张海艳[1]2004年在《北京油鸡体细胞库的构建及GPAT基因克隆》文中进行了进一步梳理北京油鸡,以肉味鲜美、蛋质佳良着称,是一个濒危的珍贵地方鸡种。本研究取北京油鸡9-13 日胚,采用组织块贴壁培养法,成功构建了北京油鸡胚胎成纤维样细胞库,细胞冻存密度为3~5×106 细胞/ml。经细胞生物学特性分析发现:细胞生长曲线呈“S”型,表现为潜伏期、对数生长期和水平期叁个时期;复苏后细胞活率保持在90%以上;染色体核型分析显示,细胞染色体保持二倍体数目,遗传性稳定;编码谷氨酰胺磷酸核糖焦磷酸酰胺转移酶(Glutamine phosphoribosylpyrophosphate amidotransferase GPAT or PPAT)的GPAT 基因克隆测序及分析表明:所克隆的953bp 片段与Genebank 中已发表编码序列的相似性为100%,进一步证明所培养细胞的遗传性稳定。本研究成功构建了北京油鸡胚胎成纤维样细胞库,对构建该细胞库的方法进行了研究,并对GPAT 基因进行了克隆与分析;旨在用体细胞冷冻保存法保存北京油鸡的遗传资源,同时为研究影响肌肉肌苷酸含量的遗传因素奠定基础。
于太永[2]2004年在《叁种中国地方畜禽成纤维细胞库构建及北京油鸡GPAT基因的克隆和序列分析》文中研究指明本论文以北京油鸡、狼山鸡、小尾寒羊为研究对象，采用组织块贴壁培养法和细胞冷冻技术构建成纤维细胞库，采用生长曲线、染色体分析、同工酶分析等方法对细胞生长动态、遗传稳定性、种间交叉污染等进行检测；采用基因克隆技术和相关分析软件对北京油鸡GPAT基因进行克隆和序列分析。旨在细胞水平上保存该叁种畜禽品种遗传资源，为在基因水平上保存北京油鸡特异性状奠定基础，为其他畜禽品种资源保存提供借鉴。试验结果如下： 1 所培养细胞的形态为长梭形或不规则叁角形，生长时呈火焰状或旋涡状走势。 2 北京油鸡、狼山鸡、小尾寒羊细胞冻存前活率分别为97.5％、96.0％和97.0％；复苏后的活率分别为95.0％、94.5％、94.7％。 3 该成纤维细胞生长曲线呈典型的“S”型，第2天起细胞倍增时间约为24h，第5天起细胞生长渐缓。 4 染色体分析结果表明，北京油鸡、狼山鸡、小尾寒羊成纤维细胞均以二倍体为主，二倍体染色体数目分别占所观察数目的87.1％、86.7％和93.4％；染色体结构变异率分别为1.5％、0.8％和1.4％；染色体形态与前人报道的其他品种相比略有不同。 5 LDH同工酶谱带分析表明，北京油鸡、狼山鸡成纤维细胞为两条谱带，小尾寒羊为5条谱带：MDH同工酶谱带分析叁种品种均为两条谱带，但小尾寒羊的迁移率明显高于北京油鸡、狼山鸡。 6 微生物污染检测显示，所培养的叁种畜禽品种的成纤维细胞均呈阴性。 7 脂质体介导质粒pEGFP-N_3分别转染叁种品种的成纤维细胞，10h后均可获得较好的转染效果。 8 北京油鸡GPAT基因克隆和序列分析结果显示：该基因长度为953bp，其中含288A，177C，272T，216G，(A+T)％为58.76％，(G+C)％为41.24％；与已发表的鸡的GPAT相比其同源性为84.63％，碱基变异率为15.37％，在365 bp处的左翼有5个碱基插入，在423-429bp处有5个碱基缺失，在631处有1个碱基缺失；与人的该基因序列相比，其同源性为81.41％，北京油鸡该序列在243bp和326bp处各有3个和2个碱基缺失；与小鼠的该基因序列相比，其同源性为78.09％，北京油鸡该序列在145bp和556bp处各有1个碱基缺失；利用Oligo6软件分析，该序列含有5个HaeⅢ酶切位点，有2个Alw26 Ⅰ酶切位点3个Taq Ⅰ酶切位点。
刘长青[3]2008年在《五指山小型猪基因组BAC文库的构建与北京油鸡风味特性基因的研究》文中进行了进一步梳理抽取一只雄性五指山小型猪静脉血,用于制备大分子量基因组DNA,制备好的基因组DNA经HindⅢ部分酶切后,二次脉冲电泳分离所需DNA片段。电洗脱回收100～400kb范围的片段,然后与pBeoBAC11载体连接,转化DH10B感受态细胞,经过培养,挑取和保存白色单克隆。基因组文库的质量一般从文库的平均插入、基因组覆盖率、嵌合率二方面来衡量。本研究所构建中国特有五指山小型猪基因组BAC文库,含有153,600个BAC克隆(保存在40个超级池,每个超级池由10个384孔板组成)。随机挑选了270个BAC克隆的插入片段进行估计,平均为152.3kb,其中空克隆的比例为1.3%,表明文库的覆盖率7.4倍,预计从文库中筛选到单拷贝基因的机率为99.93%。文库中78%的克隆插入大于100 kb,而且有部分克隆甚至大于300kb,这样大小的插入可以满足所有试验对于片段大小的要求。从各个方面来看,本文构建的文库都适用于功能基因和物理图谱构建的研究。构建北京油鸡成纤维靶细胞系,细胞冻存个体数达45个,冻存细胞支数达170支,每支细胞含量为3～5×106细胞/ml,保证北京油鸡遗传基因的群体多样性,同时为外源基因在细胞中的表达提供了良好的体外培养靶细胞。使北京油鸡这一国家重要遗传资源在细胞水平上得以保存下来,并为相关遗传学研究提供了有效的理论依据和理想的生物材料。通过细胞形态学观察、细菌、真菌、支原体检测、生长曲线、核型分析及同工酶检测等多项细胞系质量检测,结果表明建立的北京油鸡成纤维细胞系性质稳定,生物学性能正常,各项指标均达到美国典型培养物保藏中心细胞系鉴定标准。利用6种荧光蛋白基因在所建细胞系中得到良好的表达,说明细胞具有良好的被转染能力,从基因表达的水平上进一步确定细胞系的遗传性能良好,为进行北京油鸡风味特色功能基因的表达、定位和克隆化细胞的筛选鉴定了基础。采用RT-PCR与RACE方法扩增出北京油鸡腺苷酸琥珀酸裂解酶(ADSL)基因全长cDNA序列,该基因开放阅读框长为1455个碱基,编码485个氨基酸;构建成北京油鸡ADSL基因融合表达载体pGEX-ADSL,转化大肠杆菌BL2(1DE3),IPTG诱导表达。经SDS-PAGE电泳显示重组融合蛋白在分子量约为80.5kD处有特异的蛋白条带,与预期分子量大小一致,等电点为6.79。该蛋白的表达量随诱导时间的延长而增加,5h达最高值,达到细胞总蛋白的26.9%,且主要以不可溶的包涵体形式存在,经Glutathione Sepharase 4B凝胶纯化后用Western-blotting检测表明其为北京油鸡ADSL蛋白,为其进一步的具有生物学功能研究及其应用鉴定了基础。提取北京油鸡心、肝、脾、肺、肾、脑、腿肌与胸肌等不同组织的总RNA,利用RT-PCR方法扩增检测purH基因mRNA的差异表达水平。构建带有荧光蛋白报告基因的真核重组表达载体pEGFP-N3-purH,pEYFP-N1-purH和pDsRed1-N1-purH。并利用G418药物筛选和对荧光强度高的单克隆化培养。实验结果:在转染后24、48和72h,重组融合蛋白转染率在10.3%～53.2%之间。pEGFP-N3-purH,pEYFP-N1-purH与pDsRed-N1-purH在北京油鸡成纤维细胞的细胞核与细胞质均有分布,呈弥散分布。经药物筛选和单克隆化培养,获得表达pEGFP-N3-purH,pEYFP-N1-purH与pDsRed-N1-purH融合蛋白的阳性克隆细胞株,经RT-PCR扩增与Western blot检测确认了purH融合蛋白基因已经整合到北京油鸡成纤维细胞的基因组中,获得正常表达。本研究构建了高质量的五指山小型猪基因组BAC文库,从全基因组水平上保存了五指山猪的遗传资源,为功能基因组学研究和后基因组学研究提供了重要的试验材料和实物基础。创建的北京油鸡成纤维靶细胞系从细胞水平保存了北京油鸡的基因资源,同时为风味特色基因的表达提供重要的靶细胞。由于供体细胞的质量对于转基因动物克隆非常重要,本研究利用抗性筛选和克隆化培养获得北京油鸡ADSL基因1株与purH基因3株的阳性细胞株,一方面为北京油鸡转基因动物克隆提供了重要的试验材料,为进一步培育出风味优良、肉质鲜美的转基因鸡提供优质供体细胞;另一方面对于鉴定ADSL与purH基因是否是控制北京油鸡风味特性优良的主效基因,以期对于提高我国地方鸡种种质资源创新,实现育种理论和关键技术新突破等具有一定指导作用。
参考文献：
[1]. 北京油鸡体细胞库的构建及GPAT基因克隆[D]. 张海艳. 山西农业大学. 2004
[2]. 叁种中国地方畜禽成纤维细胞库构建及北京油鸡GPAT基因的克隆和序列分析[D]. 于太永. 西北农林科技大学. 2004
[3]. 五指山小型猪基因组BAC文库的构建与北京油鸡风味特性基因的研究[D]. 刘长青. 中国海洋大学. 2008