李远华[1]2003年在《茶树β-葡萄糖苷酶基因克隆、表达和分布定位》文中指出茶树体内的各种物质代谢、能量传递、信息转录以及生长发育等都必须有酶的参与，酶对茶叶品质形成具有重要意义，酶学研究是茶叶的重要理论。而β—葡萄糖苷酶与茶叶香气有关，香气是衡量茶叶品质好坏的重要指标之一。 β—葡萄糖苷酶属于水解酶类，存在于自然界许多植物体，还存在于一些酵母、曲霉菌、木霉菌属及细菌体内。它的特性是可水解结合于未端、非还原性的β-D-糖苷键，同时释放β-D-葡萄糖和相应的配基；此外还能微弱地水解对硝基苯-β-D-半乳糖和β-D-木糖苷。在纤维素的糖化作用中，β-葡萄糖苷酶功能是将纤维素二糖和纤维素寡糖水解成葡萄糖。根霉能在许多种纤维素物质上生长，正是由于它能产生包括β-葡萄糖苷酶在内的多种纤维素酶所致。 在茶叶上研究主要是该酶与萜烯类香气前驱体有密切关系，使糖苷键合态变成游离态。对茶叶中β-葡萄糖苷酶的研究，最早是1981年Takeo T利用茶叶匀浆试验，发现茶叶匀浆添加β-葡萄糖苷酶后，亦能产生芳樟醇和香叶醇，证实茶叶中存在以葡萄糖苷形式存在的单萜烯醇。目前对茶树β-葡萄糖苷酶的研究已深入到其与茶树品种、生态因子、加工工艺上。从分子生物学水平，研究β-葡萄糖苷酶基因克隆和表达，在燕麦、蜀黍、旱金莲、长春花、黄檀等许多植物中都有报道，但在茶树上至今国内外未见报道。 本实验针对β-葡萄糖苷酶研究现状，主要从以下几方面来研究：茶树β-葡萄糖苷酶cDNA的克隆及在原核中表达，茶树中β-葡萄糖苷酶基因mRNA表达和分布定位情况。 茶树β-葡萄糖苷酶cDNA的克隆，主要采用江昌俊等人方法提取茶树RNA和Gibco公司3′／5′RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends试剂盒进行，研究结果表明，茶树β-葡萄糖苷酶cDNA全长序列1475bp，该序列的ORF由1350个核苷酸组成，编码450个氨基酸，5′非翻译区(5′-UTR)与3′非翻译区(3′-UTR)分别为33个和92个核苷酸组成。信号肽由28个氨基酸组成。预测序列氨基酸功能结构域有：4个N-豆蔻酰化位点(NSTK~(202)、NFTK~(206)、NRTQ~(238)、NRSS~(307)，5个蛋白激酶C的磷酸化位点(SNR~(185)、STK~(202)、TSK~(247)、TLR~(270)、STR~(371))，2个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点(SIVF~(112)、TLNE~(350))，5个N-糖基化位点(GGHASK~(67)、GQASGS~(281)、GIRCCR~(288)、GGLCAA~(317)、GQKGSG~(331))。其核苷酸序列同安徽农业大学博士学位论文:中文摘要源性分析，与一些木本植物有比较高的相似性。与草本植物相对更低。从推导出的氨基酸序列保守性来看，第88、420、614有氨基酸残基的G，第204个氨基酸残基Y，第345个氨基酸残基I，其氨基酸序列完全保守，另有10%左右序列与部分植物比较一致。从系统进化树来看，茶树与黄檀植物亲缘关系最近，与鼠耳芥中的一个种类(AY045953)和小干松也比较相近，与大麦植物关系较远，而与玉米中的一个品种(U25157)关系最远，反映了茶树与这些植物物种间差异较大。预测茶树母一葡萄糖昔酶二级结构可以形成14.33%的a一螺旋、25.43%的日一折迭。 茶树p一葡萄糖昔酶在原核中表达，主要采用Novagen公司菌株点co1z’ BL21trxB (DE3)和表达载体pET一32a进行p一葡萄糖昔酶表达，酶活性测定参考张正竹的方法。研究结果显示，实际诱导表达的茶树p一葡萄糖昔酶成熟蛋白分子量为37KDa，pET一32a/Mp一Glc融合蛋白在工PTG诱导3h的表达量最高，表达量占菌体总蛋白的32.2%，表达的蛋白经测定具有正常的生物学活性。在诱导0h时没有表达蛋白，诱导o.sh时表达的蛋白量很少，诱导lh、2h时表达量逐渐增加，诱导4h、7h时表达量也基本稳定在3h的水平，表达量没有明显增多。不同培养温度对表达蛋白也有影响，在Ilnmol.L一‘工PTG诱导3h，45℃与37℃表达量差不多，26℃比37℃表达量要少，26℃表达蛋白量在工PTG诱导3h时仅37℃的1/10。采用0.1、0.5、Ilnmol.L一‘工PTG叁种浓度诱导表达，37℃同样诱导3h，表达蛋白量差异不大。不同部位的表达蛋白存在形式来看，培养基组分中没有发现目的蛋白，周质中也没有发现有表达蛋白，而原核细胞中可溶性细胞质蛋白和不可溶的细胞质蛋白却有较多的表达，其中可溶性细胞质蛋白比不溶性多些，可溶性细胞质蛋白占表达总蛋白的3/5，不可溶的细胞质蛋白占表达总蛋白的2/5。 茶树p一葡萄糖营酶mRNA变化研究，采用Roche公司地高辛RNA标一记试剂盒，原位杂交过程参考武汉博士德公司的方法。表达结果茶树叶片的p一葡萄糖昔酶mRNA表达主要部位在栅栏组织，上表皮、下表皮、海绵组织等其它的组织则只有较弱的表达信号;叶片栅栏组织mRNA表达分布，在细胞核表达信号强，清晰、色明，细胞质部分有表达信号，其中包括液泡等部分细胞质没有表达信号;叶片的海绵组织内，细胞核有表达信号，但比栅栏组织弱，少部分的细胞质有表达信号;叶片上表皮细胞核有弱表达信号，细胞质只有少部分有表达信号;叶片下表皮细胞核有弱表达信号，细胞质部分有表达信号。茶树叶主脉的p一葡萄糖营酶基因mR琳表达部位在薄壁组织，韧皮部也很难观察到表达安徽农业大学博士学位论文:中文摘要信号，而上、下表皮和?
张娴静[2]2012年在《不同工艺铁观音香气形成的生化及分子生物学机制研究》文中研究表明铁观音是乌龙茶中的极品，其以香气独特驰名中外，关于铁观音香气形成的化学机制研究尚多，而其酶学、分子生物学机制的研究鲜有报道。本研究以铁观音为供试材料，研究了铁观音香气形成的生化及分子生物学机制研究。通过对不同工艺各加工工序铁观音香气总量、组分、成分的测定与分析，探讨不同工艺铁观音香气总量、组分、成分的动态变化；通过对不同工艺各加工工序铁观音β-glucosidase活性测定与分析，探讨不同工艺铁观音β-glucosidase活性的动态变化及其与香气总量、组分、成分间的相关性；克隆了铁观音茶树香气相关基因cβ-glucosidase并对其相关的生物信息进行预测和分析；开展不同工艺各加工工序铁观音β-glucosidase基因的定量表达与分析。综合分析铁观音香气变化及其与β-glucosidase活性、基因表达间的相关性，揭示铁观音香气形成的机理。研究结果如下：1.不同工艺铁观音香气的动态变化探讨不同工艺铁观音香气的动态变化。结果表明，(1)晒青阶段：低温轻发酵做青工艺中“轻晒青”阶段，铁观音主要赋香成分均有所增加，其中有效促进了α-法尼烯、β-紫罗酮、香叶基丙酮、茉莉酮、雪松烯等主要香气成分大量形成；传统自然做青工艺中“重晒青”同样促进铁观音主要赋香成分形成，其增加幅度不及“轻晒青”。(2)摇青阶段：低温轻发酵做青工艺中“轻摇青”阶段，铁观音主要赋香成分均有所增加，其中有效促进了橙花叔醇、α-法尼烯、β-紫罗酮、香叶基丙酮、茉莉酮、丁酸反-2-己烯酯、苯甲酸叶醇酯大量形成；传统自然做青工艺中“重摇青”在促进铁观音主要赋香成分形成的同时，有效促进了橙花叔醇、α-法尼烯、β-法尼烯、雪松烯、L-薄荷醇、β-紫罗酮、香叶基丙酮、丁酸反-2-己烯酯、苯甲酸叶醇酯、乙酸苯乙酯、己酸己酯大量形成；传统自然做青工艺中“重摇青”铁观音香气峰面积总值为低温轻发酵做青工艺中“轻摇青”的1.39倍，则“重摇青”较“轻摇青”更有效地促进铁观音香气的形成。(3)摊青阶段：低温轻发酵做青工艺中“长时薄摊青”的整个过程，有效促进了β-榄香烯、茉莉酮、丁酸反-2-己烯酯、乙酸苯乙酯、2-丙基-1-庚醇大量形成，摊青24h以后，香气总量虽达到最高值，但主要特征香气成分如橙花叔醇、α-法尼烯含量有所减少；传统自然做青工艺中“短时厚摊青”发酵过程中各主要特征香气成分含量与摇青结束时基本保持同一水平。2.不同季节、不同风格铁观音成品茶香气差异探讨不同季节、不同风格铁观音成品茶香气差异。结果表明，(1)不同季节铁观音香气差异：秋季加工铁观音在各香气组分含量上均高于春季加工铁观音，该季节加工铁观音成品茶的橙花叔醇、α-法尼烯、丁酸反-2-己烯酯、乙酸苯乙酯、茉莉酸甲酯、己酸己酯、吲哚、香叶基丙酮、β-紫罗酮、茉莉酮、二十烷等特殊香气成分含量显着高于春季加工铁观音成品茶。(2)不同风格铁观音香气差异：清香正韵型、青韵型、显酸型成品茶及传统浓香型铁观音茶坯香气组分均以醇类、烯类化合物为主，其共有的重要香气成分为橙花叔醇、α-法尼烯、丁酸反-2-己烯酯、乙酸苯乙酯、β-紫罗酮且含量较高；传统浓香型铁观音主要香气成分橙花叔醇、α-法尼烯、丁酸反-2-己烯酯、己酸己酯、吲哚、香叶基丙酮、苯甲酸叶醇酯、二十烷含量高于清香型铁观音；清香正韵型铁观音主要香气成分α-法尼烯、二十烷、β-法尼烯含量高于其他风格铁观音，α-法尼烯高于清香青韵、显酸型；清香青韵型顺罗勒烯含量较为突出；清香显酸型乙酸苯乙酯、茉莉酮、3,7-甲基-1,5,7-叁辛烯-3-醇、雪松烯含量较突出。3.不同风格铁观音成品茶香气成分与感官审评的关系分析了铁观音成品茶香气成分与感官审评的关系。结果表明，传统浓香型铁观音橙花叔醇、α-法尼烯2种重要特征香气含量最高，其他多种香气成分含量均高于清香型铁观音，由此其香气浓度、强度、持久性表现优异，而清爽度、纯度较差；清香正韵型铁观音橙花叔醇、α-法尼烯2种重要特征香气含量高于清香青韵、显酸型，而丁酸反-2-己烯酯、乙酸苯乙酯、吲哚、茉莉酸甲酯、己酸己酯、β-紫罗酮、顺-罗勒烯等多种香气含量低于其他风格铁观音，由此其香气纯度、清爽度表现优异；清香青韵型香气成分含量居中为多，由此其香气表现不突出；清香显酸型香气总量最高，但其橙花叔醇、α-法尼烯2种重要特征香气含量较低，而其他多种香气成分含量均高于其他风格铁观音，由此其香气浓度虽好，但纯度、清爽度、强度均较差，略有闷杂特征。研究得出铁观音主要赋香成分为橙花叔醇、α-法尼烯、丁酸反-2-己烯酯、乙酸苯乙酯、吲哚、茉莉酸甲酯、己酸己酯、香叶基丙酮、苯甲酸叶醇酯、β-紫罗酮、顺-罗勒烯、二十烷、茉莉酮、β-法尼烯、3,7-甲基-1,5,7-叁辛烯-3-醇、雪松烯等。而铁观音香气给予品茗者“如花带果”感受的化学依据在于：似兰花香，如茉莉酸甲酯；似桂花香，如顺-罗勒烯及多种单萜类和倍半萜类物质；似栀子花香，如芳樟醇、香叶醇、苯甲酸甲酯；似梅花香如乙酸苯甲酯；似蜜桃香，如内酯。已测得铁观音香气成分或与其相同，或经异构、转化能形成该类香气，由此作为铁观音形成浓郁花果香气的化学依据。4.不同季节、不同工艺、不同叶位铁观音β-glucosidase酶活性变化差异讨探了不同季节、不同工艺、不同叶位铁观音β-glucosidase酶活性变化差异。结果表明，不同季节铁观音β-glucosidase酶活性变化差异如下：低温轻发酵做青工艺下，春季铁观音成熟叶β-glucosidase酶活性可达秋季铁观音的1.4-2.6倍，其变化辐度大于秋季，而两季铁观音成熟叶β-glucosidase酶活性变化趋势略有不同，摊青期间两者酶活性表现为“此起彼伏”变化特点；传统自然做青工艺下，春季铁观音β-glucosidase酶活性可达秋季铁观音的1.7-2.2倍，且春季酶活性变化辐度大于秋季，而两季铁观音成熟叶β-glucosidase酶活性的试样变化趋势一致。由此可知，春季铁观音成熟叶β-glucosidase酶活性远高于秋季铁观音，其变辐大于秋季。不同工艺铁观音β-glucosidase酶活性变化差异如下：低温轻发酵工艺下铁观音β-glucosidase酶活性高于传统自然做青工艺；春季不同工艺铁观音β-glucosidase酶活性变化趋势较一致，即晒青阶段有所上升，摇青阶段呈“降-升-降-(升)”的波形变化趋势，摊青至4-5h酶活性下降而后上升；秋季不同工艺铁观音β-glucosidase酶活性变化趋势有此消彼长的变化特点，且传统自然做青工艺变辐大于低温轻发酵做青工艺。不同叶位铁观音β-glucosidase酶活性变化差异如下：春季不同叶位铁观音β-glucosidase酶活性高低差异不明显，而秋季不同叶位铁观音β-glucosidase酶活性高低表现为成熟叶>老叶>嫩叶；春秋两季、轻重做青的铁观音不同叶位β-glucosidase酶活性多数在摇青前中期达到最高值；春秋两季铁观音嫩叶位β-glucosidase酶活性在不同工艺下酶活性变辐均较大。5.铁观音cβ-glucosidase克隆从铁观音中克隆出cβ-glucosidase片段，该cDNA序列长度1477bp，包含开放阅读框(ORF)共有1284个碱基组成，编码428个氨基酸。在3’RACE与保守区重迭碱基数为267bp，非编码区3’RACE有186bp，与其他植物同源60%-80%。已将该基因序列登录GenBank，登录号为HQ679938.2。6.铁观音cβ-glucosidase生物信息学分析分析了铁观音cβ-glucosidase相关生物信息。结果表明，铁观音cβ-glucosidase蛋白属于碱性、稳定、亲水蛋白。铁观音cβ-glucosidase定位细胞质，存在跨膜结构域，属于跨膜蛋白，但由于没有信号肽即为非分泌蛋白。另外，其磷酸化位点有20个，其中在C末端有Ser磷酸化位点，预测Ser磷酸化可能与铁观音cβ-glucosidase蛋白构象变化、核定位调节、细胞周期之间存在的密切联系。7.不同工艺铁观音cβ-glucosidase的表达量差异探讨了不同工艺铁观音cβ-glucosidase的表达量差异，结果显示：在低温轻发酵、传统自然做青工艺中，晒青及摇青阶段cβ-glucosidase相对表达量逐步增加，晒青期间该基因的相对表达量与鲜叶比较差异不显着，摇青结束其变化达到极显着水平；而摊青前期表达量变化不显着，至摊青时间达6-10h，cβ-glucosidase相对表达量均达到最高值，与鲜叶、晒青叶、摇青叶的相对表达量比较，差异均达到极显着水平。综上说明铁观音加工工艺促进了cβ-glucosidase的表达，摊青至一定程度该基因表达信号最强，表达量最高，随着摊青的延续，基因表达减弱。8.不同工艺铁观音香气变化、β-glucosidase酶活性、基因定量表达的相关性探讨了不同工艺铁观音香气变化、β-glucosidase酶活性、基因定量表达的相关性。结果表明，不同工艺铁观音β-glucosidase酶活性与香气变化关系表现为：β-glucosidase酶活性与香气含量成指数负相关。低温轻发酵做青工艺及传统自然工艺中，铁观音成熟叶β-glucosidase酶活性与香气总量、醇系香气含量、特征香气橙花叔醇含量的关系表现为：晒青阶段酶活性的提高伴随着香气总量、醇系香气含量、特征香气橙花叔醇含量的提高；摇青前期酶活性大幅上升而伴随着游离态芳香物质的大量生成；摊青阶段，酶活性的变化趋势与香气的变化趋势基本一致。不同工艺铁观音cβ-glucosidase定量表达与酶活性关系表现为：在低温轻发酵做青工艺、传统自然做青工艺中，晒青阶段cβ-glucosidase相对表达量有所增加，酶活性也显着上升；摇青结束相对表达量持续增加，而酶活性显着下降；摊青阶段，铁观音基因相对表达量与酶活性邻间变化率正负值相同，则两者的变化趋势一致。不同工艺铁观音cβ-glucosidase定量表达与香气变化关系表现为：在低温轻发酵及传统自然做青工艺的晒青及摇青阶段，cβ-glucosidase相对表达量与香气峰面积总值、醇系香气峰面积值、橙花叔醇峰面积值均保持不断上升的趋势；摊青过程，基因相对表达量与香气峰面积总值变化趋势保持一致，而摊青后期基因表达量的显着变化没有引起醇系香气成分的相应变化，而是略呈此消彼长的变化趋势。
杨顺利[3]2003年在《茶叶中β-葡萄糖苷酶基因cDNA克隆与序列分析》文中提出茶树是我国重要的经济作物，香气是衡量茶叶品质好坏的关键指标之一。β-葡萄糖苷酶在茶叶香气和抗逆性方面有着举足轻重的作用。因此，尝试从茶叶中获取β-葡萄糖苷酶基因的cDNA序列，将有助于进一步搞清β-葡萄糖苷酶在茶叶花果香气形成中的地位和作用，充实茶叶香气形成的理论，也为以后利用基因工程手段改良茶树品种，提高茶叶品质、抗病虫能力以及该酶的转化、调控的研究奠定基础。本论文首次从茶叶中克隆出β-葡萄糖苷酶基因cDNA序列，结果如下： 依据茶树叶片生化特点，应用Chomcznski一步法，并作了部分修改，从鲜叶中分离、提取总RNA。利用GenBank中已经登录的其它植物中该酶基因的保守序列，设计一对简并引物，采用RT-PCR技术，从茶树扩增出208bp的cDNA片段。将扩增片段克隆到PMD18-T上进行序列测定和分析，结果表明，此片段核苷酸序列与其他植物β-葡萄糖苷酶基因cDNA相应序列有很好的同源性，推断该PCR特异产物为茶树β-葡萄糖苷酶基因cDNA片段。 以此特异片段设计特异引物，采用RACE技术分别获得β-葡萄糖苷酶cDNA3’端581bp和5’端895bp片段，后再依据上述两段序列设计一对引物，扩增出酶的全长序列1475bp。经Blast搜索表明：克隆所得碱基序列和推导的氨基酸序列与已克隆出的小松树、西葫芦拟南芥等植物体内β-葡萄糖苷酶基因的cDNA相应序列有40％—60％的同源性，因此我们推断扩增所得到的序列为茶树中β-葡萄糖苷酶基因的cDNA。 利用分子生物学软件对氨基酸序列和二级结构进行分析和比较。结果表明，该序列的3’-端和5’端的非编码序列长度分别为189bp和233bp，开放阅读框为1050bp，编码350氨基酸，其转运肽长度为82个氨基酸，成熟蛋白由257个氨基酸组成。经Garnier法预测，茶树β-葡萄糖苷酶蛋白二级结构与其他植物相似，螺旋构象14.33％、伸展构象33.81％、折迭构象25.43％。前体蛋白的分子量为40kDa，等电点(PI)为5.2，为水溶性蛋白。
贾汇红[4]2007年在《疏绵状嗜热丝孢菌热稳定纤维素酶的分离纯化和基因克隆》文中研究表明纤维素酶是一组能降解纤维素的酶的总称。该酶广泛存在于各种微生物中,如细菌、真菌、放线菌等;此外,在动物中也发现该酶的存在。但到目前为止,对该酶的研究仍多以中温好气性木霉(Trichoderma)为主。因此,为了提高纤维素酶的产率和加速对纤维素酶降解纤维素机制的研究,一些极端条件下高活力的纤维素分解菌已经引起科研工作者的重视,尤其是对嗜热真菌(thermophilic fungi)的研究。嗜热真菌具有产酶快且产量大、分解纤维素效率高等特性,是一类非常具有开发潜力的纤维素分解菌。疏绵状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)是一种广泛分布的,生长上限温度较高的一种嗜热真菌,本实验室从该菌中已分离了多种嗜热酶,但还未分离到β-葡萄糖苷酶和外切β-葡聚糖纤维二糖水解酶。本研究中Thermomyces lanuginosus在以微晶纤维素为唯一碳源的合成培养基中诱导产生了外切β-葡聚糖纤维二糖水解酶和β-葡萄糖苷酶,通过硫酸铵沉淀、DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子层析、Phenyl-Sepharose疏水层析等步骤获得了凝胶电泳均一的外切β-葡聚糖纤维二糖水解酶和β-葡萄糖苷酶。经12.5% SDS-PAGE和凝胶过滤层析方法测得两种酶的分子量大小分别约为46.6kDa和47kDa及118kDa和120kDa。外切β-葡聚糖纤维二糖水解酶的反应最适温度为60℃,最适pH值为5.0,在60℃保温30min活性丧失5%,在70℃时的半衰期为35min,在80℃保温10min仍具有60%的活性,80℃下酶的半衰期为25min,在90℃下保温10min仍有12%的活性。Na+、K+、Mn~(2+)对外切β-葡聚糖纤维二糖水解酶活性影响不大;Ca~(2+)、Ba~(2+)、Mg中文摘要纤维素酶是一组能降解纤维素的酶的总称。该酶广泛存在于各种微生物中,如细菌、真菌、放线菌等;此外,在动物中也发现该酶的存在。但到目前为止,对该酶的研究仍多以中温好气性木霉(Trichoderma)为主。因此,为了提高纤维素酶的产率和加速对纤维素酶降解纤维素机制的研究,一些极端条件下高活力的纤维素分解菌已经引起科研工作者的重视,尤其是对嗜热真菌(thermophilic fungi)的研究。嗜热真菌具有产酶快且产量大、分解纤维素效率高等特性,是一类非常具有开发潜力的纤维素分解菌。疏绵状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)是一种广泛分布的,生长上限温度较高的一种嗜热真菌,本实验室从该菌中已分离了多种嗜热酶,但还未分离到β-葡萄糖苷酶和外切β-葡聚糖纤维二糖水解酶。本研究中Thermomyces lanuginosus在以微晶纤维素为唯一碳源的合成培养基中诱导产生了外切β-葡聚糖纤维二糖水解酶和β-葡萄糖苷酶,通过硫酸铵沉淀、DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子层析、Phenyl-Sepharose疏水层析等步骤获得了凝胶电泳均一的外切β-葡聚糖纤维二糖水解酶和β-葡萄糖苷酶。经12.5% SDS-PAGE和凝胶过滤层析方法测得两种酶的分子量大小分别约为46.6kDa和47kDa及118kDa和120kDa。外切β-葡聚糖纤维二糖水解酶的反应最适温度为60℃,最适pH值为5.0,在60℃保温30min活性丧失5%,在70℃时的半衰期为35min,在80℃保温10min仍具有60%的活性,80℃下酶的半衰期为25min,在90℃下保温10min仍有12%的活性。Na+、K+、Mn~(2+)对外切β-葡聚糖纤维二糖水解酶活性影响不大;Ca~(2+)、Ba~(2+)、Mg~(2+)离子对酶有明显的激活作用,Ag+、Zn~(2+)、NH4+等对酶有抑制作用。该酶的Km值为9.56 mg/mL,Vmax为22.12 mg/mL.min。β-葡萄糖苷酶的反应最适温度为60℃,最适pH值为5.0,在60℃保温1小时活性基本不丧失,在70℃的半衰期是15min,在80℃保温10min仍具有30%的活性。在90℃下保温10min仍有10%的活性。Ca~(2+)、Ba~(2+)、Mg~(2+)对β-葡萄糖苷酶有激活作用, Na+、K+、Mn~(2+)对酶活性影响不大,而Ag+、NH4+、Zn~(2+)对酶有显着的抑制作用。该酶的Km值为1.98mg/mL,Vmax为11.94mg/mL.min。离子对酶有明显的激活作用,Ag+、Zn~(2+)、NH4+等对酶有抑制作用。该酶的Km值为9.56 mg/mL,Vmax为22.12 mg/mL.min。β-葡萄糖苷酶的反应最适温度为60℃,最适pH值为5.0,在60℃保温1小时活性基本不丧失,在70℃的半衰期是15min,在80℃保温10min仍具有30%的活性。在90℃下保温10min仍有10%的活性。Ca~(2+)、Ba~(2+)、Mg~(2+)对β-葡萄糖苷酶有激活作用, Na+、K+、Mn~(2+)对酶活性影响不大,而Ag+、NH4+、Zn~(2+)对酶有显着的抑制作用。该酶的Km值为1.98mg/mL,Vmax为11.94mg/mL.min。根据12种真菌热稳定外切葡聚糖酶的同源保守序列设计兼并性引物,通过RT-PCR及快速扩增cDNA末端(RACE)的方法,克隆了疏绵状嗜热丝孢菌Thermomyces lanuginosus外切葡聚糖酶的编码基因cbh,全长cDNA为1710bp,包含一个由457个氨基酸组成的开放阅读框。通过Signal.P服务器的SignalP-NN和SignalP-HNN两种软件我们对推测的外切β-葡聚糖纤维二糖水解酶基因氨基酸序列进行了信号肽分析,结果发现外切β-葡聚糖纤维二糖水解酶基因cbh有一个信号肽切割位点,其位置为1-17,序列为MYQRALLFSFFLAAARA,说明该酶是一种分泌型的蛋白。
徐荣燕[5]2010年在《嗜热真菌糖苷酶的基因克隆、表达与分子改造》文中指出纤维素是地球上最丰富的碳水化合物,可被纤维素酶降解转化成为葡萄糖,对于人类社会解决能源危机、食物短缺和环境污染具有重大的现实意义。传统上采用化学方法控制纤维素降解难度大、成本高,对环境污染严重,而纤维素的生物降解有效克服了这些问题。纤维素酶是一类能够水解纤维素β-D-糖苷键生成葡萄糖的多组分酶的总称,纤维素的彻底降解需要内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶叁种组分的协同作用,β-葡萄糖苷酶是纤维素酶解的瓶颈。在纤维素水解时,增加β-葡萄糖苷酶活性,会有效提高纤维素酶解效率。近些年来,许多专家学者通过分子生物学等手段不断提高酶活力和获得新性能的重组纤维素酶。糖化酶是一种具有外切活性的酶,它能从非还原性末端水解淀粉、糊精、糖原等的α-1, 4-葡萄糖苷键,得到终产物β-D-葡萄糖,是淀粉转化为葡萄糖过程中的主要酶类之一。糖化酶已在酿造、食品、医学等工业和农业领域中得到了广泛的应用,具有重要商业价值。但市场应用的糖化酶主要来源于常温菌,因其酶活力和产率低,热稳定性差导致产品成本高,储存期短,而制约糖化酶在农业、工业上的应用。由此可见,热稳定性糖化酶的研究和开发具有重要意义。疏绵状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)和嗜热毛壳菌(Chaetomium thermophilum CT2)是广泛分布的,生长上限温度较高的嗜热真菌,从这两种真菌中已分离了多种嗜热酶,具有极大的研究和应用价值。本研究通过RT-PCR和RACE-PCR从嗜热毛壳菌中首次分离到了一个新的β-葡萄糖苷酶基因,GenBank登录号为EF648280,序列分析表明该基因全长核酸序列为3213 bp,包含一个2604 bp的开放阅读框ORF,编码867个氨基酸的蛋白质,酵母表达后酶蛋白表达量为1.644 U/mg,经硫酸铵沉淀、DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换等步骤纯化了该重组蛋白,SDS-PAGE显示该重组蛋白大小约为119 kDa,比推测的蛋白分子量稍大,可能与该蛋白的糖基化有关。重组酶的最适反应温度和最适pH值分别为60℃和5.0,该酶具有较高的热稳定性,70℃保温10 min后剩余酶活为29.7 %。本研究还从疏绵状嗜热丝孢菌中克隆到一种糖化酶基因(GenBank登录号为EF545003)并将其在毕赤酵母中进行了高效表达,经甲醇诱导表达后酶活最高可达11.6 U/mL,经硫酸铵沉淀、DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换等步骤纯化了该重组蛋白,SDS-PAGE显示该重组蛋白大小约为67 kDa,该重组酶的最适反应温度和最适pH值分别为60℃和5.0,在pH 4.0-9.0的范围内是很稳定的。对来自嗜热毛壳菌的β-葡萄糖苷酶基因的非保守氨基酸和保守氨基酸进行定点突变。叁个非保守氨基酸的突变为K275R、N276S和279D,表达筛选后发现与原始菌GS-BGL相比,叁个突变子的酶活都有不同程度的降低,突变子的酶活分别是原始菌酶活的81.3 %、63 %和65 %,但最适反应温度均提高了5℃;突变子N276S和G279D的最适pH由5变为4,而突变子K275R最适pH值仍保持在5;在热稳定性方面,叁个突变子表现不同,60℃处理60 min,突变子G279D稳定性提高最多,仍有80.6 %的酶活,突变子N276S稳定性次之,酶活剩余72.1 %,原始酶仅剩69.55 %的活性,而突变子K275R酶活剩余59.5 %,与原始酶相比稳定性下降。而当保守氨基酸第287位的天冬氨酸突变为非亲核的甘氨酸后,突变子失去了糖苷水解酶的活性,证明了该氨基酸为维持水解酶活性的必需氨基酸,但目前还没有检测到糖苷合成酶的活性。由于定点突变主要是针对天然酶蛋白中少数的氨基酸残基进行替换,蛋白的高级结构基本保持不变,而且本研究中的β-葡萄糖苷酶的结构迄今为止还没有报道,因而对酶蛋白的改造有限。为了提高β-葡萄糖苷酶的酶活力和稳定性,采用定向进化的方法对β-葡萄糖苷酶的基因进行改造。本研究以β-葡萄糖苷酶bgl基因为出发基因,采用易错PCR的方法建立突变体文库,以高活力为筛选压力,筛选方法采用平板荧光初筛和小量发酵法相结合。经过突变和筛选,获得了一个酶活力提高0.74倍的突变体,序列测定表明:突变基因与出发基因比较,突变子BE857有6个氨基酸发生了变化。通过硫酸铵沉淀、DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子层析等步骤纯化了该蛋白,酶学性质与出发酶进行了比较,该突变酶的最适温度为65℃,比出发酶提高了5℃,最适pH与出发酶一致均为5.0,在稳定性方面,突变子株BE857有所提高,60℃处理1 h后酶活仍剩余75.58 %,而出发菌株剩余酶活为69.55 %。
孙云[6]2009年在《茶叶抗坏血酸过氧化物酶（APX）的生理学与分子生物学研究》文中进行了进一步梳理抗坏血酸过氧化物酶(ascorbate peroxidase，APX)是植物活性氧代谢中重要的抗氧化酶之一，又是维生素C代谢的主要酶类。茶叶中富含维生素C，作为茶叶中重要活性营养成分，维生素C在茶叶加工和储存过程中易造成大量损失。开展茶叶中维生素C代谢相关基因的研究，将有助于了解茶叶中维生素C代谢的机制，为调控茶叶维生素C水平提供理论依据。本研究以茶叶(Camellia sinensis)为供试材料，研究了茶叶抗坏血酸过氧化物酶的生理特性及分子机理。通过对茶叶APX活性测定条件的探讨和建立，研究茶树不同品种、茶叶新梢不同生育时期、茶叶加工过程APX活性、同工酶的动态变化以及及维生素C含量的变化特点，探讨茶叶APX的代谢生理和作用机制；克隆了茶叶cAPX基因，并利用生物信息学方法对它的结构和功能进行预测和分析；在此基础上应用荧光定量PCR技术分析了茶叶cAPX基因的定量表达。研究结果如下：1．茶叶抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性的测定方法建立探讨了茶树鲜叶抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性的测定条件。结果表明，茶叶APX测定的最佳条件为，聚乙烯聚吡咯烷酮(PVPP)加入量约为鲜叶重的1．5倍，酶提取液pH为7．8，反应液pH为7．0，抗坏血酸(AsA)浓度为0．50 mmol／L时茶树鲜叶APX活性最高。试验样品APX活性随冷冻贮藏天数增加，不断降低，样品应可能保持芽叶的新鲜度。2．不同茶树品种、新梢不同生育时期APX酶活性研究选择福建代表性的绿茶品种(福鼎大白茶、福云6号)和乌龙茶品种(铁观音、毛蟹、黄旦、本山、肉桂)，分析了不同茶树品种以及茶树鲜叶不同叶位APX活性的变化。结果表明，福建主要7个茶树品种以福云6号的APX活性最高，铁观音的APX活性最低，绿茶品种的APX活性高于乌龙茶品种，不同品种APX活性大小依次为福云6号＞福鼎大白茶＞肉桂＞毛蟹＞黄旦＞本山＞铁观音；茶树鲜叶不同叶位APX活性变化趋势为：芽＞第一叶＞第二叶＞第叁叶＞老叶＞嫩茎，随着鲜叶成熟度增加，APX活性下降。3．茶叶加工过程中APX活性及维生素C动态变化研究探讨茶叶不同萎凋程度及乌龙茶加工过程APX和维生素C的动态变化。结果表明，茶叶萎凋过程中APX活性呈“下降—上升—下降”趋势，相对活性由100％降至1．7％，萎凋不同阶段APX活性差异显着；萎凋过程中茶叶维生素C含量呈缓慢减少趋势，维生素C保留在鲜叶的80％以上，只经过萎凋的茶类(传统白茶)维生素C保留较为丰富。乌龙茶加工过程APX活性也呈“下降—上升—下降”趋势，相对活性由100％降至17．45％，炒青前各工序茶叶的APX活性差异显着，炒青后各工序茶叶的APX活性差异不显着；维生素C含量呈减少趋势，相对保留量由100％降至9．01％，揉捻工序维生素C含量下降幅度最大，其次是摇青工序。4．不同茶树品种及茶叶加工过程中APX同工酶的研究运用同工酶技术分析福建代表性绿茶、乌龙茶品种APX同工酶差异，分析探讨茶叶不同萎凋程度APX同工酶动态变化。结果表明，不同茶树品种APX同工酶存在差异，茶叶APX同工酶共有6条谱带，其中A2、A4、A5和A6四条为不同品种茶树所共有，A4、A5谱带为茶叶APX的重要同工酶。7个不同茶树品种的酶带，福鼎大白茶与毛蟹的酶带最亮最强，铁观音、黄旦与福云6号酶带最弱，除福云6号外，其他品种同工酶的表达量与APX活性存在相关性。茶叶萎凋茶叶APX同工酶谱带数量减少，起主要作用的为A4、A5同工酶也逐渐减弱，但萎凋18 h同工酶谱带强度与数量增加。同工酶的变化与APX酶活性具有相关性。5．茶叶APX的cDNA克隆从茶叶中克隆出了一个长度为1 083 bP的cAPX基因的cDNA序列，经测序分析，其包含750 bP的开放读码框，编码250个氨基酸。该基因在3’RACE与保守区重迭碱基数为321 bp，与5’RACE重迭碱基数是77 bp，非编码区5’有94 bp，3’有136 bp。已将该基因序列登录Genbank，登录号为Eu547804。6．茶叶APX基因的生物信息学分析利用生物信息学的方法对克隆的茶树cAPX基因的核酸序列及对应氨基酸序列的理化性质、结构特征、功能及系统演化关系等进行预测分析。结果表明，茶叶cAPX是一分子量27．53 kDa，等电点pI 5．59，比较稳定的酸性蛋白，属于亲水性蛋白，不含有跨膜信号，不具有信号肽；茶叶cAPX磷酸化位点有10个，丝氨酸(Ser)、酪氨酸(Tyr)磷酸化位点的各4个，苏氨酸(Thr)磷酸化位点2个，蛋白氨基酸序列9-31区域最有可能形成卷曲螺旋结构，α螺旋和不规则卷曲是茶叶cAPX蛋白最大量的结构元件。茶叶cAPX基因参与的生物过程主要是响应化学刺激和应激反应，具有四吡咯结合、过氧化物酶活性和氧化活性分子功能。蛋白的功能预测进一步证实茶叶cAPX属植物抗坏血酸过氧化物酶(Plant ascorbate-peroxidase)的蛋白质家族成员。7．茶叶主要品种及茶叶加工中APX基因的定量表达应用荧光定量PCR的方法对不同茶树品种APX基因的表达以及萎凋工艺过程中APX基因的表达进行定量分析。结果表明，茶树不同品种APX基因表达量存在显着差异，相对表达量变化范围为0．65-5．69，6个茶树品种APX基因相对表达量的大小为毛蟹＞福云6号＞肉桂＞福鼎大白茶＞黄旦＞铁观音。茶叶萎凋过程中APX基因的表达量呈现“升高—降低—再升高—再降低”的趋势，相对表达量变化范围为0．02-7．46，茶叶APX基因的表达明显受到萎凋工艺处理的影响。
肖鑫[7]2014年在《温度对乌龙茶做青叶β-葡萄糖苷酶活性影响》文中提出本文设置叁种不同温度条件(17℃、22℃、27℃),以梅占、奇兰、金观音为材料,研究了做青过程中及其与之相对应温度条件下对照处理(静置处理)在制品β-葡萄糖苷酶活性及水分的动态变化,探讨β-葡萄糖苷酶活性及水分在做青过程中的变化规律,并对其变化机理进行分析。结果表明：不同温度处理做青水分动态变化特点表现为：梅占做青过程在制品水分动态变化在17℃、22℃和27℃条件下,均呈现“升、降”的变化特点；奇兰做青过程在制品水分动态变化在17℃、27℃条件下,呈现“降”的变化特点,在22℃条件下,呈现“降、升、降”的变化特点；金观音做青过程在制品水分动态变化在17℃条件下,呈现“降”的变化特点,在22℃条件下,呈现“降、升、不变、降”的变化特点,在27℃条件下,呈现“降、升、降”的变化特点。梅占、奇兰、金观音在不同温度条件下,做青处理各个工序平均水分大小顺序分别依次为：A2B2<A2B1<A2B3；A2B3<A2B1<A2B2；A2B1<A2B2<A2B3。对17℃、22℃、27℃叁个温度做青处理中在制品水分差异显着性测验表明：梅占、奇兰、金观音分别在叁摇前、四摇前、做青后；二摇前、叁摇前、四摇前、做青后；二摇前、四摇前、做青后各阶段中的17℃空调做青条件下做青处理与22℃和27℃条件下做青处理水分之间的差异存在显着性,并达到极显着水平。22℃C和27℃条件下做青处理的水分之间的差异存在显着性,并达到极显着性水平。不同温度处理做青过程p-葡萄糖苷酶活性变化特点表现为：梅占做青过程在制品β-葡萄糖苷酶活性变化在17℃条件下,呈现“升、降、升”的变化特点,在22℃条件下,呈现“降、升”的变化特点,在27℃条件下,呈现“降、升、降、升”的变化特点；奇兰做青过程在制品β-葡萄糖苷酶活性变化在17℃、27℃条件下,呈现“升、降、升”的变化特点,在22℃条件下,呈现“升、降”的变化特点；金观音做青过程在制品β-葡萄糖苷酶活性变化在17℃、22℃条件下,呈现“升、降、升、降”的变化特点,在27℃条件下,呈现“降、升”的变化特点。梅占、奇兰、金观音在不同温度条件下,做青处理各个工序平均酶活性大小顺序分别依次为：A2B3<A2B2<A2B1；A2B1<A2B3<A2B2；A2B1<A2B2<A2B3；对17℃、22℃、27℃叁个温度做青处理中在制品β-葡萄糖苷酶活性差异显着性测验表明,不同品种在不同做青阶段,差异显着性分析存在明显的不同。相同温度条件下,乌龙茶做青与静置处理对比,梅占、奇兰、金观音做青过程在制品平均水分略低于静置处理的平均水分(在22℃条件下,金观音做青过程在制品平均水分略高于静置处理的平均水分)。在17℃条件下,梅占、金观音做青过程中在制品β-葡萄糖苷酶的平均酶活性略大于静置处理的酶活性,奇兰做青过程中在制品β-葡萄糖苷酶的平均酶活性小于静置处理的酶活性。在22℃条件下,梅占、奇兰做青过程中在制品β-葡萄糖苷酶的平均酶活性略小于静置处理的酶活性,金观音做青过程中在制品β-葡萄糖苷酶的平均酶活性略大于静置处理的酶活性。在27℃条件下,梅占做青过程在制品β-葡萄糖苷酶活性变化略低于静置处理的酶活性；奇兰、金观音做青过程在制品β-葡萄糖苷酶活性略高于静置处理的酶活性。
马腾[8]2012年在《高产耐热β-葡萄糖苷酶的黑曲霉菌株选育及其基因克隆》文中研究说明黑曲霉是常见的安全菌株之一，也是普遍公认的产β-葡萄糖苷酶较多的菌株。黑曲霉比其它微生物外源基因表达系统(如细菌,酵母)具有诸多优点，如高分泌性能、高强度启动子、完善的翻译后加工及成熟的发酵工艺等。β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase, EC.3.2.1.21)是纤维素降解过程中的关键酶之一，但其在自然界中含量少、活力低，是限制纤维素酶解技术发展的瓶颈。因此，通过基因重组技术构建工程菌，利用微生物手段高效表达β-葡萄糖苷酶对纤维素作为生物质能源工业化应用具有重要意义。本研究从五株黑曲霉中筛选出了产耐热的β-葡萄糖苷酶菌株(黑曲霉3.316)和产β-葡萄糖苷酶活性较高菌株(黑曲霉3.2130)，并以这两株菌为研究对象，对黑曲霉高效表达外源β-葡萄糖苷酶基因，做了一些前期基础性工作：发酵工艺条件优化、低酸性蛋白酶活菌株的诱变、β-葡萄糖苷酶的分离纯化及特性研究、β-葡萄糖苷酶基因克隆与序列分析。主要结果如下：（1）响应面分析法优化黑曲霉3.2130产β-葡萄糖苷酶最佳工艺为：麸皮用量17g/L、硫酸铵+蛋白胨用量5g/L(1:1, W/W)、水杨苷+CMC用量3g/L(1:2,W/W)、初始pH5.0、发酵瓶装液量63mL、接种量7mL、摇床转速154r/min，在此条件下发酵，β-葡萄糖苷酶活力达到1.352U/mL，是初始工艺条件产酶的1.23倍。（2）黑曲霉3.2130原生质体经DES诱变，筛选出2株酸性蛋白酶活低的诱变菌株，作为后期基因表达的宿主菌株。（3）黑曲霉3.316发酵粗酶液经分离、纯化得到β-葡萄糖苷酶，经SDS-PAGE电泳测定其亚基分子量为127KDa，反应最适温度和pH值分别为60℃和4.4，该酶于65℃下保温20min，其酶活仍能达到72.6%，属于耐热型酶。（4）利用PCR技术，以黑曲霉3.316总DNA为模板，扩增得到了大小为2934bp的β-葡萄糖苷酶基因，被命名为bgl3.316(GenBank基因序列号为JN969085)。依据目的基因序列对七个外显子进行拼接后得到cDNA序列，并对其核苷酸和氨基酸序列进行了分析，为后期该bgl基因在黑曲霉3.2130中表达奠定了基础。
钟娴[9]2014年在《‘平潭水仙’β-葡萄糖苷酶与挥发性芳香物质形成关系的研究》文中指出在‘平潭水仙’开花过程中,本研究利用HS-SPME-GC-MS分离分析技术,结合保留值、内标法进行了挥发性芳香物质定性定量分析；利用XAD-2树脂吸附法以及有机溶剂成功分离了游离态、键合态芳香组分,并在外源β-葡萄糖苷酶的水解作用释放了键合态芳香物质,检测到了挥发性芳香物质；同时利用丙酮粉法研究了β-葡萄糖苷酶活性变化趋势,并克隆分离了四个β-葡萄糖苷酶基因家族成员和一个芳樟醇合成酶基因家族成员,进行了荧光定量表达分析,所得主要结果如下：1.1‘平潭水仙’不同时期挥发性物质分析自水培之日(0d)起至现绿色花苞(19d),‘平潭水仙’均未释放挥发性物质,随着花苞转白到完全绽放,挥发性物质种类及含量随之不断增多,后伴随着花的衰老,挥发性物质也相应减少。‘平潭水仙’花主要的挥发性物质是萜烯类、醇类、酯类,以Z-罗勒烯、芳樟醇、乙酸苯甲酯、别罗勒烯为主,其中芳樟醇是贡献最大的特性香气组分,其次为罗勒烯,两组分均随着花的盛开,含量显着增加,进入衰老期又急剧降低。1.2‘平潭水仙’不同时期游离态、键合态芳香物质分析在‘平潭水仙’花盛开过程中,19d的绿芽虽未检测到太多的游离态芳香物质,却富含较多的键合态芳香物质；随着花的盛开,游离态的芳香物质组分增多,键合态芳香物质较少；进入衰老期游离态芳香物质减少而键合态芳香物质变多。1.3‘平潭水仙’不同时期β-葡萄糖苷酶活性变化随着花的盛开,酶活显着提高至27d达到最大值,伴着花的衰老酶活又逐渐降低。p-葡萄糖苷酶活性的动态变化趋势与‘平潭水仙’挥发性芳香物质的变化趋势一致,初步推测了β-葡萄糖苷酶与‘平潭水仙’挥发性芳香物质形成的关系,即随着花的盛开,初期贮存的键合态芳香物质在逐渐提高活性的β-葡萄糖苷酶的水解糖苷键作用下,不断释放出具有芳香物质的配基,增加了花的游离态芳香物质,从而增加了水仙花的香味,后伴随着花的衰老,酶活性降低,水解糖苷键的作用减弱,芳香物质多以键合态的形式存在,致衰老过程中花的挥发性芳香物质也随之减少。1.4β-葡萄糖苷酶基因家族成员、芳樟醇合成酶基因克隆和表达分析本研究尝试克隆β-葡萄糖苷酶基因家族成员和芳樟醇合成酶基因,成功克隆了3个(Nt-BGL Ⅰ-1、Nt-BGL Ⅰ-2、Nt-BGL Ⅰ-3)属于糖基水解酶家族1的p-葡萄糖苷酶基因家族成员和1个(Nt-BGL Ⅲ-1)属于糖基水解酶家族3的β-葡萄糖苷酶基因家族成员,核酸序列长度在1665-2155bp,编码区为1464-1878bp,编码487～652个氨基酸,5'UTR序列长度均比3’UTR短；克隆分离出一条芳樟醇合成酶基因(Nt-Lis Ⅰ),全长为1668bp,开放阅读框(ORF)大小为1575bp,编码524个氨基酸,有一个DDXXD基序,无RRx8W基序,可能属于TPSg家族成员。根据实时荧光定量分析结果推测主要由Nt-BGL1-1、Nt-BGL1-3参与了‘平潭水仙’挥发性芳香物质形成过程,Nt-BGL1-2、Nt-BGL Ⅲ-1参与了p-葡萄糖苷酶其他生理代谢；萜类合成酶众多,本论文所获得的芳樟醇合成酶基因(Nt-Lis I)可能并不是参与芳樟醇合成途径的关键基因家族成员。
王晓[10]2015年在《β-葡萄糖苷酶基因差异表达与茶树轮斑病感抗性关系的研究》文中进行了进一步梳理本文通过研究糖苷类芳香物质对茶轮斑病的抑制来揭示伊葡萄糖苷酶基因表达差异与茶树抗病性的关系,进而为抗病性品种的快速选育提供理论依据。主要研究成果如下：1、茶枝离体水培试验,检测了19个茶树品种的轮斑病病情指数。大多数茶树品种抗茶树轮斑病的病情指数在9-12之间,毛蟹对茶树轮斑病的抵抗力最强,茶轮斑病病情指数最小,为6.7。而薮北的病情指数23.3远远大于其它茶树品种,故而薮北对茶树轮斑病的抵抗力应该是最差的。2、19个茶树品种的糖苷对茶轮斑病的抑制率可以分为3个水平。抑制率最低的水平只有薮北一个茶树品种,抑制率73.20%,其糖苷类香气前体对茶树轮斑病的抗性最差。第二个水平包括湘波绿、武阳香、尧山秀绿、湘妃翠四个茶树品种,他们的糖苷对茶树轮斑病的抑制率在90.6-92.5之间。其它14个茶树品种的糖苷抗轮斑病抑制率均在95.00%之上。3、实时荧光定量PCR试验表明,乌黑长叶、湘波绿、早白尖、昆明十里香、名山早、铁香六个品种的p-葡萄糖苷酶基因表达量高于湘妃翠,其中铁香高出湘妃翠最多。而其它12个茶树品种相对于湘妃翠而言,β-葡萄糖苷酶基因表达量偏低,尤其是薮北,差异最大。4、β-葡萄糖苷类香气对茶树轮斑病病原菌抑制率实验显示,除了茶树品种湘波绿的抑制率为89.77%,其余18个茶树品种的抑制率都在90%以上。茶树品种毛蟹的抑制率达到98.35%,在试验组中是最高的。5、GC-MS联用仪测定β-葡萄糖苷类香气物质苯甲醇结果显示,茶树品种铁香β-葡萄糖苷类香气物质苯甲醇含量远远高于其它品种,10g茶粉中β-葡萄糖苷类香气物质苯甲醇含量达到16.279μL。薮北、长叶白毫两个茶树品种β-葡萄糖苷类香气物质苯甲醇分别是3.849μL、2.883μL,低于平均水平。6、19个茶树品种或者品系的病情指数仅仅与其糖苷前体对茶树轮斑病的抑制率基本上呈负相关,但是仍有个别茶树品种或品系存在偏差。而β-葡萄糖苷类香气苯甲醇含量、β-葡萄糖苷类香气对茶树轮斑病抑制率、β-葡萄糖苷酶基因差异表达量、茶树轮斑病病情指数四者之间没有明显的线性关系。可能的原因有以下几个方面。一是茶树病情指数方面,在人工培养箱中进行的茶枝离体水培,可能导致病情指数不稳定。茶树中生物碱,游离芳香油等成分对茶树轮斑病有抑制作用；二是β-葡萄糖苷类香气方面,检测茶树β-葡萄糖苷类芳香油时,除了β-葡萄糖苷类香气苯甲醇外,还有一些对茶树轮斑病病原菌产生影响的非β-葡萄糖苷类香气成分,如戊醇、反丁烯二酸二甲酯、邻叁酚等。芳香成分在配制成PDA培养基过程中,会因温度较高有不同程度的散失,造成试验结果偏差。芳香成分在配制成PDA培养基过程中,加入了乳化剂助溶,乳化剂会对茶树轮斑病病原菌产生抑制作用。叁是β-葡萄糖苷酶基因表达方面,茶树中β-葡萄糖苷酶基因表达的β-葡萄糖苷酶并不是都与β-葡萄糖苷前体结合。有文献报道,β-葡萄糖苷类香气不只有苯甲醇,还有顺-3-己烯、苯乙醇、香叶醇、水杨酸甲酯、芳樟醇及四种芳樟醇氧化物。
参考文献：
[1]. 茶树β-葡萄糖苷酶基因克隆、表达和分布定位[D]. 李远华. 安徽农业大学. 2003
[2]. 不同工艺铁观音香气形成的生化及分子生物学机制研究[D]. 张娴静. 福建农林大学. 2012
[3]. 茶叶中β-葡萄糖苷酶基因cDNA克隆与序列分析[D]. 杨顺利. 安徽农业大学. 2003
[4]. 疏绵状嗜热丝孢菌热稳定纤维素酶的分离纯化和基因克隆[D]. 贾汇红. 山东农业大学. 2007
[5]. 嗜热真菌糖苷酶的基因克隆、表达与分子改造[D]. 徐荣燕. 山东农业大学. 2010
[6]. 茶叶抗坏血酸过氧化物酶（APX）的生理学与分子生物学研究[D]. 孙云. 福建农林大学. 2009
[7]. 温度对乌龙茶做青叶β-葡萄糖苷酶活性影响[D]. 肖鑫. 福建农林大学. 2014
[8]. 高产耐热β-葡萄糖苷酶的黑曲霉菌株选育及其基因克隆[D]. 马腾. 河北科技师范学院. 2012
[9]. ‘平潭水仙’β-葡萄糖苷酶与挥发性芳香物质形成关系的研究[D]. 钟娴. 福建农林大学. 2014
[10]. β-葡萄糖苷酶基因差异表达与茶树轮斑病感抗性关系的研究[D]. 王晓. 湖南农业大学. 2015