP70表达与AMPK活性变化时差性分析共5组,每组6重复,基础培养基培养3h后进行热应激处理(42℃和45℃,0-120min)。结果表明：热应激提高了细胞的HSP70表达量和AMPK活性,以45℃处理的提高速度更快,程度更大,且以AMPK活性的变化速度快于HSP70表达量的变化。2.2HSP70表达与AMPK活性问的调控关系分析(1)QD抑制HSP70表达试验：共7组,每组6重复。用添加浓度为0-50umol/L的QD的基础培养基预培养3h,进行42℃和45℃、30min的热应激处理。结果表明：QD对HSP70表达的抑制作用存在明显的温度特异性,仅45℃时表现显着。同时,45℃时的AMPK活性具有不同程度的增加,显示HSP70能在一定程度上抑制/AMPK活性。(2)AICAR激活AMPK试验：共7组,每组6重复。用添加浓度为0-0.5mmol/L的AICAR的基础培养基培养3h处理。结果表明：AICAR能有效激活适温条件下的骨骼肌细胞AMPK活性,但对HSP70的表达量无影响。2.3Gln、GABA对细胞HSP70与AMPK的影响各取5组,每组6重复。在基础培养基中分别添加0-20mmol/L Gln和0-0.8mmol/L GABA预培3h后,进行45℃,30mmin热应激处理。结果表明：Gln能有效增加热应激条件下骨骼肌细胞的HSP70表达量,同时抑制AMPK活性的增加。GABA能在一定程度上抑制AMPK活性的增加,但对HSP70表达量无影响。2.4Gln、GABA对极端热应激骨骼肌细胞成活率的影响各取3组,每组6重复。分别用添加0、10、20mmol/L Gln和0、0.4、0.8mmol/L GABA的基础培养基预孵3h后,采用48℃高温处理3h、6h,分析细胞成活率。结果表明：添加10、20mmol/L Gln提高了热应激处理3h、6h后的骨骼肌细胞成活率；添加0.4、0.8mmol/L GABA对细胞成活率无明显影响。根据研究结果可以得出结论：(1)本研究采用的30-34℃循环热应激对22-42d肉鸡生长性能、胴体性状、血清主要代谢物、激素和代谢酶等生化指标产生了显着的负面影响,也显示了机体对热应激的适应性。日粮添加5g/kg Gin、100mg/kg GABA能有效缓解循环热应激对上述指标带来的负面作用,同时表现出了明显的协同效应和时间特异性。(2)从物质代谢角度分析,循环热应激显着影响了血清和骨骼肌中的Gln、Glu、 GABA水平,以及叁种氨基酸间的代谢酶。通过日粮添加5g/kg Gln、100mg/kg GABA可以有效改善循环热应激条件下肉鸡骨骼肌中Gln、GABA的代谢状况,同时表现出了一定的协同效应和骨骼肌组织差异性。(3)循环热应激明显造成了肉鸡机体的低能量状态,激活了骨骼肌中AMPK信号通路,促进了骨骼肌中HSP70转录和表达。通过日粮添加5g/kg Gln、100mg/kg GABA可以改善机体的能量状况,抑制骨骼肌AMPK信号通路,且表现出了一定的协同效应。同时说明,Gin的这种积极作用可能在一定程度上与促进HSP70表达有关,而GABA的改善作用与HSP70无关,可能与其神经系统和生理调控方面功能有关。(4)循环热应激对胸肌、腿肌的化学组成和肉品质指标产生了显着的负面影响。通过日粮中添加5g/kg Gln、100mg/kg GABA对于缓解热应激对这些指标带来的负面影响具有积极作用,其中的机制与骨骼肌中Gin代谢变化、(?)AMPK信号通路激活状况、HSP70表达量的变化有密切关系,且表现出了一定的协同效应和骨骼肌组织差异性。(5)通过体外骨骼肌细胞试验证明,热应激能激活肌细胞AMPK信号通路,促进HSP70的表达。热应激细胞中HSP70的表达可在一定程度上抑制AMPK信号通路的激活,起到保护细胞作用。在适温条件下细胞中AMPK的激活并不能导致HSP70表达量的变化。同时证明,外源性Gln、GABA均能抑制热应激骨骼肌细胞AMPK信号通路,但仅有Gln能有效保护热应激细胞,其作用与促进HSP70表达密切相关。
曹桂霞[6]2007年在《耐力训练对大鼠心肌Hsp72mRNA表达及急性运动耐受性的影响》文中提出热休克蛋白是一种细胞内源性保护蛋白，它普遍存在于整个生物界，几乎所有的细胞均能合成。当机体遇到环境应激时，热休克蛋白可以被诱导合成，并在维持细胞的自稳、保护细胞免受各种应激伤害中发挥重要作用。大量研究证实，热休克蛋白在减小心肌缺血再灌注的损伤、抗细胞凋亡等方面有重要作用，而运动可以诱导机体HSP70的表达，这提示我们也许运动可以作为一种预防或治疗心血管疾病的有效方法。本实验目的是通过让大鼠进行长期中等强度的耐力训练，观察耐力训练对急性应激大鼠心肌Hsp72mRNA表达的影响，同时检测心肌SOD、CAT、MDA的水平，探讨长期中等强度耐力训练对心肌的保护作用及其可能机制，从而为运动健身提供一些实证支持。本实验选用健康雄性SD大鼠36只，体重为180±10g，随机分为安静组(C组，n=18只)和耐力组(T组，n=18只)，进行1周的适应性训练和6周的正式训练。6周训练结束后，休息24h，安静组和耐力组大鼠各取6只作为基础组，两组剩余大鼠再进行一次急性运动，然后分别在急性运动后0h和24h将大鼠处死。根据动物的分组，在不同时间取心肌，用RT-PCR法检测Hsp72mRNA表达，分光光度法检测SOD、CAT活性，硫代巴比妥酸法(TBA法)检测MDA含量。实验结果：(1)6周耐力训练后，安静组大鼠体型较胖，耐力组大鼠体型适中，两组大鼠体重相比具有显着性差异(P＜0.05)。(2)从急性运动应激时的两组大鼠的行为表现可以看出，安静组大鼠对运动应激的适应性较差，耐力组大鼠具有较好的抗运动应激能力。(3)6周耐力训练后，与安静基础组相比，耐力基础组大鼠心肌Hsp72mRNA表达和SOD的活性都显着增加(P＜0.01)，而CAT的活性却无显着性差异。(4)与安静基础组相比，安静组急性运动后0h，大鼠心肌Hsp72mRNA表达显着增加(P＜0.01)，24h后仍具有显着性差异(P＜0.01)；耐力组急性运动后0h，大鼠心肌Hsp72mRNA表达也显着增加(P＜0.01)，24h后基本恢复到基础值。耐力组与安静组相比，大鼠心肌Hsp72mRNA表达在急性运动后0h及24h都具有显着性差异(P＜0.01)。(5)与安静基础组相比，安静组急性运动后0h，大鼠心肌SOD的活性显着增加，SOD／MDA的值有显着性差异(P＜0.05)；24h时SOD的活性和MDA含量都显着增加，SOD／MDA的值没有显着性差异(P＞0.05)。耐力组急性运动后0h，大鼠心肌SOD的活性显着增加，心肌MDA含量显着下降，SOD／MDA的值显着增加(P＜0.01)，24h后仍具有显着性差异(P＜0.01)。CAT的活性只有耐力组急性运动后0h显着增加(P＜0.05)。结论：(1)耐力训练能有效的控制体重，使机体保持良好的状态更好的适应急性应激。(2)长期中等强度耐力训练可以增加大鼠心肌Hsp72mRNA的表达，提高心肌抗氧化酶SOD的活性，降低急性应激时心肌脂质过氧化产物MDA的含量，说明耐力训练诱导的Hsp72mRNA表达的增加和SOD活性的增强，对于提高心肌在受到应激时的适应性和耐受力，维持机体内环境的稳定有很大作用。(3)急性运动应激时大鼠心肌Hsp72mRNA的表达显着增加，说明在受到急性应激时Hsp72mRNA表达能迅速上调，这是细胞的一种内在的自我保护机制。但是，Hsp72mRNA在迅速上调以产生更多蛋白保护细胞的同时，也从侧面反映了细胞受到的应激程度。给予相同的急性应激，耐力组大鼠心肌Hsp72mRNA上调相对较少，这说明耐力训练可以使大鼠心肌具有较好的抗应激能力。(4)急性运动应激可以激活大鼠心肌SOD的活性，使SOD水平升高，但同时MDA含量也增多，提示此时自由基代谢和抗氧化系统之间存在失衡。耐力训练可以使心肌抗氧化系统发生适应性变化，提高心肌清除自由基的能力，减少急性应激时心肌氧化性损伤，使自由基代谢和抗氧化系统之间失衡程度减小。(5)Hsp72mRNA的表达和抗氧化酶SOD的活性具有相似的时相性变化，说明两者之间存在一定联系。Hsp72可能与抗氧化酶共同作用，增强机体的抗氧化能力，抵御应激对机体的损伤。(6)从本实验结果我们推测，长期中等强度的耐力运动有利于保护心脏，提高心脏对应激的适应性和耐受力，达到更好的强身健体效果。
孙志刚[7]2009年在《热休克蛋白70在手术创伤中表达及作用的实验研究》文中指出目的:检测大鼠不同程度手术创伤中血淋巴细胞HSP70(Heat ShockProtein,HSP70)的表达水平,研究HSP70与手术创伤及创伤致内环境改变之间的关系,探讨HSP70在手术创伤及内环境稳态中的作用。方法:1.动物模型建立:雄性健康Sprague-Dawley(SD)大鼠随机分为四组:(1)对照组(G0组):大鼠不作任何手术处理;(2)实验组分别为:①轻度创伤组(G1组):大鼠肝脏左外叶切除组;②中度创伤组(G2组):大鼠肝脏左外叶和右叶切除组;③重度创伤组(G3组):大鼠肝脏左外叶、右叶和乳头叶切除组;每组20只,在5个时间点进行分批处理大白鼠(每时间点均为20只),每组大鼠在同样的环境中饲养,不同组间及时间点间大鼠体重、年龄无差异。2.指标检测:分别采取对照组和手术各组术前12h、术后2h、12h、24h、48h血液标本,用流式细胞仪检测血淋巴细胞HSP70水平,用血气分析仪检测动脉血PH、HCO_3~-及BE值,全自动生化仪检测血K~+、Na~+及Ca~(2+)浓度。结果:(1)采用SD大鼠肝叶切除术成功建立不同程度手术创伤模型,轻度创伤组大鼠存活率为97.5%,中度创伤组存活率为95.0%,重度创伤组存活率为91.3%,组间差异比较无显着性意义(P＞0.05),为研究手术创伤对机体影响建立动物模型。(2)手术创伤后外周血淋巴细胞HSP70的含量随着时间逐渐上升,术后12h达高峰(P＜0.05),后逐渐下降,至48h仍高于正常水平;不同程度手术创伤组术后HSP70表达量随创伤程度增加而升高(P＜0.05),提示HSP70可以作为判断手术创伤程度的指标之一。(3)在不同程度手术创伤组术后的内环境变化,叁组不同创伤组术后K~+都迅速下降,至2h达最低水平,后逐渐上升恢复至正常水平,不同组间K~+变化,在术后2h点各组间表达随创伤程度增加而明显下降(P＜0.05),其余各时间点组间无明显差异(P＞0.05)。叁组不同创伤组术后Na~+和渗透压变化,术后逐渐下降,至12h达最低水平,后逐渐上升至术前水平;不同组间Na~+变化,在术后12h点各组间表达随创伤程度增加而下降更明显(P＜0.05),其余各时间点组间无明显差异(P＞0.05)。重度创伤组PH在术后2h降低较明显,且稍低于正常范围,与其余组间有差异(P＜0.05),其余各组及时间点基本在正常范围,且组间无明显差异(P＞0.05)。重度创伤组术后2hBE及HCO_3~-稍低于正常范围,但与其余组间无明显差异(P＞0.05),其余组BE及HCO_3~-基本维持在正常水平。(4)在不同创伤组HSP70与K~+之间的关系,在中度及重度组手术后的变化具有正相关(P＜0.05);不同组间在术后2h具有高度相关r=-0.728,(P=0.000),术后12h及24h中度相关,具有统计学意义。在HSP70与渗透压之间的关系,叁组术后的变化均有中度负相关,具有统计学意义(P＜0.05);不同组间在术后12h及24h具有高度负相关(P＜0.05),术后2h及48h有中度负相关(P＜0.05)。结论:1.在不同程度手术创伤后,血淋巴细胞HSP70即表达,且随创伤程度增加而升高,可将血淋巴细胞HSP70作为判断创伤程度的指标之一。2.手术创伤后大鼠内环境指标随着HSP70升高逐渐恢复至正常稳态水平,提示HSP70对内环境稳态起着重要的作用。3.在手术创伤中,随着创伤程度的增大过程,HSP70与内环境指标成负相关。提示HSP70和内环境指标在手术创伤中是伴随着创伤程度而变化的,推测HSP70可能作为内环境稳态的预警指标,需进一步研究以明确。
李丹[8]2007年在《重组人促红细胞生成素对大鼠视网膜神经元缺血再灌注损伤的保护作用》文中进行了进一步梳理目的：制作Sprague-Dawley(SD)大鼠视网膜缺血再灌注(Retinal ischemia-reperfusion，RIR)损伤模型，探讨腹腔内注射重组人促红细胞生成素(recombinant human erythropoietin，rHuEPO)对缺血再灌注损伤所致的大鼠视网膜神经元损伤的保护作用和其对热休克蛋白72(heat shock protein72，HSP72)表达的影响及其相互关系。方法：首先选择18只SD大鼠，随机分为正常组、假手术组、RIR组，各6只，采用前房灌注的方式建立大鼠视网膜缺血再灌注损伤(RIR)模型，灌注压为110mmHg，维持时间为1小时。摘除眼球作视网膜病理切片观察以及采用免疫组织化学法和原位末端脱氧核酸转移酶介导的脱氧叁磷酸尿苷缺口末端标记法(TUNEL)技术检测视网膜细胞的凋亡情况，同时对视网膜凋亡细胞进行计数并作统计学分析。随后选择78只SD大鼠，随机分组：正常组6只，EPO治疗组(采用腹腔注射rHuEPO)、EPO+槲皮黄酮组、缺血再灌注组各24只，均以右眼为实验眼。采用TUNEL技术分别测定正常对照组和各实验组大鼠再灌注12小时、24小时、48小时和72小时视网膜中热休克蛋白72及凋亡细胞的表达；观察各组大鼠视网膜病理学改变。结果：(1)正常组和假手术组大鼠视网膜偶见凋亡细胞，每高倍视野均数分别为0.83+0.753和1.00±0.632。RIR组大鼠视网膜中可见大量凋亡细胞，每高倍视野均数为30.33±2.160，差异具有极显着统计学意义(p＜0.01)。(2)正常组大鼠的视网膜神经元中HSP72表达微弱，各实验组大鼠视网膜中HSP表达自再灌注12小时开始增强，24小时达到高峰，后逐渐减弱，72小时时表达稍高于正常。再灌注后各时间段，EPO组大鼠视网膜中HSP表达均高于RIR组，EPO+槲皮黄酮组(p均＜0.05)。(3)正常大鼠视网膜中几乎没有凋亡细胞。再灌注后12小时，各实验组大鼠视网膜中可见凋亡细胞，24小时达高峰，48小时后凋亡细胞数逐渐减少；再灌注后各组大鼠视网膜中凋亡细胞数比正常组多(p均＜0.05)。(4)再灌注后，RIR组、EPO+槲皮黄酮组大鼠内层视网膜明显水肿，炎症细胞侵入，膜结构逐渐破坏；EPO组大鼠视网膜结构保持相对完整，炎症细胞相对较少。结论：(1)通过前房灌注加压法成功制作RIR损伤动物模型。(2)RLR损伤后大鼠视网膜中存在大量的细胞凋亡。(3)HSP72在正常大鼠视网膜中表达微弱。RIR损伤后其表达增多。腹腔注射EPO可以明显的诱导大鼠视网膜中HSP72的表达增多。(4)EPO明显减少大鼠RIR损伤后视网膜细胞的凋亡，减少视网膜内炎症细胞的浸润，保护视网膜结构。(5)EPO对缺血再灌注损伤的视网膜具有明显的保护作用，其机制可能与使HSP72表达上调有关。
王小俊, 陈林霖, 方颖[9]2019年在《异泽兰黄素的药理作用研究进展》文中提出异泽兰黄素是从菊科蒿属植物中分离得到的一种黄酮苷元,大量研究表明异泽兰黄素具有多种显着的药理活性,包括抗炎、抗氧化、抗肿瘤、抗过敏等,文章总结了近年来国内外关于异泽兰黄素的药理作用及其机制研究进展,以期对它的深入研究和开发提供参考。
参考文献：
[1]. “逆针灸”对更年期大鼠热休克蛋白及应激相关机制影响的研究[D]. 郑玲. 北京中医药大学. 2007
[2]. 谷氨酰胺诱导热休克蛋白减轻大鼠肾脏缺血再灌注损伤[D]. 张燏. 第二军医大学. 2007
[3]. 小型猪胰腺移植缺血/再灌注损伤的实验研究[D]. 王志刚. 第叁军医大学. 2003
[4]. HSP70在烧伤早期肠粘膜损害中的保护作用及其机制研究[D]. 袁志强. 第叁军医大学. 2004
[5]. 谷氨酰胺和γ-氨基丁酸对肉鸡抗热应激和肉品质的影响及机理探讨[D]. 戴四发. 南京农业大学. 2012
[6]. 耐力训练对大鼠心肌Hsp72mRNA表达及急性运动耐受性的影响[D]. 曹桂霞. 华东师范大学. 2007
[7]. 热休克蛋白70在手术创伤中表达及作用的实验研究[D]. 孙志刚. 广西医科大学. 2009
[8]. 重组人促红细胞生成素对大鼠视网膜神经元缺血再灌注损伤的保护作用[D]. 李丹. 中南大学. 2007
[9]. 异泽兰黄素的药理作用研究进展[J]. 王小俊, 陈林霖, 方颖. 时珍国医国药. 2019
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