（1哈尔滨医科大学附属第二医院150000； 2哈尔滨市第一医院150000； 3哈尔滨医科大学附属第一医院150000）
摘要 目的:实验性大鼠在坐骨神经损伤后，移植嗅鞘细胞。通过观察神经生长相关蛋白的表达水平，来研究嗅鞘细胞移植在大鼠坐骨神经损伤后，对神经再生的促进作用。方法:制作大鼠坐骨神经损伤模型，随机分成对照组和实验组，将培养的嗅鞘细胞应用到坐骨神经断端。观察神经损伤后3 d、7 d、14 d和21d大鼠TUNEL标记阳性细胞百分比变化，利用免疫组化，观察神经生长相关蛋白(GAP-43)表达水平变化。 结果:术后对照组和实验组的免疫组化呈现GAP-43的规律性表达，但实验组表达水平优于对照组，有统计学上差异；实验组凋亡细胞数量也少于生理盐水对照组。结论:在本实验设计条件下，嗅鞘细胞对大鼠坐骨神经损伤后的神经再生有一定促进作用。
关键词: 嗅鞘细胞；细胞移植；坐骨神经；神经再生
【中图分类号】R651.3 【文献标识码】A
1材料和方法
1.1动物与材料
健康雄性Wistar大鼠28只，体重200-250 g(哈尔滨医科大学附属第二医院大学动物实验室提供)，随机分为生理盐水对照组(8只)和实验组(20只)。伤后3天，7天，14天，21天四个时间点取材，每个时间点对照组(2只)和实验组(5只)。主要材料：嗅鞘细胞（原代大鼠嗅粘膜培养获得），兔抗鼠GAP-43抗体，驴抗兔GAP-43抗体(Santa Cruz公司)， SP免疫组化试剂盒、DAB显色试剂盒(Santa Cruz公司)及 TUNEL试剂盒。
1.2嗅鞘细胞的培养
取体重 200-250g 的大鼠的嗅粘膜做原代培养，参考文献应用改良的差速贴壁和环孢霉素A( Ara-C)相互结合法进行 OECs的纯化培养鉴定，调整细胞浓度为 1*107个/ml，待用。
1.3模型的制备、取材和固定
利用10%的水合氯醛，按照3 ml/kg对大鼠腹腔麻醉，生效后术区碘伏消毒。行左侧臀部斜行切口，切开皮肤及皮下，钝性分离肌肉，充分显露坐骨神经，在梨状肌下缘处完全切断坐骨神经。在12倍手术显微镜下，将坐骨神经两断端正确对位后，9-0无损伤线吻合断端4针，彻底止血，缝合创口，制成坐骨神经切断模型。
将透明的硅胶管（内径2.2mm，外径2.4mm）修剪成8mm长，浸泡于4%戊二醛中，12小时后，用无菌0.9%氯化钠溶液冲洗掉残留消毒液。将透明硅胶管剪开套住神经断端吻合处，用无损伤线关闭剪开口，并与神经缝合固定。用微量注射器轻轻刺取25μl，注入到硅胶管内神经吻合口处。
取材：在不同时间点的各组大鼠腹腔麻醉后，4%多聚甲醛缓冲液进行心脏灌注固定。切取L4-L6腰段脊髓，放置在同样4%多聚甲醛缓冲液5 ml中固定，脱水后经石蜡包埋，制成厚度为3μm的横断切片。
1.4免疫组化和TUNEL法凋亡检测
切片进行逐级脱蜡， PBS洗3次（各5分钟），阻断灭活内源性过氧化物酶。 用水浴锅将0.01M枸橼酸钠缓冲溶液加热至煮沸，自然冷却20分钟以上，再加快使其降至室温。 滴加正常山羊血清封闭液，滴加兔抗鼠GAP-43抗体50 ul。 按SP试剂盒说明常规梯度乙醇脱水，二甲苯透明并干燥，中性树胶封片。TUNEL法检测脊髓运动神经元的凋亡，使用浓度和方法均按照说明书严格配置。
1.5图像分析及统计学处理
从各组随机选择5张切片，显微镜下观察GAP-43免疫阳性反应在不同组大鼠脊髓细胞的表达，利用分析系统进行图像半定量分析， GAP-43表达的定量指标采用平均光度， TUNEL法检测的定量指标采用数密度。采用SPSS18.0软件进行统计学分析， GAP-43表达量在各时间点数值的不同运用单因素方差检验是否有统计学意义，P<0.05判定差异有统计学意义，并对GAP-43表达量与细胞凋亡数的关系进行相关分析。
2结果
2.1GAP-43表达结果
显微镜下观察L4-L6脊髓切片发现，各组各时相大鼠腰段脊髓中前角运动神经元均有GAP-43表达。对照组坐骨神经损伤后 3天，同侧脊髓中 GAP-43 免疫反应开始增强。术后14天阳性细胞数最多，细胞染色最深。术后21天后稍减弱，免疫反应着色逐渐变浅。实验组呈现出与对照组相同的时程表达规律，高峰值均出现在14天，但除3d组，其余各时间点的表达均高于对照组。统计学分析表明：术后7天、14天、21天，两组间数据差异有统计学意义(P<0.05)。(见表1和图1，3，4)
2.2TUNEL的染色结果
细胞染色阳性的胞核呈棕黄色颗粒。其阳性细胞数在伤后3天时表达较为稀疏，2周时最为稠密。图像分析结果显示：凋亡细胞的数值从3天开始上升，2周时达到高峰，以后呈现下降趋势。除3d组无明显不同外，其余时间点实验组凋亡细胞数量均少于生理盐水组，有统计学差异(P<0.05)。(见表2和图2，5，6)
3 讨论
嗅鞘细胞是一种特殊的胶质细胞，其促进神经再生的特性已被应用治疗成年动物的脊髓损伤，显示出了广泛的前景。对于嗅鞘细胞能否促进周围神经再生，国内外的相关报道却较少。
周围神经损伤关系到相应的神经元胞体，受损神经元的成活、数量及其功能状态是神经功能能否有效修复的关键。周围神经受损一旦发生，神经元蛋白合成的变化是轴突再生所必要的，而轴突生长所需的蛋白质必须经胞体运输到轴突。此类蛋白分为快速和慢速轴运蛋白，其中作为快速转运蛋白中的重要一员的GAP-43的含量在神经受损后呈直线性增加。国际上已将GAP-43作为研究神经生长、发育和损伤修复的首要分子探针，因此，本实验选择GAP-43作为观察指标。
结果发现：实验组和对照组均出现了相同的时程表达，但从7天开始的时间点，实验组的表达高于对照组，差异具有显著性。分析认为嗅鞘细胞在早期分泌的各种神经营养因子不仅能够单独作用，还可改变周围微环境。这些神经营养因子能够相互作用和相互促进，可诱导周围组织向有利于神经再生的方向发展。神经营养因子也具有趋化作用，诱导雪旺细胞增生和移动，从而产生神经保护作用。
神经损伤后，神经元包体自身出现凋亡，其凋亡细胞数在达到峰值，然后出现下降，是因为本身具有抗凋亡作用。从7天开始，实验组凋亡细胞数明显少于对照组，表明嗅鞘细胞分泌的多种神经营养因子作用。神经营养因子通过各种机制抗凋亡的作用目前已得到广泛的共识。这种凋亡表达结果与免疫组化的结论相一致。
本实验选用嗅鞘细胞，而没有联合其他细胞或生长因子，目的是观察单因素对神经元包体的影响效果，观察周围神经损伤后，其对神经再生的作用。
其他学者在以往的研究中发现了相同的结论。程赛宇用硅胶管套接大鼠切断的坐骨神经，局部注射嗅鞘细胞，在术后30或90天,分别从电生理检测、HRP逆行示踪法及轴突图像分析方面，发现嗅鞘细胞对周围神经损伤后的神经功能恢复有良好的促进作用。
本课题的结果为神经再生的基础研究提供了一定的实验基础，但尚需要更多实验证据，以期在分子水平上的做进一步的深入探讨。
参考文献
1.姜复龄，何 佳.纯化的大鼠嗅鞘细胞在大鼠脊髓损伤中的修复作用 [J]. 局解手术学杂志，2013，22（4）：359-361
2.邓志云.南昌大学学报（医学版）2012，5（6）：94-97
3.施颖菡，龙莉，神经损伤后GAP-43表达的研究进展 [J].中国实用医药，2011，6（33）： 246
论文作者:赵东波1 张伟东2 张维嘉2 陈天新1 关瑛3
论文发表刊物:《中华高血压杂志（综合临床）》2016年6月
论文发表时间:2017/2/28
标签：细胞论文; 实验组论文; 坐骨神经论文; 神经论文; 损伤论文; 大鼠论文; 脊髓论文; 《中华高血压杂志（综合临床）》2016年6月论文;