邹立波[1]2002年在《蓖麻毒素的提取和纯化及其抗肿瘤作用的研究》文中指出蓖麻毒素(Ricin Toxin,RT)是从大戟科植物蓖麻的种子中提取的一种毒素蛋白，具有强烈的细胞毒性。蓖麻毒素的分子量为65000，由两条多肽链组成，其间通过二硫键相连接。A链是活性链，分子量为31000，B链分子量为33000，具有凝集素的功能，其上有两个特异的半乳糖凝集部位。蓖麻毒素的一级结构已由Funatsu等完成，结果显示，A链由363个氨基酸残基组成，只有两个Lys残基，一个位于N端第四位，一个位于C端附近，对A链的毒性作用至关重要。B链是由259个氨基酸组成的序列，它能特异性地识别细胞膜上特定的含有末端半乳糖的糖蛋白或糖脂受体。B链本身几乎没有毒性，主要作用就是识别和结合细胞表面的受体，B链上结合位点的构成与酪氨酸或含有ε-NH_2的赖氨酸残基有关。蓖麻毒素经受体介导的内吞方式进入细胞，在细胞内通过逆分泌途径转运至内质网，然后A链和B链分开，A链转位至细胞浆，在胞浆中和核糖体的60S大亚基结合，通过其特异的N-糖苷酶活性，催化切断60S亚基28SrRNA中第4234位腺嘌吟与核糖分子之间的糖苷键，这一嘌吟的脱落可导致整个核糖体的失活，从而影响需核糖体参与的氨基酰-tRNA的结合和肽酰-tRNA的转位过程，最终导致蛋白质合成障碍，引起细胞的死亡。蓖麻毒素具有强烈的细胞毒性，具有抗肿瘤的应用前景。为了提高特异性，近年来，研究的热点在于将A链和特异性的单克隆抗体结合，制成免疫毒素，将毒素特异性地靶向运送至肿瘤细胞，可以减少毒素对正常细胞的损伤。这方面的研究取得了可喜的进步，但还有不少问题有待于进一步的研究。 本研究主要集中于从天然蓖麻种子中提取和纯化蓖麻毒素，进行生化鉴定和生物学活性检测，通过细胞培养，观察其对正常小鼠成纤维细胞NIH 3T3和结肠癌细胞Colon205的作用。以白血病细胞K562和大肠癌细胞SW480为实验对 浙江大学硕土学位论文 象，比较其对不同肿瘤细胞的杀伤作用。 一、蓖麻毒素的提取和纯化 根据Nicolson和Blaustein的方法稍加改进，将去壳的蓖麻籽匀浆，以0刀IM， pH－7．2的 PBS提取，4吐过夜，离心并沉淀，加硫酸镣至 40％饱和度，40C过 夜，离心，继续加硫酸铰至 80％饱和度，4七放置4小时，离心，将沉淀物以 0刀IM，pH。7．2的 PBS溶液溶解，即得粗提液。取粗提液 510ml缓慢通过 SePharose 4B亲和层析柱Q cm X 25 cm）使其结合。用蛋白自动检测仪检测 ohannacia）记录280urn波长下的吸收峰。由于蓖麻毒素和凝集素与Sepharose 4B有亲和作用，首先以0．of M，pH刁．二的PBS洗脱，可洗脱杂蛋白。然后， 以0～0．5 M乳糖梯度洗脱，可将蓖麻毒素和凝集素同时洗脱。收集280 urn处 洗脱峰，是为蓖麻毒素和凝集素的混合物。根据文献报道，凝集素的分子是为 120000左右，而蓖麻毒素的分于量约在60000～65000之间。根据它们分于量大 小不同，我们采用Sephadex－G100分于筛将其分离。由于凝集素分子量较大， 所以，首先被洗脱，出现第一个洗脱峰，而蓖麻毒素分子量小，集中在第二个 洗脱峰。 二、蓖麻毒素的鉴定 根据文献报道，蓖麻毒素的分子量在60000～65000之间，由A，B两链组成。 链之间由二硫键连接，进行 10％SDS－PAGE电泳，观察其电泳行为。样品处理 过程中，如加还原剂，可出现二条电泳带，分子量分别为31000和33000；不加 还原剂时出现一条电泳带，并可估计其相应的分子量65000。 叁、。活性检测 酶联仪测定掳拍酸脱氢酶活性，其原理是掳琅酸脱氢酶（SDH）是叁梭酸 循环中的重要酶，存在于线粒体内膜上，是反映线粒体功能的敏感指标，线粒 体是细胞的供能场所，其功能的丧失意味着细胞生命的结束。因此，可以根据 3 浙江大学硕士学位论文 SDH的活性推知细胞的活性。MTT法即利用噬哇蓝染料，化学名 3．（4，5．H 甲基暖哇．2）．2，5．二苯基四氮哇澳盐，简称 MTVI’，来显示细胞线粒体内的掳 琅酸脱氢酶活性，在有酶的地方，酶作用于底物进行脱氢，脱下的氢与Mry作 用，将氧化型的 MTh还原成难溶性的蓝紫色结晶物（formazan）并沉积在细胞 中，而死细胞无此功能。以二甲基亚枫（DMSO）溶解细胞中的染色结晶物。 用酶联免疫检测仪在 570 urn波长处测定吸光值，在一定细胞数量范围内，M’I’T 结晶物形成的量与细胞数成正比，可间接反应活细胞数。该方法己广泛用于生 物活性因子的活性检测。 1．蓖麻毒素对乳腺癌细胞生长曲线的影响 每种细胞都有比较稳定的生长增殖特性。?
门金闩[2]2010年在《RTA系列融合蛋白的表达及其抗肿瘤功能研究》文中进行了进一步梳理Viral protein 22(VP22)是I型单纯疱疹病毒的壳皮蛋白,作为一种细胞转导肽(Cell-Penetrating Peptides, CPPs),能介导其融合蛋白进入细胞并具有细胞间穿梭功能。TAT是来自HIV的含11个氨基酸的短肽,也是一种转导肽,被广泛用于转导肽段、寡核苷酸和蛋白进入细胞。促性腺激素释放激素(gonadotrophin releasing hormone,GnRH)是下丘脑分泌的含有十个氨基酸的短肽类激素,它可以作用于垂体前叶促进促性腺激素的分泌。文献报道在乳腺多种肿瘤细胞表面都有GnRH受体分布,这为GnRH作为大分子药物载体提供了科学依据。氧依赖性降解区域(oxygen-dependent degradation domain,ODD)可以控制缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)存在与否,在常氧条件下会通过羟化特定位点的脯氨酸,进而使HIF-1α被蛋白酶降解。缺氧是实体肿瘤的特征性病理改变,含有ODD的融合蛋白可以稳定存在。蓖麻毒素A链(Ricin Toxin A Chain,RTA)是蓖麻毒素的效应链,它是一种RNA特异性的N-糖苷酶,可催化核糖体60s亚基中28S rRNA的一个高度保守的环状结构脱去一个特殊的腺嘌呤(在大鼠中为A-4324位),从而使蛋白合成功能受阻,导致细胞死亡。本课题目的是以RTA作为抑制肿瘤细胞增殖的活性分子,利用GnRH、TAT以及VP22的作用将融合蛋白转运进入肿瘤细胞,并利用ODD的降解作用减轻RTA对正常细胞的毒性,提高融合蛋白对实体瘤的靶向性作用。构建pET28a-RTA、pET28a-VP22-RTA、pET28a-GnRH-RTA、pET28a-TAT-RTA及pET28a-VP22-ODD-RTA原核表达载体,转化大肠杆菌BL21,诱导RTA融合蛋白的可溶性表达,超声裂解表达后菌体,利用融合蛋白上的组氨酸标签进行亲和层析纯化目的蛋白,在分子、肿瘤细胞和动物整体水平研究融合蛋白的肿瘤抑制活性。实验方法:应用无细胞系蛋白合成抑制实验测定融合蛋白对蛋白合成的抑制作用;SRB法测定融合蛋白对肿瘤细胞生长的抑制作用;细胞免疫荧光法、细胞免疫化学法测定融合蛋白是否可以进入肿瘤细胞以及融合蛋白在细胞中的定位;应用流式细胞术测定融合蛋白诱导肿瘤细胞凋亡。以人肺腺癌细胞系A549细胞建立Bal b/c裸鼠荷瘤模型,将建模成功的荷瘤鼠分为四组,即TC (肿瘤对照组)组,RTA组,GnRH-RTA组和TAT-RTA组,用腹腔给药的方式(实验组融合蛋白3 mg/kg/天,对照组生理盐水200μL/只/天)测定融合蛋白在体内抑制肿瘤生长的作用,同时对荷瘤小鼠的血浆生化指标进行测定初步判断融合蛋白对动物的毒副作用。实验结果:①构建了pET28a-RTA系列原核表达载体,并利用该系列载体表达出可溶性的融合蛋白。②利用融合蛋白N端的His-tag,采用亲和层析的方法进行了RTA融合蛋白的纯化。③经细胞免疫荧光、细胞免疫化学分析表明融合蛋白GnRH-RTA,TAT-RTA可以进入A549细胞、MDA-MB-231细胞和H1299细胞。④经无细胞系蛋白合成抑制实验测定表明,融合蛋白RTA、GnRH-RTA、TAT-RTA、VP22-RTA和VP22-ODD-RTA均具有明显的蛋白合成抑制活性,抑制活性由高到低依次是:VP22-ODD-RTA、VP22-RTA、RTA、TAT-RTA、GnRH-RTA。⑤经SRB法测定表明GnRH-RTA、TAT-RTA、VP22-RTA和VP22-ODD-RTA在常氧和缺氧条件下都能够有效地抑制A549细胞的增殖,并且抑制细胞生长的作用随着蛋白浓度的增加而呈增强的趋势;其中TAT-RTA较其他RTA融合蛋白的抑制作用更强,VP22-ODD-RTA在常氧和缺氧条件下对A549的生长抑制作用没有明显的差别。SRB法还测定了融合蛋白对HepG2细胞、Hela细胞、MDA-MB-231细胞以及H1299细胞的增殖抑制作用。对HepG2细胞和Hela细胞:融合蛋白在常氧条件下对细胞均有增殖抑制作用,且成剂量依赖性,在缺氧条件下也都有增殖抑制作用,但无剂量依赖性;对H1299和MDA-MB-231细胞:融合蛋白在常氧和缺氧状态下均有生长抑制作用,在蛋白浓度大于10-7M时抑制作用较明显,其中TAT-RTA的作用比其他融合蛋白显着。同样,SRB实验结果表明VP22-ODD-RTA对HepG2、Hela、MDA-MB-231以及H1299细胞的作用在常氧和缺氧条件下无明显差别。⑥流式细胞术结果显示,在常氧状态下RTA系列融合蛋白可以随时间延长增加A549细胞早期凋亡的百分率,其作用在48 h最强,与培养基对照相比,TAT-RTA在给药48 h时可显着诱导A549细胞发生早期凋亡。⑦测量、计算各组实验动物瘤体体积发现,与对照组比较RTA、GnRH-RTA、TAT-RTA显示了较好的抑制瘤体生长的趋势,但是给药期间各组的动物体重分析表明RTA和TAT-RTA对实验动物的毒性较大,导致动物体重明显下降。⑨动物血浆生化指标测定结果表明,融合蛋白对动物的肝、肾功能都有不同程度的影响,以RTA和TAT-RTA最为明显。由上述结果得出如下结论:融合蛋白GnRH-RTA、TAT-RTA在体内和体外均有明显的抑制肿瘤生长的作用,但融合蛋白TAT-RTA因为没有细胞选择性,对动物的毒性作用较大。若融合蛋白可以增加对肿瘤细胞的靶向性,则有望开发成为新型的抗肿瘤药物。
李涛[3]2008年在《南蛇勒RIP的分离纯化及其抗肿瘤作用初步研究》文中研究指明核糖体失活蛋白(ribosome-inactivating protein,RIP)是一类广泛存在于植物界的毒蛋白,能破坏核糖体的结构,从而可以抑制蛋白质的生物合成。研究表明,RIP在抗病毒、抗肿瘤、免疫调节及抗生育、抗虫害等方面显示出良好的生物学活性,在医学、农业方面已展现出诱人的应用前景。本研究以云南德宏州生长的豆目苏木科植物南蛇勒(Caesalpinia minax Hance)的种子为原料,运用硫酸铵分级沉淀、C-25阳离子交换、Sephadax-G75凝胶层析等方法分离提取、纯化得到了一种较高纯度的南蛇勒蛋白,所获得的蛋白经SDS-PAGE电泳检测呈单一条带,其分子量约为29.64KD,实验表明该蛋白具有RNAN—糖苷酶活性,具有抗肿瘤活性。综合各方面信息,我们认定分离纯化出了一种新来源的核糖体失活蛋白——南蛇勒RIP。由于一般RIP表现出抗肿瘤的生物活性,本实验中以小鼠黑色素瘤细胞(B16细胞)和宫颈癌细胞(Hela细胞)为研究对象进行体外生物活性实验。结果表明,南蛇勒RIP对B16细胞和Hela细胞的增殖有显着的抑制作用,且呈现出明显的量—效关系和时—效关系。(1)在研究南蛇勒RIP对细胞增殖抑制活性的量—效实验表明,随RIP浓度的增加,对细胞的增殖抑制作用明显加强。作用48小时,南蛇勒RIP对Hela细胞的半抑制浓度IC_(50)约为145μg/ml,对B16细胞的半抑制浓度IC_(50)约为136μg/ml。(2)在研究南蛇勒RIP对细胞增殖抑制活性的时—效实验表明,RIP的抑制细胞增殖的能力随时间的延长而增强,在150μg/ml浓度作用情况下,细胞的增殖几乎处于停顿,72小时时对Hela细胞的抑制率为85.61%,对B16细胞的抑制率为88.91%,其对B16细胞系的体外增殖抑制作用较对Hela细胞系的抑制作用略强。(3)初步研究了南蛇勒RIP对B16细胞粘附作用的影响。结果表明:RIP对B16细胞系对ECM各成分的粘附作用不是很明显,在150μg/ml浓度下除能够减少B16细胞对胶原蛋白Ⅰ的粘附外(抑制率约20%),其余在误差范围内,作用不明显。
李霖, 邹伯英, 王文学, 朱德生[4]1997年在《蓖麻毒素修饰物脂质体的研制及其抗肿瘤作用》文中认为目的：为了降低蓖麻毒素（ＲＴ）的毒性，保留其抗肿瘤活性。方法：采用３－（２－吡啶二硫基）Ｎ－羟基丙酸琥珀酰亚胺酯（ＳＰＤＰ）修饰ＲＴ，用改良逆相蒸发法制备脂质体包裹ＲＴ修饰物，实验观察脂质体包裹前后ＲＴ修饰物急性毒性及体内外抗肿瘤活性。结果：脂质体包裹ＲＴ修饰物小鼠腹腔ＬＤ５０比原毒素大３．２３倍，体外对胃癌细胞（ＳＧＣ－７９０１）有较强的杀伤性，体内对Ｓ１８０实体癌的抑癌率５４．５％（Ｐ＜０．０１），能显着延长荷癌小鼠的存活期，（Ｐ＜０．０１）。结论：脂质体包裹ＲＴ修饰物的毒性较原毒素低，有较强的抗肿瘤活性，有进一步研究价值。
张小雪[5]2007年在《蓖麻油抗雌鼠生育作用活性物质的分离、分析及作用机理研究》文中研究说明鼠害是农业生物灾害中的主要灾种之一，是当今世界性灾害，给农业、林业、畜牧业等造成了巨大的经济损失。有效控制鼠害是保障农林牧业可持续发展的关键环节。目前，国内外鼠害防治以化学防治为主，主要是通过增加鼠的死亡率来控制害鼠的种群数量，但均无持效性，且灭鼠后的低密度时间最长仅维持一年左右，此后鼠密度逐渐上升而恢复至原有水平；传统灭鼠剂还存在对环境和其它生物有毒副作用和成本高等弊端。鉴于传统灭鼠措施存在的不足，一种新的鼠害控制策略逐渐受到重视，即从保持生态平衡的角度出发，寻求一种控制鼠类出生率的植物性不育剂，通过降低鼠类群体的繁殖率而实现降低群体密度，从而达到从根本上控制鼠害的目的，且对人类和其他动物、环境安全无害，效果持久。有关不育对鼠类种群繁殖力和数量影响的研究表明：不育能够取得灭杀的效果，若考虑不育的干扰作用，不育方法比灭杀更能控制鼠类种群数量的增加；不育控制鼠害的实验表明，雌性不育比雄性不育效果好，而双性不育比单性不育效果更好。在近年来兴起的植物不育剂的研究和开发中，许多植物源不育剂是针对抗雄鼠生育的，而抗雌鼠生育植物不育剂的研究和开发却较少见。其主要原因是在雌性不育剂有效成分的研发过程中，作为导向分离的筛选靶标较难确定，造成筛选抗雌鼠生育有效成分难度比较大。蓖麻油是大戟科植物蓖麻(Ricinus communis L．)种子的乙醚提取物(AEC)。在我国传统医学中，蓖麻油具有泻下通滞、消除痈疽肿毒、导泻等功能；临床上用蓖麻油抄鸡蛋进行催产已有多年的历史；在印度、朝鲜、约旦等国和一些非洲国家，妇女常常服用蓖麻籽及其提取物来进行避孕。有研究表明，蓖麻油具有抗雌鼠和雄鼠生育的作用，且其抗生育活性较强。为了研制新型的鼠类不育剂，本研究对蓖麻油抗雌鼠生育作用和作用机理进行了研究，建立了抗雌鼠生育活性物质的体外筛选方法，导向分离出具有较强抗雌鼠生育活性的晶体物质，并对这一抗雌鼠生育活性晶体物质进行了分析。本论文研究的结果既为开发高效、安全的植物源抗鼠生育药物提供有效药源，又为我国蓖麻资源的综合利用开辟了新途径，有利于提高蓖麻产业经济效益与社会效益；有利于为创制与环境相容的高效植物源生物鼠不育剂、开发出具有我国自主知识产权的新型植物源农药，奠定坚实的理论基础。本论文主要研究内容和结果如下：1、通过用蓖麻油在特定的时间内连续灌胃小鼠，统计怀孕率和胚胎数量，研究蓖麻油的抗早孕、抗着床作用。结果表明：20 mg/kg/d处理组小鼠受孕率降低不明显，但是小鼠所孕胎儿总数有一定的减少；40 mg/kg/d及其以上浓度的两个处理浓度小鼠受孕率明显降低，其生育抑制率分别达到：72.2％、88.2％和90％(与对照组比较，p<0.01)，个体所孕的胎儿数也明显减少；蓖麻油对小鼠的生育抑制作用有一定的量-效关系；在抗着床方面，40 mg/kg/d、80 mg/kg/d和160 mg/kg/d叁个处理组的子宫内着床位点明显减少，着床率明显降低，分别为：3/8、1/6和1/6；在抗早孕方面，从40 mg/kg/d处理浓度开始，小鼠怀孕率明显降低，生育抑制率显着提高；小鼠怀孕的胎儿数随着处理浓度的增加而减少；此外，蓖麻油处理组卵巢和免疫系统主要的器官脾和肾上腺指数变化不明显，但从40 mg/kg/d处理浓度开始，小鼠胸腺增大、胸腺指数增加。随着处理浓度的加大，胸腺指数增加得越显着(p<0.01)。2、采用灌胃蓖麻油后对小鼠动情周期、血清雌二醇(E2)、孕酮(P)等性激素水平和妊娠相关蛋白-A(pregnancy-associated plasma protein A，PAPP-A)变化情况，以及蓖麻油引起的未怀孕体质健壮小鼠的卵巢、输卵管和子宫结构变化进行研究，探讨蓖麻油抗生育活性的作用机理。结果表明：20mg/kg/d剂量蓖麻油处理组小鼠动情期的时间和表现与对照组比较均无明显区别；而40mg/kg/d及其以上处理组小鼠在动情期生理特征不明显，动情期缩短，动情间期延长且不规则。小鼠血清中的雌二醇(E2)水平无明显变化，而孕酮(P)含量有一定的升高；在20 mg/kg/d处理组，小鼠血浆中的PAPP-A稍微低于对照组；而从40 mg/kg/d处理剂量开始，PAPP-A值降低显着；且随着蓖麻油处理浓度的增加，PAPP-A值降低程度增大；蓖麻油40 mg/kg/d剂量处理组和以上浓度剂量处理组膨大子宫与正常对照未孕雌鼠子宫相比，其内腔扩大，子宫壁明显变薄；肌肉层比对照组薄，肌纤维排列疏松、紊乱：子宫基质层变薄，其内腺体减少；黏膜上皮增厚。3、通过用不同剂量蓖麻油处理原代培养大鼠蜕膜细胞和黄体细胞，观察细胞形态变化，同时用MTT法检测细胞活力，确定了蓖麻油抗雌鼠生育活性成分的作用靶标，首次建立蓖麻油抗生育有效成分的体外筛选方法。结果表明：400μg/mL及其以上浓度蓖麻油处理液对体外培养大鼠蜕膜细胞形态有明显的影响，400μg/mL蓖麻油处理液使部分离体培养蜕膜细胞体积比正常细胞明显减小、细胞内出现明显空泡，部分细胞胞浆皱缩、死亡。MTT法检测发现：400μg/mL及其以上处理浓度的蓖麻油对蜕膜细胞的生长有显着的抑制作用(p<0.05)；蓖麻油对蜕膜细胞的半抑制浓度(IC_(50))为568.6±5.3μg/mL，r=+0.9790；且这一抑制作用具有良好的量-效关系。而蓖麻油对黄体细胞活力的抑制作用不显着，仅仅表现在600μg/mL浓度蓖麻油处理24h的大鼠黄体细胞体积变小，细胞数量略有减少。用大鼠离体培养蜕膜细胞的活力测定方法作为蓖麻油抗雌鼠生育有效成分分离、提纯的活性跟踪指标是可行的。4、以原代培养大鼠蜕膜细胞(DSC)活力作为筛选靶标，首次导向分离蓖麻油(AEC)中的抗生育活性成分。经过皂化、乙醚萃取、乙醇重结晶和活力检测等步骤，获得一种对大鼠蜕膜细胞活力有抑制作用的无色晶体，其半抑制浓度(IC_(50))为63.84±3.04μg/mL，r=+0.9478。GC-MS分析和计算机相似性比较表明：无色晶体由5种成分组成，其中有4种成分为植物甾醇。5种成分分别是：麦角甾-5-稀-3-醇(Ergost-5-en-3-ol)，豆甾醇(Stigmasterol)，v-谷甾醇(γ-Sitosterol)、岩藻甾醇(Fucosterol)，和普罗布考(Probucol)类似物等。其中γ-谷甾醇(7-Sitosterol)的含量最高，达44.77％；其余组分的含量分别是：豆甾醇(Stigmasterol)占35.80％，岩藻甾醇(Fucosterol)占8.40％，麦角甾-5-稀-3-醇(Ergost-5-en-3-ol)占6.10％和普罗布考(Probucol)类似物占4.93％。根据实验结果和文献报道推测：γ-谷甾醇(7-Sitosterol)很有可能是抑制离体培养大鼠蜕膜细胞活力的主要成分；而豆甾醇(stigmasterol)可能起协助的作用。
樊慧[6]2016年在《苏云金芽胞杆菌Parasporin-5的真核表达及其抗肿瘤分子机制研究》文中进行了进一步梳理苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis;Bt)是一种在自然界中广泛分布的革兰氏阳性细菌,其在芽胞形成的后期伴有蛋白晶体的形成—伴孢晶体;因其伴孢晶体具有杀虫或抗肿瘤活性故被称为杀虫晶体蛋白(ICPs)或抗癌晶体蛋白(Parasporin或PS)。目前对Bt的研究已有一百多年历史,其杀虫晶体蛋白已经被广泛应用于各种生物防治。PS蛋白是近十多年来被发现的,因其化学结构独特、抗肿瘤谱广、毒副作用小等特点,PS蛋白的抗癌活性逐渐得到国内外学者的广泛关注。目前对PS蛋白的抗肿瘤作用靶标及分子机制尚不明确,还需要更深入的科学实验予以阐明。本研究采用哺乳动物细胞表达系统,通过将含PS5的重组质粒转染进细胞来研究其抗肿瘤活性。本研究合成了密码子优化后的PS5全基因序列并构建了其真核表达载体。当细胞被PS5重组质粒转染后,PS5蛋白在细胞内表达会导致细胞空泡化、细胞生长缓慢等现象,同时质谱结果表明细胞内所表达的蛋白为PS5蛋白。经DNA Ladder及凋亡相关蛋白检测结果表明PS5蛋白能诱导DNA片段化形成及PARP蛋白剪切,由此推测PS5蛋白可能引起细胞凋亡。通过激光共聚焦显微镜观察,发现PS5蛋白在细胞质中表达后大多数迁移至细胞核,并导致细胞的细胞核凝集,微管蛋白聚合,内质网结构不完整。为了研究PS5蛋白诱导细胞凋亡的分子机制,本研究采用免疫共沉降方法来筛选PS5蛋白相互作用蛋白。PS5共沉降蛋白经SDS-PAGE蛋白电泳分离后,筛选PS5特异性结合蛋白进行质谱分析。本研究筛选了ESYT1、KIF1A、DNTC1、AFAD、RHG05这五个有可能成为PS5蛋白受体的蛋白,这五种蛋白分别参与细胞内空泡形成和运输的各个步骤。这五种细胞内蛋白的作用需要进一步研究,本研究推测PS5蛋白通过作用于多种参与空泡形成的蛋白后诱导细胞凋亡。总之,本论文为研究PS蛋白抗肿瘤分子机制及靶向肿瘤治疗提供了新的方向和实验体系。
刘磊[7]2012年在《香菇C_(91-3)发酵菌丝体蛋白分离纯化鉴定及其抗肿瘤活性的研究》文中提出目的：我课题组近几年致力于香菇C91-3抗肿瘤活性蛋白的研究，发现香菇C91-3菌丝体发酵液、发酵液总蛋白及其分离组分蛋白，不仅体内能抑制肿瘤生长而且还具有显着的体外直接杀伤肿瘤细胞的作用。但是从大量发酵液中提取的蛋白其浓度、稳定性往往不能充分满足实验及以后生产需求。本实验在以往研究的基础上从香菇C91-3发酵菌丝体中提取总蛋白并进行分离纯化，以期获得大量具有高效抗肿瘤活性的单一蛋白，并对其氨基酸序列进行初步鉴定，为下一步基因工程表达以及临床应用奠定基础。方法：1.发酵菌丝体蛋白获取通过发酵罐发酵技术获得香菇C91-3菌丝体，利用匀浆、离心等方法得到发酵菌丝体蛋白粗提液，再通过(NH4)2SO4盐析、透析、冻干、凝胶过滤层析的方法对发酵菌丝体粗蛋白进行分离纯化，根据洗脱曲线利用SDS-PAGE电泳检测各管洗脱液中的蛋白质纯度和估计蛋白质的分子量，以初步评估获得的单一蛋白质成分。2.单一蛋白活性检测用四甲基偶氮唑蓝比色法（MTT）测定不同浓度10ug/mL、30ug/mL、100ug/mL单一蛋白对正常细胞（人胚胎肝、肺原代细胞）、肿瘤细胞（A549、Hca）作用24小时、48小时、72小时的细胞毒活性；利用流式细胞仪检测此叁个浓度单一蛋白对A549、Hca肿瘤细胞作用24小时，诱导肿瘤细胞早期凋亡和晚期凋亡及对A549细胞周期阻滞，分析其可能的抗肿瘤机制；利用电镜观察单一蛋白诱导A549细胞凋亡形态学改变。3.单一蛋白的氨基酸序列鉴定切割SDS-PAGE电泳胶内的单一蛋白条带，用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）测定单一蛋白肽质量指纹谱（PMF）通过Mascot在NCBI数据库中检索，对单一蛋白进行初步鉴定。结果：1.经匀浆、盐析、透析、冻干得到香菇C91-3发酵菌丝体粗蛋白，通过凝胶过滤层析，以8cm/h流速洗脱后，Microsoft Excel软件绘制洗脱曲线，得到4个洗脱峰；根据洗脱曲线用SDS-PAGE电泳测定洗脱峰3中各管洗脱液蛋白质成分单一，分子量约26kDa。2.MTT毒性实验表明单一蛋白具有体外明显抑制A549、Hca肿瘤细胞生长的活性，单一蛋白以10ug/mL、30ug/mL、100ug/mL的浓度作用于A549、Hca细胞，作用时间24h、48h、72h，对A549、Hca细胞的抑制作用随浓度增加、时间的延长而逐渐增强，抑瘤率相应的由17.23%、11.25%增加至76.21%、62.80%，各组之间比较差异有统计学意义（P<0.05）；对两组细胞的抑制作用在浓度10μg/mL时抑瘤率与均低于阳性对照DDP（5μg/mL）组，作用A549细胞在48h、72h，Hca细胞在72h差异显着（P<0.05）。作用A549细胞在浓度为30μg/mL、100μg/mL作用Hca细胞浓度为100μg/mL时其抑瘤率高于对照组，有显着性差异（P<0.05）。利用Annexin/PI双染色法，流式细胞仪检测单一蛋白诱导肿瘤的凋亡率，结果表明单一蛋白能诱导肿瘤细胞的凋亡，不同浓度单一蛋白作用于A549、Hca细胞24小时，随着蛋白浓度的增加，诱导A549、Hca细胞的早期凋亡率分别为3.62%、9.65%、19.71%，1.70%、4.91%、19.94%。早期凋亡率各组间比较差异有统计学意义（P<0.05）。用PI单染法，流式细胞仪检测单一蛋白不同浓度作用A549细胞的细胞周期分布，结果显示随着蛋白浓度增加G1期细胞逐渐增加，S期细胞减少，G2/M期细胞变化规律不明显，但总体变化不大。与对照组相比表现出G1/S期阻滞。单一蛋白浓度30μg/mL作用A549细胞24h，透射电镜观察肿瘤细胞亚细胞形态表现出细胞固缩、染色体边集、胞质内有空泡形成等凋亡形态。利用MTT毒性实验验证该蛋白对正常细胞（人胚胎肝、肺原代细胞）没有明显抑制作用，在作用浓度和时间上比较差异无统计学意义（P>0.05）。3.MALDI-TOF-MS测得单一蛋白PMF， NCBI数据库中检索无相匹配蛋白。初步证实其可能是一未知蛋白。结论：1.可以用匀浆的方法从香菇C91-3发酵菌丝体中提取蛋白，提取粗蛋白经盐析、透析、凝胶过滤层析分离纯化得到4组蛋白，其中第3组为成分单一的蛋白组分，分子量约26kDa。2.实验证实该单一蛋白体外对A549、Hca细胞的生长具有明显抑制作用。其抑制作用随单一蛋白浓度的增加及作用时间的延长而增强，呈浓度和时间的依赖性。流式细胞仪分析凋亡率和细胞周期，透射电镜观察细胞形态发现单一蛋白可能通过诱导凋亡及细胞G1/S期阻滞途径抑制肿瘤细胞生长。单一蛋白作用于正常人胚胎肺成纤维细胞、肝细胞未发现有明显抑制作用。3.单一蛋白PMF于NCBI数据库中检索无相匹配蛋白，初步证实其可能是一未知蛋白。
赵, 翀, 王玲, 谢蜀生, 龙振洲[8]1994年在《含蓖麻毒素A链的抗膀胱癌免疫毒素的制备及其抗肿瘤活性》文中认为含蓖麻毒素Ａ链的抗膀胱癌免疫毒素的制备及其抗肿瘤活性赵 ，王玲，谢蜀生，龙振洲（北京医科大学免疫学教研室，北京１０００８３）膀胱癌属腔内肿瘤。用抗膀胱癌单抗与蓖麻责素（Ｒｉｃｉｎ，ＲＴ）全分子偶联制备的免疫毒素（Ｉｍ－ｒｎｕｎｏｔｏｘｉｎ，ＩＴ）与高?..
周维国[9]2004年在《MSH-Ang重组毒素的构建及其抗肿瘤效应的实验性研究》文中认为头颈部由于具有特殊的解剖结构和生理特性，在治疗恶性肿瘤的临床实践中，对于发生在比邻重要解剖部位和具有早期转移特性的恶性肿瘤，手术及放化疗的效果都不理想，同时由于头颈部的特殊解剖结构，这些治疗往往造成患者的生存质量低下。随着分子生物学和肿瘤生物学的发展，导向药物成为近20年来治疗恶性肿瘤的重要方向。导向药物是利用某种对肿瘤细胞具有特异性结合能力的物质作为载体，将具有细胞毒性物质运输靶细胞，从而特异性杀肿瘤细胞而对其他正常细胞无毒性作用。这种载体—细胞毒性物质复合体就被称为导向药物。根据不同的构建方式，也被称为重组毒素或免疫毒素。作为导向药物的载体主要有：单克隆抗体或基因工程抗体片段；各种细胞因子，细胞表面因子；小肽激素等。这些物质都具有与某些肿瘤细胞特异性结合的能力，并且结合效率高。同时还有结构简单，易于应用基因工程方法与其他毒素基因连接的特点。毒性部分一般是采用化学毒素，细菌毒素和放射性毒素。Ang可以由载体定向带入靶细胞内，发挥其核糖体灭活的活性，抑制细胞蛋白质的合成，杀死靶细胞。载体和毒性部分的结合有两种方法：一是用化学方法将载体蛋白和毒性蛋白利用共价键连接，另外就是将载体基因和毒性部分基因定向连接，在不同系统中表达出融合蛋白。就目前的研究结果来看，基因水平的连接产生的融合蛋白具有性质稳定，易于大量制备等特点。从上世纪80年代开始，已有多种导向重组毒素构建成功，如<WP=80>美国FDA已批准正式应用临床。本实验目的是利用恶性黑色素瘤细胞表面MSHR高表达的特性，应用基因重组技术将α-MSH与细胞毒性物质人血管生成素（Ang）重组，并将其构建在PET-20b的表达系统中，在大肠杆菌BL21（DE3）Plyss中表达出融合蛋白MSH- Ang。这种融合蛋白同时具有MSHR的结合能力和Ang具有的诱发血管生成活性及 RNA酶活性来降解RNA，从而杀死细胞。经过疏水作用层析，离子交换层析，亲和层析纯化后，得到较纯的目的蛋白。应用纯化的MSH- Ang进行体外细胞毒性实验，分别将MSH- Ang加入黑色素瘤B16细胞，喉癌Hep-2细胞，胃癌BCG-823细胞及宫颈癌Hela细胞光镜下观察对喉癌细胞的培养液中，同时用BL21（DE3）Plyss空菌的表达产物及中国仓鼠卵巢细胞（CHO）作为对照，12小时后观察对细胞形态和数量。结果：基因测序结果表明重组MSH- Ang构建序列正确，表达出的融合蛋白占总蛋白的10%。并已建立可靠的纯化路线，经纯化后纯度可达到92%。对黑色素瘤细胞B16，喉癌细胞Hep-2细胞形态改变，折光率下降，甚至死亡，具有明显细胞毒性作用。此外，对胃癌细胞BCG及宫颈癌Hela细胞也具有杀伤作用，对照组细胞没有明显变化 。结论：本研究发现应用α-MSH作为导向弹头的重组毒素不仅对已知的高表达MSHR的肿瘤具有特异性杀伤作用，还对如鳞癌，胃癌等肿瘤具有明显毒性，是一种对多种常见肿瘤细胞具有杀伤功能导向毒素， 这可能与这些肿瘤表面也具有MSHR或类似受体如ACTHR有关。本研究还建立了MSH- Ang0的高效表达系统，其表达效率达到国际先进水平，并基本建立了切实可行的蛋白纯化路线，可达到92%以上，为今后开发特异性杀伤头颈部常见肿瘤的基因工程药物奠定了基础。
张黎黎[10]2009年在《苦瓜蛋白MAP30的克隆、表达及其抗病毒作用研究》文中研究指明研究目的通过分子生物学的方法从苦瓜中克隆和表达了MAP30,并对其在哺乳细胞内的转运途径和抗病毒机制进行了初步的研究,旨在揭示其抗病毒和抗肿瘤作用的机制。研究方法从成熟苦瓜种子中提取其基因组DNA,通过PCR的方法扩增出MAP30基因的全长,并将其连入原核表达载体pET30a,转入E coli BL21(DE3),IPTG诱导表达3-5 h,离心收集菌液,超声破碎分析上清和沉淀,并选用Ni-NTA进行亲和纯化。于浙江大学动物房购买健康的新西兰雄兔2只,用免疫学方法制备MAP30的多克隆抗体,初次免疫用1 mg MAP30和等量的弗氏完全佐剂,再次免疫用0.5 mgMAP30和等量的弗氏不完全佐剂每隔两周免疫一次,一共四次。免疫前,兔子耳缘静脉采血,分离血清为对照,免疫后血清ELISA法测抗体的效价,Western blot测抗体的特异性。采用MTT方法检测MAP30对肿瘤细胞和正常细胞的杀伤作用,并用此方法比较MAP30对转入HBV的HepG2细胞和其原型HepG2细胞的细胞毒性。分析MAP30、天花粉蛋白(Trichosanthin,TCS)、拉米夫定对HepG2.2.15的细胞毒性,选取其对细胞毒性最小的浓度范围进行HBV抑制的体外实验。ELISA方法检测MAP30、TCS、拉米夫定对HepG2.2.15细胞上清液中HBsAg、HBeAg的抑制作用,Real-time PCR方法检测其对HBV DNA的抑制作用。并在不同离子作用下,检测MAP30对DNA的切割作用。免疫电镜的方法观察MAP30在哺乳动物细胞内转运途径。研究结果通过PCR方法克隆出MAP30的基因,测序结果与文献报导的相符。通过IPTG诱导表达,得到了一条分子量约为34 kD的目的条带,以可溶性和包涵体两种形式表达,可溶性含量较多。上清经过镍柱亲和纯化,用不同浓度梯度的咪唑进行洗脱,在100 mM咪唑中洗脱下较纯的MAP30,透析除去咪唑,Bradford法测浓度后,过滤除菌,-20℃保存。ELISA法测抗体的效价为128000,Western blot测抗体的特异性发现除了34kD的目的条带外,还有一条分子量约为MAP30两倍的条带,经检测,其为MAP30的二聚体。MAP30对肿瘤细胞Hela、HepG2的毒性远大于对正常细胞LO2的细胞毒性,SPSS软件计算MAP30对癌细胞HepG2和Hela细胞的IC50分别为8.28μg/ml和6.92μg/ml;对LO2细胞,MAP30的IC50大于400μg/ml。MAP30对转入HBV的HepG2.2.15细胞毒性要小于原型HepG2细胞。在浓度为0.1-100μg/ml下,MAP30、TCS、拉米夫定对HepG2.2.15的细胞毒性均低于15%。在此浓度下,MAP30、TCS、拉米夫定对HepG2.2.15上清液中HBsAg、HBeAg和HBV DNA均有抑制,其抑制作用具有剂量依赖性。MAP30能将超螺旋DNA切割成缺口环状或线性DNA,并具有剂量依赖性。在不同离子作用下,MAP30对DNA的切割作用不同。免疫电镜的方法直接观察到了MAP30在细胞内主要集中于细胞核。MAP30作用细胞后,电镜观察到细胞自噬体形成。结论MAP30对肿瘤细胞的毒性大于对正常细胞的细胞毒性。MAP30对转染HBV的HepG2.2.15细胞的毒性要小于原型HepG2细胞的细胞毒性。在低毒性剂量下,MAP30具有抑制HBV的作用,其抑制作用具有剂量依赖性。MAP30进入细胞后,可以运输进入细胞核,从而干扰病毒的复制,其可能的作用机制为MAP30对细胞核内的DNA的切割作用。MAP30作用细胞后,有可能诱导细胞自噬。
参考文献：
[1]. 蓖麻毒素的提取和纯化及其抗肿瘤作用的研究[D]. 邹立波. 浙江大学. 2002
[2]. RTA系列融合蛋白的表达及其抗肿瘤功能研究[D]. 门金闩. 中国人民解放军军事医学科学院. 2010
[3]. 南蛇勒RIP的分离纯化及其抗肿瘤作用初步研究[D]. 李涛. 昆明理工大学. 2008
[4]. 蓖麻毒素修饰物脂质体的研制及其抗肿瘤作用[J]. 李霖, 邹伯英, 王文学, 朱德生. 癌症. 1997
[5]. 蓖麻油抗雌鼠生育作用活性物质的分离、分析及作用机理研究[D]. 张小雪. 四川大学. 2007
[6]. 苏云金芽胞杆菌Parasporin-5的真核表达及其抗肿瘤分子机制研究[D]. 樊慧. 湖南师范大学. 2016
[7]. 香菇C_(91-3)发酵菌丝体蛋白分离纯化鉴定及其抗肿瘤活性的研究[D]. 刘磊. 大连医科大学. 2012
[8]. 含蓖麻毒素A链的抗膀胱癌免疫毒素的制备及其抗肿瘤活性[J]. 赵, 翀, 王玲, 谢蜀生, 龙振洲. 中国免疫学杂志. 1994
[9]. MSH-Ang重组毒素的构建及其抗肿瘤效应的实验性研究[D]. 周维国. 吉林大学. 2004
[10]. 苦瓜蛋白MAP30的克隆、表达及其抗病毒作用研究[D]. 张黎黎. 浙江大学. 2009
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