孙妍蕾 孙家忠 曹晨 肖婷 杨梅 邓向群（通讯作者）
武汉市第三医院 湖北武 汉 430000
摘要：目的 研究在不同的血糖波动条件下，高血糖的代谢记忆效应对主动脉内皮细胞氧化应激的影响，用抗氧化剂a-硫辛酸研究主动脉内皮细胞损伤机制。方法 体外培养主动脉内皮细胞株，分组：实验分为以下2类，对照组：① 正常对照组：5mmol／L葡萄糖组；②高糖组：20mmol／L葡萄糖组；③低水平波动组：5mmol／L葡萄糖和20mmol／L葡萄糖；④高水平波动组：5mmol／L葡萄糖组和30mmol／L葡萄糖组。药物组：在对照组的基础上加入药物a-硫辛酸（ALA），24小时后进行指标检测；波动组培养基中葡萄糖浓度按高低循环的方式给予，即：20 mmol/L葡萄糖培养2 h，更换5 mmol/L葡萄糖培养3 h，进行3个循环，夜间9 h，加5 mmol/L培养基，共作用24 h，培养14天后进行指标检测。结果 1：与正常组比较，高糖组和波动组细胞内氧化应激水平均有显著升高；2：与高糖组比较，低水平波动组和高水平波动组细胞内氧化应激水平有显著升高；3：与低水平波动组比较，高水平波动组细胞内氧化应激水平有显著升高；4：与对照组比较，药物组细胞内氧化应激水平有显著下降。结论 波动性高血糖较恒定性高血糖对主动脉内皮细胞具有更强的损伤效应，其机制可能是波动性高血糖比恒定性高血糖能引起更为强烈和持久的“代谢记忆效应”，抗氧化剂a-硫辛酸可以对抗主动脉内皮细胞的氧化应激损伤。
关键词：波动性高血糖；恒定性高血糖；代谢记忆效应；主动脉内皮细胞；氧化应激
引言
近年来，有研究提出在糖化血红蛋白相同时，血糖波动越大，慢性并发症的发生率越高，波动性高血糖相对于恒定性高血糖更能促进糖尿病患者慢性血管并发症的发生与发展[1]。血糖波动已成为一个独立于HbA1c的糖尿病慢性并发症的重要危险因素，波动性高血糖比恒定性高血糖更易促进糖尿病患者慢性血管并发症的发生与发展，其可能作为糖尿病控制的“金标准”。波动性高血糖已成为糖尿病血管并发症防治领域的一个研究热点。“代谢记忆”即机体根据最初的血糖水平形成持续性地、级联性的血管内皮细胞炎性因子表达，从而导致细胞增殖、凋亡及功能紊乱，尽管严格控制血糖，数年内大血管和微血管病变仍持续发展[2-4]。近年来大量研究已证实血糖水平与糖尿病并发症的发病率及严重程度之间存在明显不一致，这是因为高糖具有代谢记忆效应。氧化应激是形成高糖代谢记忆的基础，同时也是高糖代谢记忆参与糖尿病并发症的主要途径[5]。但波动性高糖的代谢记忆效应导致并发症形成的具体机制以及治疗措施至今尚未完全阐明，一直是国内外研究的热点。
一、材料和方法
1.主动脉内皮的细胞的培养与传代
主动脉内皮细胞参照商品说明培养，培养14天。每组12小时更换新鲜培养基。每24小时对相关指标进行检测，最后实验结束后对相关指标进行检测，动态观察指标变化。
2.实验的分组与处理：
对照组：
（1）正常糖对照组：持续葡萄糖浓度为5mmol/L；
（2）恒定性高糖组：持续葡萄糖浓度为20mmol/L；
（3）低水平高糖波动组：培养基中葡萄糖浓度按高低循环的方式给予，即：20 mmol/L葡萄糖培养2 h，更换5 mmol/L葡萄糖培养3 h，进行3个循环，夜间9 h加5 mmol/L培养基，共作用24 h；
（4）高水平高糖波动组：培养基中葡萄糖浓度按高低循环的方式给予，即：30 mmol/L葡萄糖培养2 h，更换5 mmol/L葡萄糖培养3 h，进行3个循环，夜间9 h加5 mmol/L培养基，共作用24 h；
药物组：
（1）恒定性高糖＋α-硫辛酸（α-LA）组：如第2组处理方法，负载终浓度为62.5μmol/L的α-LA；
（2）低水平高糖波动＋α-硫辛酸（α-LA）组：如第3组处理方法，负载终浓度为62.5μmol/L的α-LA；
（3）高水平高糖波动＋α-硫辛酸（α-LA）组：如第4组处理方法，负载终浓度为62.5μmol/L的α-LA；
3.指标检测
1）活性氧（ROS）：用活性氧检测试剂盒进行检测，采用DCFH-DA探针，在激发波长为502nm，发射波长为530nm附近，使用流式细胞仪测定DCF荧光，从而测定细胞内活性氧水平。
2）丙二醛（MDA）：用MDA试剂盒进行检测，用TBA法在532nm处用分光光度计检测吸光度值，经标准曲线换算成其浓度，血清MDA含量 =（测定管吸光度-测定空白管吸光度）/（标准管吸光度-标准空白管吸光度）*10。
4.统计学处理
采用SPSS 13.0软件进行统计分析，计量数据用（x±s）进行正态性检验和方差齐性检验，若资料为正态分布及方差齐性，组间比较用t检验或方差分析，正态分布或用Mann-Whitney U检验。P<0.01为差异有统计学意义。
二、结果
1.波动性高血糖、恒定性高血糖和抗氧化剂a-硫辛酸对主动脉内皮细胞中MDA含量的影响
与对照组相比，高水平波动组、低水平波动组、恒定性高血糖组细胞上清MDA含量明显升高（t值分别为40.58、33.15、11.69，均P<0.01），高水平波动组、低水平波动组高于恒定性高血糖组（t=17.01、13.70、，均P<0.01），高水平波动组高于低水平波动组（t=9.85，均P<0.01）。采用抗氧化剂a-硫辛酸干预后，高水平波动组、低水平波动组、恒定性高血糖组细胞上清MDA含量明显下降（t值分别为15.58、11.60，10.27均P<0.01）（图1）。
图2 波动性高血糖、恒定性高血糖和抗氧化剂a-硫辛酸对主动脉内皮细胞ROS含量的影响。高水平波动组与对照组比较，aP<0.01，与高糖组比较，bP<0.01；与低水平波动组比较cP<0.01。
三、讨论
糖尿病慢性并发症的发生和发展及其预后不仅与整体血糖水平的升高密切相关，而且与血糖波动性也密切相关，血糖波动性越大，慢性并发症的发生率越高、严重程度越重、预后越差[6，7]。由此可见，血糖波动已成为一个独立于HbA1c的糖尿病慢性并发症的重要危险因素，波动性高血糖比恒定性高血糖更易促进糖尿病患者慢性血管并发症的发生与发展，其可能作为糖尿病控制的“金标准”。波动性高血糖已成为糖尿病血管并发症防治领域的一个研究热点。
“代谢记忆”即机体根据最初的血糖水平形成持续性地、级联性的血管内皮细胞炎性因子表达，从而导致细胞增殖、凋亡及功能紊乱，尽管严格控制血糖，数年内大血管和微血管病变仍持续发展。近年来大量研究已证实血糖水平与糖尿病并发症的发病率及严重程度之间存在明显不一致，这是因为高糖具有代谢记忆效应。尽管近年来大量的研究已证实了高糖“代谢记忆”的存在，但却鲜有关于波动性高血糖的代谢记忆的相关研究。氧化应激是指体内活性氧族（reactive oxygen species，ROS）的产生和抗氧化防御体系之间失衡，从而导致组织损伤的一种状态。研究发现ROS在高糖记忆中具有核心作用，线粒体过度产生的ROS可促进糖尿病并发症的发生，因此早期进行强化降糖治疗，减弱过度的氧化应激反应，可能减少并发症的发生率[8]。线粒体呼吸链蛋白由于糖基化作用，可以不依赖于已正常的血糖，记忆早期的高血糖环境刺激，级联性地形成恶性循环，不断地生成ROS，导致氧化应激，引起线粒体DNA损伤、基因表达改变、产生更多的ROS及细胞功能受损，从而形成高血糖的记忆效应。因此，线粒体氧化应激在高糖“代谢记忆”效应中可能具有重要作用，形成高血糖的记忆效应[9]。由此可见，氧化应激是形成高糖代谢记忆的基础，同时也是高糖代谢记忆参与糖尿病并发症的主要途径。但波动性高糖的代谢记忆效应导致并发症形成的具体机制以及治疗措施至今尚未完全阐明，一直是国内外研究的热点。
综上所述，本研究更深一步地探讨波动性高糖的“代谢记忆效应”及其导致更为严重的血管病变的机制。波动性高血糖比恒定性高血糖能引起更为强烈和持久的“代谢记忆效应”。波动性高血糖的“代谢记忆效应”不断反复被强化，进而引起了更为强烈和持久的氧化应激，参与糖尿病血管并发症的发生和发展。同时本研究为精细降糖，抗氧化应激提供了理论依据，为防治糖尿病血管并发症提供理论依据和技术基础，找到更有效的治疗方案来控制血糖，消除代谢记忆，延缓并发症的发展。
参考文献
[1]Wu N，Shen H，Liu H，Wang Y，Bai Y，Han P.Acute blood glucose fluctuation enhances rat aorta endothelial cell apoptosis，oxidative stress and pro-inflammatory cytokine expression in vivo.[J]．Cardiovasc Diabetol，2016 Aug 5；15（1）：109．
[2]Engerman RL，Kern TS Progression of incipient diabetic retinopathy during good glycemic control. Diabetes.1987，36：808–812.
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[8]Tonna S，El-Osta A，Cooper ME，Tikellis C. Metabolic memory and diabetic nephropathy：potential role for epigenetic mechanisms. Nat Rev Nephrol，2012，6（6）：332-341.
[9]Wu N，Shen H，Liu H，Wang Y，Bai Y，Han P.Acute blood glucose fluctuation enhances rat aorta endothelial cell apoptosis，oxidative stress and pro-inflammatory cytokine expression in vivo.See comment in PubMed Commons below Cardiovasc Diabetol，2016 Aug 5；15（1）：109.
论文作者:孙妍蕾,孙家忠,曹晨,肖婷,杨梅,邓向群（通讯作者
论文发表刊物:《中国误诊学杂志》2018年7月19期
论文发表时间:2018/8/24
标签：血糖论文; 并发症论文; 波动性论文; 葡萄糖论文; 内皮论文; 记忆论文; 主动脉论文; 《中国误诊学杂志》2018年7月19期论文;