目的：研究红花黄色素氯化钠注射液和阿司匹林与血清蛋白的结合及两者联用的影响。方法：采用平衡透析法和高效液相色谱法测定药物与小牛血清蛋白结合率。结果：10μg/ml红花黄色素经平衡透析24h，处理上样后，测得羟基红花黄色素A的血清蛋白结合率为（3.33±1.53）%，且当红花黄色素浓度低于10μg/ml，噪音较大，HPLC检测灵敏度显著降低；阿司匹林（2.5μg/ml）平衡透析24h，水解产物水杨酸与血清蛋白结合率为（73.39±3.26）%，依次加入不同浓度比例（与阿司匹林浓度比例为1:1、1:0.5、1:0.25）的红花黄色素氯化钠注射液后，水杨酸的血清蛋白结合率分别为（71.31±5.46）%、（71.07±4.24）%、（72.76±4.62）%。结论：红花黄色素经平衡透析处理后，浓度低于10μg/ml时，HPLC检测灵敏度低，噪音较大，无法进行积分；阿司匹林在一定浓度范围内，依次加入不同浓度比例的红花黄色素氯化钠注射液，阿司匹林水解产物水杨酸的蛋白结合率下降不明显，与阿司匹林组比较无统计学差异。
【关键词】红花黄色素；阿司匹林；小牛血清；高效液相色谱法；平衡透析法
[ 中图分类号 ]R2[ 文献标号 ]A[ 文章编号 ]2095-7165（2018）15-0030-02
药物进入血液循环后，因结构上的差异，部分药物和血液中的成分（如血细胞、血浆蛋白等）结合形成结合型药物，而未被结合的部分则称为游离型药物。结合型药物由于分子变大，不易透膜而“储存”于血液中。不同的药物有不同的血浆蛋白结合率，血浆蛋白结合率高的药物因其与血浆蛋白较高的亲和力、较多的蛋白结合点，能将蛋白结合率低的药物置换出来，使游离型药物的增多，一定浓度内能增强药理作用。红花黄色素作为传统医学的活血化瘀类中药，应用广泛，具有良好的社会、经济效益。其临床上已经广泛用于冠心病、急性脑梗死、心绞痛等。阿司匹林（ASP）是解热镇痛抗炎药，大剂量阿司匹林能抑制血管内皮细胞合成PGI2，促进血小板聚集和血栓形成，而小剂量的阿司匹林（75~150mg/d）能够预防血栓形成，临床运用这一特点，使其作为活血药使用，增加血管的血流量，抑制血小板聚集[1]。对院内使用红花黄色素注射液合并用药进行统计后发现,与阿司匹林的联用率最高。红花黄色素粉针剂中羟基红花黄色素A(HSYA)血浆蛋白结合率在78%左右[2]，且不具有质量浓度依赖性。阿司匹林进入人体，代谢产物水杨酸以盐的形式存在，具有药理活性，水杨酸盐(AS)的血浆蛋白结合率在80%~90%之间。本实验从药物与血清蛋白结合的角度出发，采用平衡透析和分子对接的方法研究羟基红花黄色素A对水杨酸盐的血清蛋白结合率的影响，为临床药物相互作用提供实验依据。
1材料与方法
1.1实验材料
1.1.1药品与试剂 红花黄色素氯化钠注射液，山西华辉凯德制药有限公司生产，批号为513020652，浓度为150mg/瓶；阿司匹林，中国食品药品检定研究院生产，批号为100113-201405，纯度为99.8%；水杨酸，上海源叶生物科技有限公司生产，批号为J22S6J3607，纯度为98%；小牛血清，浙江天杭生物科技有限公司生产；甲醇（色谱纯），乙腈（色谱纯），美国Tedia公司生产；四氢呋喃（色谱纯），永华化学科技（江苏）有限公司生产；乙酸（色谱纯），磷酸（色谱纯），天津市科密欧化学试剂有限公司生产，其余试剂均为分析纯。
1.1.2仪器 Waters2695e高效液相色谱仪，BSA224S-CW电子天平， IKA Vortex2涡旋仪，eppendorf centrifuge 5417R台式微量冷冻离心机，KQ-500E型超声波清洗器，真空浓缩仪，Safe Tamp恒温水浴摇床，透析袋（截留相对分子量7000，BIOSHARP）。
1.2实验方法
1.2.1色谱条件 阿司匹林与水杨酸的色谱条件：C18色谱柱（4.6mm×250mm,5μm），流动相C为乙腈-四氢呋喃-醋酸-水（20:5:5:70），检测波长为303nm，柱温35℃，流速1ml/min。
1.2.2磷酸盐缓冲液（透析液）配制 每1000ml内含磷酸二氢钠3.12g、氯化钠8.8g，1mol/L氢氧化钠溶液调PH至7.4，既得0.02mol/L的磷酸盐缓冲液。
1.2.3阿司匹林与血清蛋白的结合率测定
1.2.3.1样品溶液的制备 精密称取阿司匹林2.8mg，乙腈溶解制备成2.5mg/ml的储备液；精密吸取浓度为800μg/ml的红花黄色素氯化钠注射液适量，透析液稀释成400μg/ml的储备液；精密称取水杨酸标准品5mg，乙腈溶解制备成1mg/ml的储备液。用乙腈稀释水杨酸储备液配制成1000、400、200、100、40、20、10、5μg/ml标准系列溶液Ⅰ；取透析液稀释水杨酸储备液配制成5、4、2、1.5、1、0.5、0.25、0.125μg/ml标准系列溶液Ⅱ。
1.2.3.2样品预处理 阿司匹林透析液样品预处理：精密取血清（透析内液）或透析外液500μl，加1ml甲醇萃取，涡旋振荡3min，12000r/min离心15min，取上清600μl，真空浓缩至干，200μl 1%醋酸-甲醇复溶，超声5min助溶，12000r/min离心15min，取上清100μl超声脱气，进样分析。
1.2.3.3药物与蛋白结合率测定 全新半透膜袋经纯水煮沸15min处理，泡透析液备用。取1 mL小牛血清加入袋内，置于20 mL透析液，恒温37℃、150r/min透析24h。吸取透析外液0.5 mL，加入等量3%三氯醋酸溶液，检查是否有白色絮状物析出。若有,则说明透析袋有蛋白漏出，此样品作废，取蛋白未漏出者测定。血清蛋白结合率=(D1-D2)/D1×100%。D1为透析袋内血清药物浓度，D2为透析外液药物浓度。
1.2.3.4水杨酸的精密度、回收率测定 取20、10、5、2、1、0.5μg/ml水杨酸血清样品和5、4、2、1.5、1、0.5μg/ml水杨酸透析液样品，按1.2.3.2项下样品预处理操作，参考文献[3]，计算日内精密度、日间精密度、提取回收率。日间精密度:同一天不同时间测得的值求相对标准偏差( relative standard deviation , RSD)值；日内精密度：连续3d测得的值求RSD值；提取回收率 =R测/R真（R测表示用甲醇萃取后测得的水杨酸浓度 ,R真表示投入的水杨酸的实际浓度）。
1.3统计学方法 实验数据采用 Microsoft Excel Students t-test处理,结果用 表示。P <0.05表示差异有统计学意义 。
2.结果
2.1吸光度考察 对AS标准品进行全波长扫描，观察目标峰（13分钟左右）在240nm与303nm处峰形较好，但240nm处溶剂峰较大，对目标峰影响较大，因此选择303nm测定。
图2 AS的方法专属性考察
A 水杨酸（AS）标准品 B 阿司匹林（ASP）标准品 C 空白血清 D 空白透析液 E 1%醋酸甲醇 F 透析内液样品
1、水杨酸 2、乙酰水杨酸 3、血清峰
2.3线性关系的考察
2.3.1水杨酸在血清中的标准曲线 标准系列溶液Ⅰ与20倍量小牛血清混合，按1.2.3.2样品预处理项下方法处理，进行分析。以浓度（μg/ml）为横坐标，以峰面积为纵坐标做线性回归，得到水杨酸在血清中的标准曲线为：y=28146x-17133，R2=0.997（n=8），线性范围是0.25~50μg/ml。
2.3.2水杨酸在透析液中的标准曲线 标准系列溶液Ⅱ，按1.2.3.2样品预处理项下方法处理，进行分析。以浓度（μg/ml）为横坐标，以峰面积为纵坐标做线性回归，得到水杨酸在透析液中的标准曲线为：y=27083x-1693.2，R2=0.9991（n=7），线性范围是0.25~5μg/ml。
2.3.3精密度
日间精密度：AS在透析液与血清中的日内精密度小于5%、日间精密度小于10%。见表1。
表1 AS在缓冲液和血清中的精密度
2.3.4回收率 不同浓度的AS在缓冲液和血清中的提取回收率较稳定。见表2。
表2 AS在缓冲液和血清中的提取回收率（%）
2.5黄花黄素色平衡透析浓度选择 当红花黄色素浓度为10μg/ml，血清蛋白结合率为（3.33±1.53）%，距文献78%的结合率相差巨大，但降低浓度发现，基线噪音大，HPLC对其检测灵敏性低，推断无法用HPLC对红花黄色素平衡透析样品进行低浓度检测。
2.6阿司匹林平衡透析浓度选择 考察低、中、高三种质量浓度下（1.25、2.5、5μg/ml）阿司匹林的血清蛋白结合率分别为（76.16±1.10）%、（75.57±0.72）%、（71.60±4.73）%，经过T检验分析，无统计学差异，表明在1.25~5μg/ml范围内，浓度因素对阿司匹林的血清蛋白结合率无显著性影响。
3.讨论
实验结果表明阿司匹林与红花黄色素注射液无明显的血浆蛋白竞争结合情况，因此在临床上阿司匹林与红花黄色素联用时无需考虑两药的药动学相互作用。两药联合使用对其各自的血药浓度及游离血药浓度无。显影响。可根据患者的具体病情选择单用或联合使用两种药物，但两药联用的药效学相互作用仍有待明确。
参考文献
[1] 朱依淳，殷明. 药理学[M].第7版.北京:人民卫生出版社，2011:315
[2] 王建明，邹恬，张媛媛，等. 红花黄色素粉针剂中羟基红花黄色素A血浆蛋白结合率的研究[J]. 中成药, 2011, 33(6):947-949.
2015年太仓市应用基础研究计划，项目编号TC2015YYYLO2
2015年苏州市科技发展计划，项目编号SYS02015150
论文作者:沈丹丹1*,杨忠慧1,黄吉1,杨菲2,林紫薇2,偶
论文发表刊物:《医师在线》2018年第15期
论文发表时间:2018/11/12
标签：血清论文; 水杨酸论文; 黄色素论文; 阿司匹林论文; 浓度论文; 蛋白论文; 红花论文; 《医师在线》2018年第15期论文;