郝建军[1]1997年在《激素和生长因子与牙乳头细胞、牙髓细胞、牙胚分化和矿化关系的体外实验研究》文中研究表明成牙本质细胞(Odontoblast)是牙髓组织中最重要的细胞，它与牙本质的形成和维持有着极密切的关系，在牙齿发育和牙髓修复等方面处于举足轻重的地位。随着生物医学的飞速发展，对成牙本质细胞的研究已从单纯的组织形态的现象观察迈进分子机理和基因调控的本质研究。但由于成牙本质细胞位于牙齿硬组织内，组织量少，活体取材困难，加之属于终末分化的永久性细胞，故目前尚未见到有关成牙本质细胞单独体外培养成功的报道。本研究针对上述问题，采用现代细胞培养技术，在体外建立人成牙本质细胞的前体细胞——牙乳头细胞和牙髓细胞的有限细胞系，结合处于成牙本质细胞分化关键时期的大鼠牙胚，从细胞和分子水平探讨了激素和生长因子与牙髓细胞、牙乳头细胞、牙胚的分化和矿化的影响，实验分为三个部分：1、体外人牙髓细胞、人牙乳头细胞、大鼠牙胚实验模型的建立；2、体外人牙乳头细胞的矿化特征；3、生长因子与人、大鼠牙胚、人牙髓细胞分化关系的研究。 一、体外人牙髓细胞、人牙乳头细胞、大鼠牙胚实验模型的建立 以牛肌腱胶原凝胶体作为滋养层，采用组织块法对人牙髓、牙周和牙龈细胞进行体外培养。结果发现：牛肌腱胶原滋养层提高了人牙髓、牙周和牙龈组织块的贴附率和细胞的生存率，其中人牙髓、牙周组织在铺有牛肌腱胶原的培养瓶中进行原代培养，其成功率分别为42.9％和33.3％，与对照组相比有显著的统计学差异(P＜0.01，P＜0.05)。所培养的上述三种细胞能适应体外培养环境，生长稳定，形态上以梭形或矛状为主，可以作为牙髓、牙周和牙龈组织研究的细胞模型。 为了建立体外培养人牙乳头细胞的方法，同时比较酶消化法和组织块贴壁法对培养结果的影响，本组选用合法堕胎的8月龄男胎的乳牙牙乳头组织，按A、C区和B、D区将组织分成两组，一组用酶消化法获取细胞，即0.2％胰酶和0.02％ EDTA在37℃条件下消化20min；另一组采用常规组织块贴壁法。结果显示：在酶消化法组中原代细胞按形态分为梭形、星形纤维细胞样和内皮样三种。内皮细胞在贴壁培养组和继代的酶消
陈新梅[2]1998年在《甲状旁腺激素对牙乳头间充质细胞、组织影响的实验研究》文中研究说明成牙本质细胞是从牙胚的牙乳头间充质细胞或成熟牙髓细胞分化而来，其分化的过程和机理研究是牙髓生物学重要的研究方向之一。牙乳头间充质细胞作为牙胚发育过程中唯一具有分化为成牙本质细胞能力的间充质细胞群，已成为研究牙齿发育特别是成牙本质细胞分化和牙本质形成的重要模型。已知许多激素和生长因子参与牙胚的发育过程，对成牙本质细胞分化和牙本质形成有一定的调节作用。甲状旁腺激素(parathyroid hormone，PTH)是调节血钙使之维持在正常水平的一种重要物质，研究表明：PTH可引起牙髓细胞功能改变、影响牙本质形成。但其作用是通过调节血浆钙磷浓度间接影响牙齿的发育，或是直接调节成牙本质细胞分化、牙本质基质形成和矿化，有待于研究确定。本研究针对这些问题，采用现代细胞培养技术，利用体外建立的人成牙本质细胞的前体细胞—牙乳头间充质细胞的实验模型，结合处于成牙本质细胞分化关键时期的大鼠牙胚，以及摘除甲状旁腺后的大鼠，从细胞和基因水平上探讨PTH对牙乳头间充质细胞和牙胚的分化和矿化、以及对牙本质形成等的影响， 1 甲状旁腺激素对人牙乳头间充质细胞生物学特性影响的体外研究 采用的胚胎乳牙处于牙齿的形成期，由于部分牙本质硬组织已形成，机械分离牙组织与牙乳头，即可将外胚层组织与牙乳头分开，从而获取较为单一的牙乳头组织。细胞的生长状况和形态结构符合成纤维样细胞，第四代以后的细胞增殖稳定，细胞生长良好，适宜于进行各种实验观察。人牙乳头间充质细胞的培养成功，为进一步研究成牙本质细胞的分化、牙本质形成及其影响因素提供了重要的实验模型。 为观察人牙乳头间充质细胞在PTH诱导下的细胞增殖情况，采用流式细胞仪(FCM)分析、~3H-TdR掺入试验和透射电镜(TEM)，观察和分析体外培养的人牙乳头间充质细胞经PTH作用后DNA合成、细胞周期和超微结构的变化情况。结果：与对照组相比，不同浓度的PTH均不影响体外培养的人牙乳头间充质细胞~3H-TdR掺入比例；各实验组的G1％、S％和反映细胞增殖活力的增殖指数PrI值亦无显著性差异；
逄键梁[3]2003年在《牙本质基质蛋白1在牙胚发育及牙髓损伤修复中的作用》文中认为近年来，牙本质非胶原蛋白(NCPs)在牙齿发育和牙髓损伤修复中作用的研究已成为牙髓生物学研究的热点，NCPs主要包括牙本质特异性蛋白、矿化组织特异性蛋白、蛋白多糖、糖胺多糖、少量磷脂和一些生长因子等。它们在成牙本质细胞诱导、分化和牙本质矿化中的作用越来越受到关注。到目前为止，大多数的研究集中于牙本质特异性蛋白，而关于矿化组织特异性蛋白在牙胚发育中相关的功能研究较少。它们是如何参与牙胚发育，如何调节牙本质矿化过程，是否参与牙髓损伤修复过程，有待于进一步研究。 牙本质基质蛋白1(dentin matrix protein 1，DMP1)是矿化组织特异性蛋白中的重要成员之一，是一种新的富含丝氨酸的酸性磷酸化蛋白，其组成中有1/3为门冬氨酸和谷氨酸，等电点为3.68。在不同的物种中，DMP1的基因结构相似，具有高度同源性，并有一些高度保守区。DMP1与骨涎蛋白(BSP)和骨桥素(OPN)结构相似，所以DMP1的功能及生物学活性可能与二者有相似之处。现有的研究表明：DMP1在牙胚中主要表达于成牙本质细胞，在多潜能细胞和间充质源性细胞中过表达DMP1能够诱导这些细胞分化和形成成牙本质细胞样细胞，并且能够促进矿化结节的形成。故推测其可能在牙本质形成和矿化中有重要作用。 第四军医大学硕士学位论文 目前对 DMP的研究主要集中于生物学结构和理化性质，针对 DMP功能的研究较少，有关 DMP在牙本质形成和牙髓损伤修复中的作用及作用机理的报道甚少。本实验利用高杰制备的抗 DMP单克隆抗体，初步探讨成牙本质细胞是如何形成 DMP，在形成时受哪些因子调控，以及在牙髓损伤修复中的作用，并利用体外培养国外最新建立的小鼠克隆化永生化成牙本质细胞系MDPC－23，来诠释该蛋白在牙本质形成和矿化中的作用机理。以期揭示DMP的生物学功能和它在细胞分化、牙本质形成及牙髓损伤修复中的作用，为提高活髓保存的效果奠定生物学基础。研究内容及结果如下：一．DMPI在人牙胚发育过程中的表达 取4刁月龄胎儿3个，取上下颌骨，制备人牙胚发育各期标本，采用免疫组织化学方法观察DMPI在人牙胚不同阶段的表达情况。结果显示，DMPI主要表达于钟状晚期分泌型成牙本质细胞，在前成牙本质细胞、前成釉细胞和牙乳头细胞中表达弱阳性，在成釉细胞中有一过性表达，即在釉基质开始形成但没有形成矿化时的分泌型成釉细胞中有表达，但在随后的分泌型成釉细胞中表达渐弱至阴性。DMP在人牙胚发育不同时期的表达及变化，提示DMPI在成牙本质细胞和成釉细胞分化成熟以及牙本质形成过程中发挥着重要的作用，DMPI在成釉细胞的表达模式可以推测DMPI在启动釉质形成中可能行使细胞信号分子作用。二．DMPI在人不同龋坏牙齿中的免疫定位 通过免疫组织化学方法检测人不同龋坏恒牙中 DMP的表达变化，并对其表达量进行半定量分析。结果发现，DMP在正常人恒牙牙髓表达阴性；DMP在龋坏恒牙中表达如下：浅龋部位的成牙本质细胞胞浆和前期牙本质中有较弱的阳性表达，中龋牙髓龋损下方牙髓细胞增生显著，成牙本质细胞层明显增厚、染色增强，细胞核染色数目比健康恒牙增多。深龋牙髓成牙本质细胞层空泡变性，只有一层扁平的成牙本质细胞样细胞，中龋和深龋组中成牙本质细胞和成牙本质细胞样细胞胞浆与胞突阳性表达DMPI，而在深龋 3 第四军医大学硕士学位论文组修复性牙本质中呈强阳性表达。在龋损下成牙本质细胞中表达 DMP，说明该蛋白参与牙髓损伤修复过程。三．甲状旁腺激素对人牙乳头细胞DMPI表达的影响 通过免疫组化方法，观察甲状旁腺激素一arathyroid hormone，PTH）对体外培养的人牙乳头细胞 DMP表达的影啊。原代方法培养出人牙乳头细胞，用不同浓度的甲状旁腺激素刺激细胞。结果显示，PTH可刺激人牙乳头细胞DMPI的表达，诱导的DMPI主要表达于细胞胞浆内，呈一定的浓度依赖性，0．3 pg加L为刺激最佳浓度。PTH能够刺激人乳头细胞产生 DMPI，对牙乳头细胞向成牙本质细胞分化有一定促进作用，可能是成牙本质细胞分化的重要介质之一。而且，在PTH的刺激下，牙乳头细胞有向成牙本质细胞分化的特性，并促进该细胞 DMP的表达，证明 PTH可能介导成牙本质细胞成熟和分泌活动，诱导的 DMP也可能参与成牙本质细胞分化过程。四．DMPI反义核酸对MDPC上3细胞碱性磷酸酶活性和矿化能力的影响 以稳定表达DMPI的MDPC－23细胞为靶细胞、不同浓度DMPI反义核酸（AS－ODN）为阻断剂，观察不同作用时间对MDPC－23细胞ALP活性的影响。用Western blot法检测 10 pmo讥 AS－ODN不同作用寸间台胞DMPI表达情况，并观察其连续作用 10d对该细胞矿化能力的影响。结果发现，与正常组和S－ODN组相比较，不同浓度的AS－ODN能够降低MDPC－23细胞ALP活性，其中 10 pmo凡 AS－ODN降低 ALP活性最为显著（作用 sd时 OD值最低，为 0．3378t2刀E）。West
杨帆[4]2003年在《牙胚成纤维细胞生长因子18基因克隆、表达及其功能研究》文中认为FGF18是一个新近克隆的FGF家族成员，1998年首次应用PCR方法从鼠胚(E14.5)中分离出来，与FGF8和FGF17属于同一亚家族。研究证实FGF18是一种发育组织重要的分泌性信号分子，在骨骼和软骨的发育中发挥着重要的作用，单纯FGF18的缺失就会严重影响成骨和软骨的形成，那么作为同样具有矿化能力的牙齿，FGF18是否也参与调控其发育和损伤修复的过程呢?本研究带着这个疑问对FGF18在牙胚发育和牙髓组织中的作用进行探索性研究，为今后的研究奠定理论基础和实验依据，具体内容包括： 一、小鼠牙胚FGF18的基因克隆和序列分析 采用异硫氰酸胍一步法从新生小鼠牙胚组织中抽提总RNA，用Oligo(dt)作引物逆转录合成牙胚cDNA，然后利用巢式PCR技术，根据已公布的FGF18序列，设计一对引物从cDNA中扩增出约621bp的特异片段，将扩增的基因片段插入pGEM-T克隆载体，转化大肠杆菌DH5α，挑选阳性克隆，提取质粒DNA，通过限制性酶切进行鉴定并进行核苷酸序列测定。结果表明：成功克隆到小鼠牙胚FGF18全编码区基因片段，序列与GenBank中收录的FGF18cDNA序列一致，初步说明FGF18参与牙胚的发育。 二、FGF18在牙胚发育和牙髓组织中的作用 首先设计一对去除FGF18信号肽基因序列的引物，然后利用PCR技术从 第四军医大学博士学位论文小鼠牙肛 CDNA中克隆约 524hp的编码区片段，并连人表达载体 pRSETB中，转化大肠杆菌BLZI（DE3）plySS＊ IPTG诱导表达后，12％SDS－PAGE凝胶电泳鉴定，发现在相对分子量为 22KD处出现预计的 FGF融合蛋白表达条带，经大量诱导表达和 Ni－NTA柱亲和层析纯化，获得了高纯度的 FGF原核表达产物。以 FGF原核表达产物为抗原，混入完全弗氏佐剂，免疫新西兰大白兔，将获得的多克隆抗血清经硫酸胺初步纯化后，ELISA实验检测抗体效价，Western Blot检测抗体的特异性，结果表明成功制备兔抗鼠 FGF多克隆抗体。 然后采用自行制备的抗体对牙胚发育和牙髓组织中 FGF的时空表达形式进行免疫组化研究。 l、在牙胚发育中：蕾状期FGF18在成釉器和口腔粘膜上皮细胞表达阳性，而在周围密集的间充质细胞表达阴性；帽状期在内釉上皮、外釉上皮、牙胚间充质和牙囊未见阳性表达；钟状早期牙胚，FGF在内釉上皮细胞和外釉上皮细胞阳性表达，牙乳头细胞弱阳性表达，星网状层和中间层细胞阴性，牙囊细胞表达阳性，在牙槽骨和软骨中呈阳性表达；钟状晚期，内釉上皮和外釉上皮分化为成釉细胞和成牙本质细胞，并分泌釉质和牙本质基质，此时 FGF在具有分泌功能的成牙本质细胞和成釉细胞表达强阳性，牙乳头细胞和牙囊细胞阳性，星网状层阴性。提示FGF18可能参与牙胚的发生、细胞分化和基质矿化，但对牙胚的形态发生可能作用较小。 2、在牙髓组织中：正常牙髓成牙本质细胞、牙髓细胞以及血管内皮细胞中未见有 FGF阳性表达，但在炎症组 FGF在成牙本质细胞和血管内皮细胞阳性表达，牙髓细胞弱阳性，表明 FGF可能参与牙髓炎症和损伤修复三、FGF18对牙乳头细胞作用机制的研究 首先设计一对引物，用于构建 FGFIS真核表达载体，利用 PCR技术从新生小鼠CDNA中克隆540hp的FGF18基因片段，然后将片段连入真核表达载体psecTagZB 中，构建psecTagZB－FGF18重组质粒，在LipofectAMINEm 2000 4 第四军医大学博士学位论文脂质体介导下将psecTagZBF 重组质粒转染进哺乳动物细胞COS刁，通过ELISA方法鉴定COS－7上清中的FGF18真核表达产物。采用MTT法、酶动力法以及免疫组化方法检测COS－7上清中FGF18对牙乳头细胞增殖、ALPase以及 1型胶原合成的影响，结果发现 FGF显著促进人牙乳头间充质细胞的增殖能力（P＜0刀5），并增加 ALPase的分泌（P＜0刀5，这种作用呈一定的时间、剂量依赖性，此外F＊F18可明显增加细胞1型胶原的合成（P＜0刀1），提示 FGF在人牙乳头间充质细胞的分化和矿化过程中可能起着重要的调节作用，但它的确切调控机制仍需一些更能模拟体内牙乳头细胞分化过程的实验加以验证。 综上所述，FGF参与了牙胚的发育，并在牙胚的发生、成牙本质细胞分化和基质矿化中发挥着一定的调控作用，此外 FGF还参与牙髓炎症和损伤修复。今后的工作应针对其调控作用的分子机制进行更深入的研究，以全面揭示 FGFIS的功能作用。
陈小红[5]2007年在《大鼠脂肪干细胞（rADSCs）的分离鉴定及向成牙本质细胞分化的实验研究》文中认为背景干细胞(stem cell)是一种具有多向分化潜能和自我复制功能的未分化细胞,在特定的条件下,可以分化为不同的功能细胞,形成多种组织和器官。按来源分为胚胎干细胞和成体干细胞。胚胎干细胞(embryonic stem cell, ES)的分化和增殖构成个体发育的基础;而成体干细胞(adult stem cell, AS)的进一步分化则是成体组织、器官修复再生的基础,具有来源广泛、可塑性强、无排斥反应等优势成为近年来研究的热点之一。脂肪干细胞(adipose derived stem cell, ADSC)是一种成体干细胞,具有向多种细胞分化的潜能,经过体外培养和体内接种可被诱导分化为骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、血管内皮细胞、肌肉细胞及心肌细胞等。由于脂肪干细胞具有取材容易、获得率高、对组织损伤小等优点,故在再生医学中占有重要的地位,并可为组织工程提高可靠的细胞来源,为临床应用奠定坚实的基础。目的本研究通过酶消化法分离培养脂肪干细胞,运用牙胚细胞条件培养液体外诱导脂肪干细胞向成牙本质样细胞分化,再将脂肪干细胞与成釉器上皮细胞混合接种入体内建立牙髓-牙本质复合体模型,证实大鼠脂肪干细胞的成牙潜能,为牙齿组织工程化研究获得大量、稳定、可靠的种子细胞提供理论和实验依据;并为体内、外成牙微环境的机理研究构建新的模型。材料和方法1.大鼠脂肪干细胞的培养、鉴定及定向诱导分化出生后4d SD仔鼠腹股沟处取得脂肪组织,酶消化法培养脂肪干细胞,免疫细胞化学法染色检测Vimentin、CD29、CD44、CK,为进一步研究其分化特性奠定了基础。将生长良好的ADSC培养于含β-甘油磷酸钠、维生素C、地塞米松的矿化液中,检测碱性磷酸酶活性,免疫细胞化学法检测骨钙素和I型胶原的表达,Von Kossa染色检测矿化结节。2.体外诱导大鼠脂肪干细胞向成牙本质细胞分化将生长良好的ADSC与牙胚细胞条件培养液进行共培养,进行形态学观察,免疫细胞化学法检测牙本质涎蛋白(DSP)的表达,RT-PCR检测牙本质涎磷蛋白(DSPP)和牙本质基质蛋白1(DMP-1)的表达。3.体内诱导大鼠脂肪干细胞构建组织工程牙本质-牙髓复合体将标记后的ADSC分别与成釉器上皮细胞和聚醚酯弹性体(PTSG)材料混和后接种至大鼠肾被膜下,12周取材,进行组织学观察和免疫细胞化学检测。结果1.脂肪干细胞镜下形态为成纤维样,细胞群体倍增时间为42.2h,免疫细胞化学方法检测,抗Vimentin、CD29、CD44染色阳性,抗CK染色阴性,成骨诱导后细胞由成纤维样变为圆形或立方形外形,碱性磷酸酶升高,免疫细胞化学检测骨钙素和I型胶原表达阳性,出现矿化结节,表明ADSC已向成骨细胞转化。2.牙胚细胞条件培养液诱导后的ADSC变长,部分出现极性改变,免疫细胞化学方法检测胞浆DSP阳性,RT-PCR检测DSPP和DMP1阳性表达,表明ADSC已分化为有成牙本质细胞表型的细胞。3.体内移植物组织学检测显示牙尖样结构形成,成釉细胞、釉质、前期牙本质、成牙本质细胞由外向内平行排列,成牙本质细胞处于极化和分泌状态,DSP染色阳性,进一步说明了ADSC能被诱导分化为成牙本质细胞。结论:1.脂肪干细胞为多能干细胞,能在体外定向诱导分化为成骨细胞。2.牙胚细胞条件培养液能在体外诱导脂肪干细胞分化为具有成牙本质细胞表型的细胞。3.将脂肪干细胞与成釉细胞及支架材料复合在体内能成功构建牙髓-牙本质复合体模型。
庞楠[6]2010年在《PVA作为构建组织工程牙髓牙本质复合体支架材料的体外实验研究》文中认为种子细胞、支架材料以及生长因子微环境是构建组织工程人工牙的三要素,而牙髓牙本质复合体是牙齿的主体,也是构建组织工程化牙齿的第一步。因此,优选适宜的种子细胞以及性能良好的支架材料成为组织工程牙髓牙本质复合体研究中的重要内容。在以往的研究中,人们用多孔羟基磷灰石-磷酸三钙(hydroxyapatite ceramic-tricalcium phosphate,HA-TCP)、生物陶瓷、Collagraft、聚羟基乙酸(polyglycolic acid,PGA)等支架材料和种子细胞相复合,然后移植到实验动物的体内构建组织工程化牙髓牙本质复合体,并取得了初步的成果。但用这些支架材料所构建的牙髓牙本质复合体样物质具有一个共同的缺陷:即多数形成的是混杂有管状牙本质和非特异性矿化基质的组织团块,而不是真正意义上的牙髓牙本质复合体。导致该现象的一个可能的原因是这些支架材料本身的性能尚不完善。因此,寻找一种新型的支架材料就显得尤为重要。由于具有良好的亲水性,聚乙烯醇(polyvinyl alcohol,PVA)在生物医学领域一直得到广泛的应用。有研究表明,PVA可通过抑制ERK1/2信号途径,从而诱导牙胚细胞矿化分化[37]。由此我们可以推测,如果PVA对形成牙髓牙本质复合体的种子细胞具有矿化诱导作用,那么用该种子细胞接种于PVA三维支架材料,辅以适当的生长因子微环境,再在裸鼠体内移植,是否可形成较为成熟的牙髓牙本质复合体呢?想要证明这一点,首先要证明PVA在构建组织工程化牙髓牙本质复合体的过程中中具有积极的促进作用。例如,PVA作为一种支架材料,其本身即可促进种子细胞矿化分化。因此,本实验采用SD大鼠牙髓细胞为实验细胞,实验目的即在于证明PVA是否对其也具有矿化诱导作用。我们首先进行了牙髓细胞的原代培养及鉴定,再以传代培养的第四代SD大鼠牙髓细胞为细胞来源,分别以PVA、矿化诱导液、完全型DMEM培养液进行培养,然后以ALP(alkaline phosphatase,碱性磷酸酶)活性、量化的茜素红染色分析、Von Kossa染色等指标进行检测,结果表明经PVA培养的牙髓细胞其ALP活性及茜素红分析在7天的培养过程中显示出明显持续增高的趋势,用PVA连续诱导4周的大鼠牙髓细胞Von Kossa染色阳性。实验证实了PVA本身对大鼠牙髓细胞具有良好的矿化诱导性能,初步探索了PVA作为构建组织工程牙髓牙本质复合体支架材料的潜在可能性。
程敏[7]2008年在《牙发育过程中TGF-β_1、BMP-2、bFGF和E-Cadherin的表达及相关技术研究》文中提出目前国内外对牙发育调控机制的研究已由细胞水平深入到了分子水平。一些生物分子以不同的时空表达模式在分子水平对牙发育的过程进行调控,主要包括信号分子、信号分子受体和转录因子等。这些分子形成了调节牙发育的信号网络系统。学者们对该信号网络系统进行了较多的研究工作,然而迄今为止有关此调控的分子机制尚不十分清楚。对牙发育机制方面的研究,常选用动物牙胚作为研究器官发育、形态发生和细胞分化的经典模型。以往的研究多选用大鼠、小鼠和犬的牙胚作为实验模型,近年来逐渐有报道采用人牙胚作为研究对象,但报道较少。本实验分别收集了人牙胚、出生后乳鼠及犬乳恒牙替换期组织学标本,常规切片制片,对牙胚发生、发育过程作系统观察,采用免疫组织化学方法,研究TGF-β1、BMP-2、bFGF、E-Cadherin四种生物分子在牙胚发育过程中的时空表达模式及可能的调控机制。本研究结果表明;TGF-β1、BMP-2、bFGF、E-Cadherin在牙胚发育的不同时期均有不同程度的时空表达,且相互之间存在着一定的时间和空间上的一致性和种属之间的一致性。它们在牙胚发育的早期及晚期均有不同程度的表达,说明在牙冠、牙根及牙周组织的发育中均参与了牙胚组织细胞增殖、分化及硬组织的矿化,参与了牙胚发育的分子调控。同时,本文还对口腔硬组织切片和组织化学染色及其应用进行了研究。针对牙和骨骼硬脆致密,难切易碎,牙龈、牙周膜和牙髓易受损伤分离及常规切片所出现的问题,对制片技术和染色方法进行了改良。改良方法制作的牙齿、骨骼、牙及牙周组织切片和常规HE染色,镜检各种组织和细胞形态结构清晰,切片质量和染色效果优良。本研究弥补了国内目前尚无口腔硬组织切片组织化学染色的空白。目前,改良的组织化学染色法,已逐渐用于牙发育、骨折愈合、骨缺损修复、颞下颌关节损伤、腭裂、正畸、种植、口腔材料和药物等实验研究,并取得了满意结果。
陆彦玲[8]2017年在《BMP2与DXM对人牙髓细胞增殖和分化的影响》文中研究指明牙髓细胞(hDPCs)具有自我复制更新和多向分化克隆的潜能,可在生物因子的作用下可以向成牙本质细胞分化。骨形态发生蛋-2(BMP-2)和地塞米松(DXM)是常见的成骨诱导因子,可以使牙髓细胞向成牙本质样细胞诱导分化。在成牙本质细胞形成过程中亦发挥着重要作用。本研究的目的为探讨BMP-2和DXM在诱导牙髓细胞增殖和牙向分化的作用以及两者联合运用是否能增强诱导效果,为牙髓细胞分化的实验提供生物因子优化组合的实验依据。目的:1、建立hDPCs培养模型,体外分离并培养hDPCs,鉴定细胞来源。2、探讨BMP-2和DXM以及两者联合作用矿化及诱导hDPCs体外增殖及向成牙本质细胞分化的影响。方法:1、hDPCs的体外分离、培养及鉴定:收集我院外科门诊15-30周岁患者无牙体牙髓牙周疾病的正畸牙或智齿,半小时之内迅速至无菌条件下劈开牙体取出髓腔中牙髓组织,并将其剪成1mm3小块,置于培养瓶中,加入含20%优质胎牛血清的高糖DMEM培养液,于恒温培养箱中培养,设置条件为37℃、5%CO2浓度。待细胞生长融合至25cm3培养瓶瓶底80%后,用无菌巴氏吸管加入0.25%胰酶,消化传代细胞。取生长状态良好的第3-5代细胞行波形蛋白和角蛋白免疫化学染色鉴定。冻存稳定传代的3-6代hDPCs待用。2、BMP-2和DXM分别及联合作用对hDPCs增殖的影响:用浓度为BMP-2(100ng/ml)、DXM(1×10-8mol/l)、BMP-2(100ng/ml)+DXM(1×10-8mol/l)诱导稳定传代的hDPCs,与对照组比较(仅含10%FBS的高糖DMEM培养液),在1day、3day、5day、7day消化细胞,制成细胞悬浊液,计数,绘制各组细胞生长曲线。3、BMP-2和DXM分别及联合作用对h DPC向成牙本质细胞分化的影响:诱导步骤同上,利用RT-PCR检测BMP-2和DXM分别及联合作用5day、7day后成牙本质标记基因DSPP、ALP、DMP-1的表达。作用14day后进行碱性磷酸酶染色检测ALP活性。作用21day,进行茜素红矿化结节染色,定量检测矿化结节分析成牙本质分化情况。结果:1、hDPCs的体外分离、培养及鉴定:(1)培养3-5天后,可见有梭型纤维状细胞爬出,7天左右细胞密集生长融合至瓶底的80%,可稳定传代,保持一定生长能力。(3)经波形蛋白、角蛋白免疫化学染色可见,细胞波形蛋白阳性表达,角蛋白阴性表达,说明培养的细胞来源于间叶组织中胚层,符合牙髓细胞的生物学特征。2、BMP-2和DXM分别及联合作用对hDPCs增殖的影响:随培养时间延长,各组细胞数均逐渐增加,5 d时达峰值,后逐渐下降,7 d降至3 d时水平。培养1d时,各组细胞数无明显差异(P>0.05);培养3 d时BMP-2组、BMP-2+DXM组细胞数显著高于DXM、对照组(P<0.05)BMP-2组、BMP-2+DXM组间无明显差异,DXM组、对照组间无明显差异(P>0.05);5 d时BMP-2、DXM、BMP-2+DXM组细胞数显著高于对照组,BMP-2+DXM组>BMP-2组>DXM组>对照组(P<0.05);7d时细胞数下降,BMP-2+DXM组>BMP-2组>对照组>DXM组(P<0.05)。3、BMP-2和DXM分别及联合作用对hDPCs分化的影响:经诱导后各处组的成牙本质形成标记基因DSPP、DMP-1、ALP均有表达,碱性磷酸酶染色染色阳性,矿化结节茜素红染色阳性,说明牙髓细胞可以在BMP-2、DXM的诱导下分化为成牙本质细胞,RT-PCR检测示,经诱导5d,BMP-2、DXM、BMP-2+DXM组细胞的ALP、DSPP、DMP-1表达较对照组均上调,其中BMP-2+DXM组表达最高。BMP-2组与DXM组无统计学差异(P>0.05),与BMP-2+DXM组、对两组有差异(P<0.05);DXM组与BMP-2组无统计学差异(P>0.05),与BMP-2+DXM组、对两组有差异(P<0.05);BMP-2+DXM组、对照组与其他组间均存在差异(P<0.05);提示经BMP-2和DXM诱导后各组hDPCs的分化标志基因强烈表达。经诱导7d各处理组基因表达量趋于同化平稳。DSPP基因表达量BMP-2组、DXM组、BMP-2+DXM组大于对照组(P<0.05),但BMP-2组、DXM组、BMP-2+DXM组的组间比较无明显差异(P>0.05);同时,ALP、DMP-1基因表达量四个组间无明显差异(P>0.05)。培养14 d,经碱性磷酸酶染色检测,BMP-2组、DXM组、BMP-2+DXM组、对照组可见不同着色程度的紫黑色沉淀,其中BMP-2+DXM组着色程度最深,表现为强阳性;经半定量测定阳性染色率:BMP-2组、DXM组、BMP-2+DXM组、对照组依次为0.368±0.004,0.337±0.022,0.849±0.013,0.181±0.008,BMP-2+DXM组>BMP-2组≈DXM组>D组,BMP-2+DXM组、对照组与其他各组均有差异,差异有统计学意义(P<0.05),BMP-2组、DXM组差异无统计学意义(P>0.05),与BMP-2+DXM组、对照组均有差异,差异有统计学意义(P<0.05)。培养21d,茜素红染色示,BMP-2组、DXM组、BMP-2+DXM组均出现大小及着色程度不一的橘红色矿化结节,其中BMP-2+DXM组矿化结节呈片状大面积分布,BMP-2组、DXM组呈散在分布;对照组无矿化结节形成。BMP-2组、DXM组、BMP-2+DXM组、对照组A值比较为BMP-2+DXM组>BMP-2组>DXM组>对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:1、利用组织块培养法分离培养hDPCs,可以成功获得稳定传代的牙髓细胞系,为后续各部分实验提供了基础。2、探究并比较了BMP2和DXM两者联合和单独作用对牙髓细胞增殖和分化的影响,丰富了对牙髓细胞分化机制作用的认识,为研究促进牙髓细胞增殖作用和分化作用的细胞因子组合及作用时间提供了依据。
余擎[9]2002年在《核心结合因子a1在牙齿发育矿化中作用机制的研究》文中指出牙齿的发育矿化是上皮和间充质相互作用的结果，研究表明，众多的基因参与了牙齿的发育矿化过程，包括生长因子及其受体、信号分子、转录因子和细胞外基质蛋白等。转录因子是一类可以通过与下游靶DNA结合，从而调控下游基因转录的分子，它们接受来自生长因子等方面的信号，再将这些指令具体地传递给直接执行功能的蛋白分子。cbfal是一种成骨分化特异性转录因子，可以诱导成骨前体细胞合成和分泌ALP、OC、OPN、BSP等矿化相关蛋白，向成骨细胞分化。最近国外学者发现cbfa1在牙齿发育过程有表达；基因敲出的小鼠不仅全身骨发育异常，还出现牙齿发育障碍，而且牙齿特异的成釉蛋白基因的启动子上也发现了cbfa1结合位点。本课题采用细胞培养、PCR、基因重组、基因转染、免疫组织化学、反义核酸等方法研究cbfa1在牙齿发育矿化中的作用，在牙乳头细胞中探讨几种生长因子对cbfa1的作用以及cbfa1对矿化相关基因转录的调控，从而在转录水平阐明牙齿发育矿化的分子调控机制，为进一步研究奠定基础。 首先我们从小鼠牙胚组织中成功地克隆到了小鼠cbfa1全部编码区，约1.7kb，进一步证实了cbfa1在牙胚组织中的存在；根据cbfa1的基因结构和读框，我们选取了其中一个含有部分runt结构域和核定位信号的约204bp的基因片段，采用基因重组的方法成功地构建了原核表达载体pRSETA-cbfa1(204)，并通过对T_7启动子有较好效果的大肠杆菌BL21进行IPTG诱导表达，结果获得了预计的约14KD的cbfa1融合蛋白，并用Ni-NTA柱亲和层析进行了初步纯化；纯化的cbfa1融合蛋白免疫新西兰大白兔，获得了滴度为1/28的多克隆抗体，采用免疫组织化学和western blot的方法证明了所制备的抗体是成功的，效价分别为1:400和1:1000，为进一步的研究奠定了物质基础。 第四军医大学博士学位论文4 随后我们采用自行制备的抗体对牙胚组织和体外培养的人牙乳头细胞进 行了免疫组织化学研究，发现：cbfal在帽状期牙胚中表达于内釉上皮、外釉 上皮、牙胚间充质和牙囊；在钟状早、中期牙胚，Cbfal表达于内釉细胞、成 釉细胞以及紧靠成牙本质细胞层的牙乳头细胞，在牙槽骨中呈强阳性表达：钟 状晚期，成牙本质细胞和成釉细胞分泌牙本质和牙釉质基质，。bfal在牙乳头 表达为阴性，成牙本质细胞层弱阳性，成釉细胞为阳性或强阳性，牙囊中成骨 细胞强阳性表达，牙囊细胞弱阳性表达。表明。bfal参与了牙胚发育过程，尤 其是在成牙本质细胞和成釉细胞分化中可能起着重要作用。体外研究表明，体 外培养的人牙乳头细胞没有。bfal基因和蛋白的表达，当采用脂质体法瞬时转 染构建的真核重组质粒pGDNA3七 后，细胞中出现了Cbfal基因和蛋白的 表达，为进一步稳定转染作好了准备。 由于体外培养的人牙乳头细胞不表达。bfal，而体内牙乳头细胞的表达出 现在紧邻成牙本质细胞层的下方，于是我们设计了体外稳定转染。bfal基因的 实验。将以构建好的含全部编码区的真核表达重组质粒PCDNA3七，用脂 质体介导转染牙乳头细胞，并用 G4进行多次筛选，获得了 3个抗性克隆， 经过基因水平和蛋白水平多种方法的验证，鉴定出1个抗性克隆能稳定表达 。bfal基因和蛋白，并对其进行了一系列研究。结果表明：转染cbfal基因后 牙乳头细胞的增殖能力减弱，而与矿化相关的有关指标增高，如。AMP：ALP。 OC等。Cbfal不仅可以上调ALP和OC的活性，还能诱导OPN、BSP、ON 和DMPI这些矿化相关蛋白的表达，但对牙本质特异性蛋白DSP的表达和其 编码基因DSPP无明显作用，对1型胶原的表达量也有所增加，但经图像分析 和统计学处理无显著性差异。这些结果表明，牙乳头细胞也是cbfal作用的靶 细胞，Cbfal可以诱导牙乳头细胞表达矿化相关的基因和蛋白，提示Cbfal在 牙乳头细胞分化为成牙本质细胞中起着非常关键的作用。 为了探讨几种生长因子对牙乳头细胞中。bfal的作用，我们采用RT－PCR、 WestCm blot和免疫组织化学的方法观察 BMPZ、TGF p；、FGFZ和 EGF四种生 D叩。tment Of印e。t。e De。t。时and砌咖加n闲J 风WU 第四军医大学博土学位论文5 长因子在牙乳头细胞中对cbfal基因表达、蛋白合成和蛋白表达部位的影响。 结果表明：200ng／llil BMPZ和 50gb的FGFZ刺激正常人牙乳头细胞6h后 cbfal的表达明显升高，而 20ng／llil和 40n归的 TGF p；作用 12 h能抑制稳定 转染Cbfal基因的细胞中cbfal InRNA的表达；EGF则对牙乳头细胞中Cbfal 的表达没有显著影响。
王方[10]2011年在《利用细胞膜片技术构建牙髓、牙周膜干细胞间微环境的实验研究》文中指出牙髓干细胞(DPSCs)和牙周膜干细胞(PDLSCs)是重要的牙齿组织工程种子细胞。与其他牙源性种子细胞(如SHEDs、SCAP、DFSCs等)相比,具有获取方法简单、不受患者年龄因素制约、组织存储量大且创伤较小等优点。DPSCs和PDLSCs的高增值率、多向分化潜能及可联合应用修复牙体牙周组织功能的特点使其成为牙组织工程和未来临床治疗潜能巨大的牙源性成体干细胞。本实验采用细胞膜片技术进行牙组织工程研究,建立牙周、牙髓条件培养液与DPSCs、PDLSCs共培养体系,检测两种细胞微环境对细胞形态功能的影响,进一步利用细胞膜片技术构建DPSCs、PDLSCs-HA/TCP支架复合体进行体内组织学研究,为牙组织工程再生探索新的方法途径。第一部分:用牙周膜干细胞(hPDLSCs)制备牙周膜细胞片联合采用酶消化法和组织块法获取原代细胞,采用倒置显微镜观察细胞的形态和生长状况。将第四代牙周膜细胞接种到培养皿中,经五周连续培养可形成具有机械加工性能的牙周细胞生物膜片,将此细胞膜片包裹HA/TCP支架植入裸鼠皮下,4周后取材进行组织学检测。本部分实验结果表明:牙周膜干细胞生长状态良好,每层细胞首尾重叠,规则排列,各层间细胞紧密相连。组织学检测显示,颗粒状羟基磷灰石/磷酸三钙(HA/TCP)支架外附着由多层成纤维样细胞组成的牙周膜样组织,并可见毛细血管从中穿行,支架材料与类牙周膜组织之间有类牙骨质样结构形成。第二部分:牙髓干细胞(DPSCs)及牙周膜干细胞(PDLCS)微环境的相互作用的研究分离培养牙髓干细胞、牙周膜干细胞备用,制备牙髓干细胞条件培养液和牙周膜干细胞条件培养液。将两种细胞各自分别在两种条件培养液中培养,分为四组。对四个实验组细胞进行倒置显微镜形态学观察、MTT细胞增殖检测、ALP活性检测、实时定量PCR检测,其中培养牙髓干细胞的两组检测DSP、ColI、ColIII基因;培养牙周膜干细胞的两组检测ColI、OCN、scleraxis基因。检测结果表明:经牙周膜细胞条件培养液培养的牙髓干细胞其细胞增殖活性、碱性磷酸酶活性及DSP、ColI、ColIII的表达水平均高于经牙髓细胞条件培养液培养的牙髓干细胞;经牙髓细胞条件培养液培养的牙周膜细胞其增殖活性、碱性磷酸酶活性及ColI、OCN、scleraxis却低于经牙周膜细胞条件培养液培养的牙周膜干细胞。本部分实验拟探讨两种干细胞及其微环境相互之间的作用影响,实验结果说明牙周膜细胞条件培养液的微环境促进了牙髓细胞的增殖和分化,而牙髓细胞条件培养液的微环境却对牙周膜细胞的增殖和分化有抑制的作用。第三部分:构建牙周膜细胞膜片-DPSCs-HA/TCP复合体的体内实验研究将复合有牙髓干细胞的HA/TCP支架置于生物反应器中培养10日,在其表面包裹牙周膜细胞膜片后,将此复合物移植入免疫缺陷小鼠皮下培养。六周后取材,组织学显示HA/TCP支架外侧有牙周膜样组织形成,支架外表面及内部空隙表面有牙髓干细胞分泌的矿化基质形成,但外表面的矿化基质远远多于内部孔隙表面的矿化基质;牙周膜样组织相接触的牙髓细胞分泌出大量矿化基质,胞核大且深染;而与其相邻的没有与牙周膜样组织接触的牙髓细胞几乎没有矿化现象。组织学染色进一步验证了牙周膜干细胞对牙髓细胞的诱导和促进作用。
参考文献：
[1]. 激素和生长因子与牙乳头细胞、牙髓细胞、牙胚分化和矿化关系的体外实验研究[D]. 郝建军. 第四军医大学. 1997
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[3]. 牙本质基质蛋白1在牙胚发育及牙髓损伤修复中的作用[D]. 逄键梁. 中国人民解放军第四军医大学. 2003
[4]. 牙胚成纤维细胞生长因子18基因克隆、表达及其功能研究[D]. 杨帆. 中国人民解放军第四军医大学. 2003
[5]. 大鼠脂肪干细胞（rADSCs）的分离鉴定及向成牙本质细胞分化的实验研究[D]. 陈小红. 第三军医大学. 2007
[6]. PVA作为构建组织工程牙髓牙本质复合体支架材料的体外实验研究[D]. 庞楠. 第四军医大学. 2010
[7]. 牙发育过程中TGF-β_1、BMP-2、bFGF和E-Cadherin的表达及相关技术研究[D]. 程敏. 吉林大学. 2008
[8]. BMP2与DXM对人牙髓细胞增殖和分化的影响[D]. 陆彦玲. 广西医科大学. 2017
[9]. 核心结合因子a1在牙齿发育矿化中作用机制的研究[D]. 余擎. 第四军医大学. 2002
[10]. 利用细胞膜片技术构建牙髓、牙周膜干细胞间微环境的实验研究[D]. 王方. 第四军医大学. 2011