周晖[1]2004年在《常见虾蟹血细胞染色观察及分类研究》文中研究说明疾病是目前制约虾蟹养殖发展的关键因素。要从根本上解决虾蟹疾病危害，必须对虾蟹的免疫机制进行深入研究。虾蟹不具有特异性的免疫系统，其非特异性免疫机制主要通过血细胞吞噬、包囊、形成结节等来完成，血细胞在虾蟹免疫系统中扮演关键角色，但目前对于虾蟹血细胞的分类及其功能研究尚无定论。 本文通过观察Wright's-Giemsa混合染液对血细胞的染色效果，以细胞核、细胞质及胞质颗粒的着色差别是否显着，胞质颗粒及细胞核的着色是否鲜明，细胞整体形态是否清晰这叁方面作为判断标准，分别确定了适用于12种常见养殖虾蟹血细胞的不同染色方案。这12种虾蟹分别是：罗氏沼虾、日本沼虾、南美白对虾、日本对虾、斑节对虾、刀额新对虾、克氏原螯虾、中华绒螯蟹、叁疣梭子蟹、锈斑鲟、锯缘青蟹、黑斑口虾蛄。 使用上述染色方案对12种虾蟹的血细胞进行染色，光镜下观察血细胞的形态和染色特点，结合电镜下罗氏沼虾血细胞的形态特征，确定以颗粒的大小、数量和密度，以及细胞的核质比作为主要的分类依据，辅以颗粒、细胞核与细胞质的颜色，以及细胞大小等特征，对12种虾蟹的血细胞进行分类。将12种虾蟹的血细胞分为叁大类：透明细胞、半颗粒细胞和颗粒细胞。 在光镜下统计各类血细胞在血液中所占的比例，测量血细胞大小，统计循环血细胞数。结果表明，12种虾蟹的血细胞大小范围：细胞长径5-20um，短径4-14μm。同种虾蟹叁类血细胞的大小：颗粒细胞＞半颗粒细胞＞透明细胞。12种虾蟹的叁类血细胞核质比范围：颗粒细胞为0.1-0.7，半颗粒细胞为0.4-0.9，透明细胞为0.7-1.0。同种虾蟹叁类血细胞的核质比：颗粒细胞＜半颗粒细胞＜透明细胞。 在12种虾蟹的循环血细胞中，颗粒细胞占17-69％，半颗粒细胞26-76％，透明细胞4-26％。南美白对虾、日本沼虾和黑斑口虾蛄的循环血细胞以颗粒细胞为主；其它9种虾蟹以半颗粒细胞为主；在12种虾蟹的叁类血细胞中，透明细胞所占比例最小。12种虾蟹血液中血细胞密度的范围是0.4-2.5×10~7个／ml，比较接近。 本文所改进的血细胞染色方法可望应用于其它虾蟹血细胞的染色观察研究，所提供的12种虾蟹的血细胞光镜染色分类特征和统计数据，可以作为这些虾蟹血细胞免疫功能研究的基础。
丁小丰[2]2009年在《锯缘青蟹黄水病的血液指标及组织基因表达差异研究》文中认为本论文对锯缘青蟹(Scylla serrata)“黄水病”进行了研究,该病是近些年来发生在我国浙江沿海养殖锯缘青蟹的一种流行性疾病,患病青蟹的主要症状表现为甲壳内出现黄色腔液、血淋巴呈黄色或浊白不凝液体,该病持续时间较长,呈季节性流行趋势,危害严重。为了更多地了解该病的致病机理,我们对患病蟹的免疫水平、血液生化指标进行了测定,并对肝胰腺在“黄水病”胁迫条件下的基因表达差异进行了探索性研究。本研究主要结果如下:1.对锯缘青蟹的血细胞进行分类以正常青蟹血淋巴为研究材料,分别进行显微和亚显微观察,将青蟹血细胞分为叁类:大颗粒细胞、小颗粒细胞和无颗粒细胞,叁类血细胞在光镜和电镜下具有明显不同的结构特征,这些特征与其在免疫过程中可能承担的功能相关。对血细胞进行分类,为分析“黄水病”的血细胞比例变化提供理论前提。2.“黄水病”对锯缘青蟹免疫水平的影响选择血细胞密度(THC)、血细胞比例、血细胞吞噬活性、血清酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(AKP)、溶菌酶(LZM)、过氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)、酚氧化酶(PO)作为指标,对“黄水病”青蟹和健康青蟹的免疫水平进行测定比较,发现大多数免疫指标发生显着变化,其中血细胞密度、血细胞吞噬活性和绝大多数血清酶活性指标皆极显着下降,血细胞比例也发生了显着变化,说明“黄水病”发生后,青蟹的免疫能力受到抑制,免疫系统可能遭到破坏,受到继发感染的可能性增加。3.“黄水病”锯缘青蟹血液生化分析与健康青蟹相比,“黄水病”锯缘青蟹血液中大多数生化指标发生了显着改变,病蟹血清蛋白质含量及部分血清酶活性皆极显着降低,血清中糖类、脂类及蛋白质代谢物含量异常,电解质紊乱,说明患病青蟹的消化吸收、排泄、渗透压调节等功能遭到破坏,与这些功能相关的组织发生严重病变。4.“黄水病”锯缘青蟹与健康青蟹肝胰腺组织基因表达差异采用分子病理学手段研究了“黄水病”青蟹肝胰腺组织的病理变化。通过mRNA差异显示技术,发现病蟹与健康蟹肝胰腺组织的基因表达存在差异。对不同来源的肝胰腺组织的表达基因片段进行PCR扩增和PAGE比较筛选,发现了至少10条差异条带,其中有2条被成功回收和重扩增:一条来自健康青蟹组织,另一条来自病蟹组织,认为是差异表达的基因片段。对该两条基因片段进行克隆测序,将测序结果在GenBank数据库进行比对,未发现相匹配基因,不排除其来自某些暂未研究到的新基因的可能,这些基因分别在健康青蟹和病蟹肝胰腺中表达,在不同的生理状态下开启或关闭,微观分子水平上的变化,引起宏观机体组织的代谢变化。该研究从分子层面上揭示病理变化情况,这也为病理研究提供新的思路。
赵柳兰[3]2012年在《组织胺对新糠虾和中华绒螯蟹的消化功能、免疫力以及卵巢发育的影响》文中提出中华绒螯蟹在养殖的过程中，鱼粉和冰鲜野杂鱼常常被作为饲料原料或直接投喂，由于在鱼粉的制备工艺或者野杂鱼的运输、储存不当等原因，往往会导致饲料或者野杂鱼的变质、腐败，产生大量的生物胺。而组织胺作为毒性（scombroidpoisoning）最大的一种生物胺，常被作为检测鱼粉质量以及野杂鱼的新鲜度的一个标准，也是食品安全的重要检测指标。目前已经有研究发现摄食组织胺饲料能够影响甲壳动物的生长，存活以及性成熟，而消化、免疫以及性腺的发育是维持其正常的生长所必须的基础。目前已有研究证实，组织胺能够引起鱼以及家禽胃肠道疾病，而有关组织胺对甲壳动物消化功能的影响未见报道。日本和黑褐新糠虾常常作为毒性监测的良好模式生物，而中华绒螯蟹存在生长周期长以及采样的局限性，所以本文通过研究组织胺对日本新糠虾消化、免疫以及卵巢发育影响进行方法的探索，继而为组织胺影响中华绒螯蟹的这些生理功能提供具体依据，也是首次探索组织胺影响甲壳动物消化、免疫以及卵巢发育的机理，也为冰鲜野杂鱼的投喂提供科学的指导。（1）消化道和肝胰腺是甲壳动物主要的消化器官，消化组织结构的完整以及消化酶的正常分泌是维持消化功能的关键。通过投喂新糠虾和中华绒螯蟹不同浓度的组织胺饲料（1000,2000和4000mg/kg组织胺）17d和28d，对消化道和肝胰腺组织结构的组织学分析以及消化酶测定，结果表明：a.1000mg/kg组织胺均能够导致新糠虾和中华绒螯蟹肝胰腺上皮细胞严重的脱落、破损甚至基膜分离；4000mg/kg能够引起其B-cell显着增多以及管壁变薄，并且2000mg/kg组织胺能够引起中华绒螯蟹肝胰腺F-cell和内腔上皮细胞凸起的增多；b.而对消化道的组织切片发现，组织胺能够导致新糠虾中肠上皮细胞排列稀疏，破损甚至脱落，其中1000mg/kg浓度组尤为显着；而4000mg/kg的组织胺能够引起后肠的管壁变薄以及膜分离；对中华绒螯蟹的中肠以及后肠未见类似影响，但是能够引起其肠球中部嗜碱性细胞以及相连的网状组织中的嗜伊红细胞的变化，其中1000mg/kg能够减少其肠球中嗜碱性细胞和网状组织中嗜伊红细胞，而2000和4000mg/kg的组织胺能分别增加其网状组织中的嗜伊红细胞和肠球中的嗜碱性细胞，组织胺对其后肠结缔组织中嗜伊红细胞以及嵴也有影响，1000mg/kg的嗜伊红细胞密度与对照组未见差异，但是能够引起皱襞粘膜层中的嗜伊红物质的增加，而2000和4000mg/kg组的嗜伊红密度降低。c.对肠球以及后肠的细胞增殖的免疫组化发现，组织胺能够引起肠球以及后肠嵴中细胞增殖阳性，其肠球中的阳性细胞的变化的规律与嗜碱性细胞规律一致，而嵴中的阳性则与其嗜伊红物质一致。而肥大细胞是组织胺释放的主要细胞，通过肥大细胞特异性染色（甲苯胺蓝以及阿尔新蓝-番红染色法）发现，其肠球中的嗜碱性细胞以及后肠结缔组织中的嗜伊红细胞均呈现甲苯胺蓝以及阿尔新蓝-番红着染，并且肠球以及网状组织中的颗粒呈现组织胺免疫阳性，因此肠球以及后肠中存在类肥大细胞的物质，可能通过组织胺的释放影响肠道的组织结构。(2)类胰蛋白酶，淀粉酶以及脂肪酶是甲壳动物主要的消化酶。通过饲喂以上浓度组织胺饲料28d,结果表明：a.组织胺能够影响肝胰腺和消化道的消化酶活性，并且肝胰腺中的影响较为显着,即肝胰腺1000mg/kg组的类胰蛋白酶和脂肪酶在7，14，21和28d均显着低于对照组（p<0.05），而淀粉酶在7d和14d显着低于对照组（p<0.05）；消化道1000mg/kg组类胰蛋白酶，淀粉酶以及脂肪酶仅分别在7d，7d~21d以及28d显着低于对照组（p<0.05）。b.而肝胰腺中叁种消化酶的影响中，类胰蛋白酶的影响较大。在第7d时，组织胺处理后的肝胰腺的类胰蛋白酶的活性均较对照组（1.76±0.02）U/(mg.prot)有显着降低（p<0.05），分别为对照组的27.00%（1000mg/kg）、71.79%(2000mg/kg)、57.75%（4000mg/kg），其中1000mg/kg组织胺投喂组，其酶活力较其他两个组织胺组更为显着，各组织胺组之间的酶活均存在显着性差异（p<0.05）。14~28d,除了4000mg/kg酶活性与对照组之间无显着，其类胰蛋白酶也均显着低于对照组。而淀粉酶在7d和14d时，组织胺处理后的酶活均低于对照组，并且具有显着性差异（p<0.05）；21d和28d时，其淀粉酶活性与对照组不存在显着性差异（p>0.05）。脂肪酶在7d的时候，组织胺组的脂肪酶活性均显着低于对照组（p<0.05），但是各浓度组之间没有显着性差异，14~28d时，仅低浓度组（1000mg/kg）与对照组有显着性差异（p<0.05）。c.并且对肝胰腺类胰蛋白酶进行RT-PCR测定发现其组织胺对类胰蛋白酶的影响与其mRNA基本一致。（3）通过饲喂以及注射两种方式对组织胺在中华绒螯蟹肝胰腺，肌肉中的累积发现，注射组织胺浓度为0，1，50，100和200g/g在96h内能够在肝胰腺和肌肉中出现累积，并且肝胰腺和肌肉中组织胺浓度与注射的浓度呈正比，而饲喂含0，1000，2000和4000mg/kg组织胺饲料28d。发现肌肉中检测不到组织胺，而肝胰腺中仅7d组织胺饲喂组组织胺含量均显着高于对照组。对28d肌肉，肝胰腺以及血清组织胺主要的代谢酶二胺氧化酶（DAO）的酶活性测定发现，肌肉中DAO的酶活显着高于肝胰腺，这可能是肌肉中检测不到组织胺的原因。说明组织胺能够在短期内在体内累积，并且短期内组织胺能够增加体内章鱼胺和5-HT的含量，对腐胺则影响无规律。因此，组织胺能够导致肝胰腺细胞（B-和F-细胞）比例发生变化以及消化道（中肠以及后肠等）组织结构的产生损伤，细胞增殖，并且消化酶活性降低，其中1000mg/kg组织胺浓度组影响尤为显着，组织胺从转录水平影响肝胰腺中类胰蛋白酶的活性。而组织胺能够在短期内在体内累积，并且短期内组织胺能够增加体内章鱼胺和5-HT的含量，对腐胺则影响无规律。（4）通过对日本新糠虾和黑褐新糠虾对溶藻弧菌的敏感性以及血细胞形态和组成的比较，发现日本新糠虾敏感性较高即96h的累积，而颗粒细胞比例要低于黑褐新糠虾，但是其形态更多样。因而对日本新糠虾的血细胞形态进行光镜和电镜的观察发现，其血细胞由叁种类型的细胞组成，即透明细胞，半颗粒细胞和颗粒细胞组成，细胞大小依次升高，以颗粒细胞所占比例最多，约占细胞总数的一半，约为48%，其次为半颗粒细胞，其比例约为31%。比例最小的是透明细胞，仅约为21%，叁组间均有显着性差异（p<0.05），电镜发现其颗粒细胞胞质中有大量的颗粒物质。组织胺水体（0，10，20和40mg/L）浸泡日本新糠虾30d后，其血细胞中颗粒细胞的比例显着下降，而胞质中的颗粒物质明显减少，并且40mg/L组织胺浓度组的颗粒细胞形态更加多样性。组织胺处理之后，对其组织的免疫酶进行测定，结果发现溶菌酶和酚氧化酶活性随组织浓度上升而显着下降（p<0.05）而ACP和AKP的活性无显着影响（p>0.05）。注射中华绒螯蟹的浓度为0，1，50和100g/g组织胺，1h后注射7.2×108cfu/ml，在12、24、36、48、72和96h的观察其抵御嗜水气单胞菌的死亡率，结果表明96h其组织胺浓度组的死亡率均显着高于对照组（p<0.05），但是单独的注射组织胺不会导致中华绒螯蟹死亡，却能够引起酚氧化酶（PO）和超氧化物歧化酶（SOD）活性升高（p<0.05），24h总的血细胞数目（THC）与对照组无显着差异而磷酸酶（ACP和AKP）则无规律变化。注射组织胺后，中华绒螯蟹产生明显的自切和颤抖现象，并且自切率随着组织胺浓度的上升而上升（p<0.05）。总之，组织胺能够影响免疫酶以及血细胞的形态和组成，提高对嗜水气单胞菌的敏感性，产生自切现象，并且存在种间的差异性。（5）对不同卵巢发育期的日本新糠虾雌激素受体的免疫组化发现，卵巢发育早期其卵母细胞的雌激素受体强烈阳性，因此选取一期的中华绒螯蟹研究组织胺对其卵巢发育的影响。通过中华绒螯蟹注射组织胺的浓度为0，1，50，100和200g/g后，96h取其卵巢，进行组织学的研究发现，组织胺能够影响中华绒螯蟹一期卵巢的卵细胞排列以及形态，并且存在浓度的差异性。其中50g/g能够显着的导致卵母细胞间隙变大，中部排列稀疏，细胞变形严重，有的退化成空的滤泡腔；100g/g与50g/g浓度的影响类似，而200g/g则边缘形成较多的小细胞。通过细胞增殖染色发现这些变形的卵细胞以及形成的小细胞均显示强烈的阳性，而雌激素受体的染色发现中部的这些变形的细胞则显示弱阳性，小颗粒细胞仍然显示雌激素受体强烈阳性。
谢彦海[4]2011年在《褶纹冠蚌热休克蛋白基因克隆与表达及2种淡水蚌的血细胞分析》文中研究表明本研究采用RACE技术从褶纹冠蚌中克隆到HSP70和HSP90基因的cDAN序列,以及从褶纹冠蚌基因组中克隆出HSP70和HSP90基因组序列。HSP70基因cDNA序列全长为2664bp(基因登录号：ADM64336),其中5’UTR有364 bp；3’UTR有383 bp,在N末端存在4个RNA不稳定模体ATTTA和26bp的poly (A); HSP70基因的开放阅读框为1917bp,编码638个氨基酸组成的蛋白质,该蛋白理论等电点为5.61,分子量为70.3kD。根据HSP70基因cDNA序列推导氨基酸序列发现,氨基酸序列含有HSP70家族的叁个标签序列,含有4个糖基化位点,以及保守的EE (V/M) D多肽结构。HSP70氨基酸包括一个由380个氨基酸组成ATP酶结构域,一个由159个氨基酸组成的底物肽结合结构域,以及一个由82个氨基酸组成的C端结构域。HSP70基因组全长发现,HSP70基因的ORF内不存在内含子。HSP90基因cDNA序列全长为2674bp(基因登录号：ADN87332),其中5’UTR有83 bp；3'UTR有410 bp。该序列包括1个28bp的poly (A),1个AATAAA加尾信号以及1个RNA不稳定模体ATTTA; HSP90基因的ORF为2181bp,编码726个氨基酸组成的蛋白质,该蛋白理论等电点为5.05,分子量为83.47kD。根据HSP90基因cDNA序列推导氨基酸序列发现,氨基酸序列含有HSP90家族的5个标签序列,3个糖基化位点,以及C末端存在保守的MEEVD多肽结构。同时,推测该序列含有由155个氨基酸组成ATP酶结构域。HSP90基因组序列全长9739bp；其中在ORF中有8个外显子,7个内含子。利用半定量PCR和荧光定量PCR研究了热处理、嗜水气单胞菌、重金属刺激下,HSP70 mRNA和HSP90 mRAN的表达量。热休克刺激后,蚌5种组织的HSP70 mRNA表达量均显着高于对照组,其中血液和鳃内的表达量变化最显着,其次是外套膜和肝胰腺,而肌肉内的表达量变化不明显。嗜水气单胞菌刺激6h后,仅血液和外套膜组织中HSP70 mRAN的表达量显着增加,而其它组织增加不明显,12h后各组织的表达都达到峰值,其中血液、鳃和肌肉内的表达量增加最为显着,随后逐渐下降,48h表达水平恢复到正常状态。不同温度刺激下,蚌血细胞中HSP70 mRNA的表达变化显着,其中35℃时表达量是5℃时表达量的99042倍,而15℃,25℃时HSP70 mRNA的表达量仅为5℃时的16.1倍和13.4倍。在重金属(Cd2+)刺激下,HSP70 mRNA的表达量都随时间的增加而升高,表达峰值出现在15d,而20d时表达量急剧下降,接近正常表达水平。在重金属(Cr6+)刺激下,5d时,HSP70 mRNA的表达量增加不显着,随刺激时间的增加,表达量逐渐的升高,15d时表达量都达到最大值,随后表达量开始逐渐下降,20d时表达量下降到正常状态水平。热休克刺激后,蚌5种组织HSP90 mRNA表达量明显的增加,其中在血液、肌肉和肝胰腺内的表达量增加最大,而鳃和外套膜的表达量相对小。嗜水气单胞菌刺激后,HSP90mRNA的表达量明显地增加,但5种组织间的相对表达量没有明显的差异。不同时间段的刺激中,发现随刺激时间的增加,HSP90 mRNA的表达量也增加,到12h时表达量达到最大值,之后表达量趋于稳定,随后表达量开始下降,48h后表达量恢复到刺激前的水平.不同温度刺激下,HSP90 mRNA的表达量随温度的升高而增加,35℃时,蚌处于热休克状态,此时HSP90 mRNA的表达量是5℃时表达量的130倍。不同浓度Cd2+刺激蚌后,蚌内HSP90 mRNA的表达具有不同的变化趋势,但都表现为正调节作用。当Cd2+的浓度为50μg/L和100μg/L时,表达峰值分别出现在15d和20d,随后表达量开始下降,而Cd2+浓度为200μg/L时,峰值出现在5d,随后表达量趋于高位稳定。重金属Cr6+刺激后,随着刺激时间的增加,HSP90mRNA的表达量随之增加。浓度1μg/L和10μg/L时,表达峰值出现在15d,而Cr6+浓度为100μg/L时,HSP90表达峰值均出现在10d,随后表达量逐渐下降,20d时恢复正常水平。为了进一步探讨HSP70和HSP90的功能,通过双酶切连接,构建了pET30-HSP70和pET30-HSP90原核表达系统,成功表达了两种蛋白。SDS-PAGE分析发现HSP70和HSP90在IPTG的诱导下,随诱导时间的增加,蛋白表达量逐渐增加,8h时表达量最大。利用纯化的重组蛋白制备多克隆抗体。用Western-blotting分别检测褶纹冠蚌血、鳃、肌肉、肝胰腺和外套膜五种组织中HSP70和HSP90的蛋白表达量。结果显示,热休克(35℃)后,五个组织中HSP70的表达量相对于室温(20℃)时的表达量显着增加,其中血、鳃、外套膜和肝胰腺组织的表达量高,而肌肉的表达量相对较少。热休克(35℃)后,五个组织中HSP90的表达相对于室温(20℃)时的表达量增加明显,其中血液的表达量最大,其次是肝胰腺和肌肉,而鳃和外套膜的表达量增加相对较少。褶纹冠蚌和背角无齿蚌血细胞形态极其相似,都可分为大颗粒细胞、小颗粒细胞、透明细胞和淋巴样细胞四种。两种蚌不同亚型之间所占的比例有所差别,其中小颗粒细胞为数量最多的细胞类型,分别占血细胞总数比例分别为(56.6±1.41)%和(59.28±0.89)%；透明细胞也是数量较多的细胞类型之一,占血细胞总数比例分别为(37.8±2.11)%和(27.74±0.56)%；大颗粒细胞数量较少,所占比例分别为(4.2±0.23)%和(4.28±0.35)%。淋巴样细胞比例分别为(2.4±0.12)%和(8.70±0.23)%。
徐宾朋[5]2016年在《拟穴青蟹蜕皮周期中离子转运相关基因的研究》文中研究说明蜕皮是甲壳动物生长发育中重要的生物学现象。蜕皮周期中的离子转运对甲壳动物生长、存活和繁殖都具有重要的生理学意义。然而目前关于甲壳动物蜕皮周期中离子转运的分子机制仍然不明确。本文以拟穴青蟹为研究对象,依据第叁颚足上刚毛的形态变化,将拟穴青蟹蜕皮周期准确划分为蜕皮后期、蜕皮间期、蜕皮前期和蜕皮期。通过电镜、HE染色等方法,分析了拟穴青蟹离子转运的主要器官——鳃的形态学结构特征。通过分子生物学方法,发现拟穴青蟹肝胰腺中,钙网蛋白(CRT)在蜕壳周期中的基因表达量变化与钙含量的变化趋势具有相似性,说明钙网蛋白可能参与肝胰腺中钙离子的存储过程;同时发现,拟穴青蟹血淋巴中的Na+、Cl-浓度以及渗透压变化规律与Na+/K+/2Cl-共转运蛋白(NKCC)的基因表达量变化一致,说明它可能参与蜕皮后期渗透压调节中的离子吸收过程。该研究为深入解析甲壳动物蜕皮周期中离子转运的相关机制打下了良好基础。具体研究结果如下:1.拟穴青蟹蜕皮周期的划分采用拟穴青蟹第叁颚足的刚毛发育和游泳足内皮发育的形态学特征对其蜕皮周期的划分进行了研究。结果显示,采用第叁颚足可以将蜕皮周期划分为:蜕皮后期A期、B期;蜕皮间期为C期;蜕皮前期被细分为D0亚期、D1亚期、D2亚期;蜕皮期E期。采用游泳足也可以将其划分为几个类似的蜕皮时期。但是由于拟穴青蟹游泳足较厚,透明度较差,不能精确地对蜕皮周期进行划分。因此,采用第叁颚足的刚毛发育的分期方法更加清晰、精确。2.拟穴青蟹鳃的结构结合运用扫描电镜,透射电镜以及HE染色技术,对拟穴青蟹的离子转运的器官-鳃的结构进行了形态学分析。结果表明,拟穴青蟹具有8对鳃,每条鳃由中心鳃轴及其向两侧的层片状鳃叶组成,鳃叶之间具有囊状结构,可能起到支撑和控制鳃间距的功能。鳃壁外被角质层,内由上皮细胞、隔膜和中央血腔构成。切片结果显示:前鳃中,上皮细胞主要以薄细胞为主,中央血腔相对较大,细胞内线粒体和膜结构相对较少,为鳃的呼吸型上皮;而后鳃中厚细胞居多,细胞内含有丰富的膜结构和线粒体,从而分别为离子转运提供酶的着位点和能量,因而更有利于离子的主动转运和物质的吸收,为离子型上皮。因此,拟穴青蟹的前鳃主要参与呼吸作用,而后鳃则在离子转运中具有重要的作用。3.外壳在拟穴青蟹蜕皮过程中的矿化过程应用扫描电镜对拟穴青蟹不同蜕皮时期(A期、C期、D期、E期)的外壳截面进行扫描。结果显示:拟穴青蟹外壳在蜕皮后期A具有上表皮、外表皮和内表皮。进入蜕皮间期C,表皮最内层的膜层形成,具备完整的表皮结构,厚度增加。到了蜕皮前期,表皮厚度继续增加,膜层消失。蜕皮期丢弃的外壳,厚度和蜕皮前期相近,但上皮层消失。在外壳中主要含有C(40.91%)、O(36.59%)、Ca(12.58%)、P(7.60%)几种元素,其他还含有少量的Si、P、S、Mg、Na等元素。说明了拟穴青蟹的外壳中可能主要以碳酸钙和磷酸钙盐为主。在不同的蜕皮时期内,钙的相对含量发生周期性变化,蜕皮后期,外壳钙浓度最低(0.42%);蜕皮间期完成矿化后,钙浓度上升到13.94%;蜕皮前期,外壳中钙浓度达到21.35%;蜕皮期达到最大值为29.75%。证明了拟穴青蟹外壳的钙离子随着蜕皮周期而逐渐累积,使得其外壳的厚度和机械强度增加。蜕皮时,拟穴青蟹丢失大部分钙,随后的矿化过程则需要迅速补充大量的钙。4.钙网蛋白在拟穴青蟹蜕皮周期中钙代谢的调节作用应用同源克隆策略和RACE技术从拟穴青蟹克隆了钙网蛋白CRT基因,经实时荧光定量PCR检测,CRT基因在拟穴青蟹的肌肉、鳃、肝脏、触角腺、胸神经节、心脏、肠、上皮等8个组织中均表达,说明其参与拟穴青蟹多种生理功能的调节,但表达量有显着差异,其中在肝胰腺中表达量远高于心脏和肠等组织。在不同的蜕皮周期内,原子吸收光谱和焦锑酸钾沉淀法结果显示:肝胰腺的钙离子在蜕皮后迅速降低,蜕皮间期保持平衡,蜕皮前期存储量增加,这和CRT mRNA在不同蜕皮时期的表达量具有一定的一致性。上述试验结果表明,CRT基因可能参与肝胰腺中Ca2+的储存过程。5.NKCC在拟穴青蟹蜕皮周期中渗透压的调节功能应用同源克隆策略和RACE技术,从拟穴青蟹鳃中成功克隆得到Na+/K+/2Cl-共转运蛋白(NKCC)基因。NKCC基因全长4151bp,编码1053个氨基酸,组织分布的结果表明SpNKCC mRNA主要在鳃组织中集中表达,尤其是参与离子转运的后鳃中表达量最高。在蜕皮周期中,血淋巴渗透压,Na+、Cl-在蜕皮期最低,蜕皮后期(A-B)迅速增加,随后间期达到平衡,在蜕皮前期又进一步升高。蜕皮SpNKCC mRNA在蜕皮后期的离子吸收的时期表达量迅速增加,同时和许多参与离子吸收的基因表达量一致,说明了后鳃的SpNKCC参与了蜕皮后期的离子平衡时的离子吸收。
参考文献：
[1]. 常见虾蟹血细胞染色观察及分类研究[D]. 周晖. 暨南大学. 2004
[2]. 锯缘青蟹黄水病的血液指标及组织基因表达差异研究[D]. 丁小丰. 宁波大学. 2009
[3]. 组织胺对新糠虾和中华绒螯蟹的消化功能、免疫力以及卵巢发育的影响[D]. 赵柳兰. 上海海洋大学. 2012
[4]. 褶纹冠蚌热休克蛋白基因克隆与表达及2种淡水蚌的血细胞分析[D]. 谢彦海. 南昌大学. 2011
[5]. 拟穴青蟹蜕皮周期中离子转运相关基因的研究[D]. 徐宾朋. 浙江大学. 2016