姜永厚[1]2000年在《新城疫病毒F基因与鸡IL-2重组DNA疫苗的研究》文中进行了进一步梳理本文在成功构建鸡新城疫F基因疫苗，并观察了免疫SPF雏鸡后诱导的免疫应答及免疫保护作用基础上，首次系统研究了鸡IL-2在鸡新城疫F基因疫苗免疫中的作用，证实了国内首次克隆成功的鸡IL-2基因的免疫增强作用，及作为免疫佐剂应用于禽类基因免疫的可行性；在此基础上，为进一步提高F基因疫苗免疫效率，又成功地构建了鸡新城疫病毒F基因与鸡IL-2重组DNA疫苗，研究了其接种SPF雏鸡后免疫鸡只T、B淋巴细胞增殖反应和抗体变化规律，以及强毒攻击后的免疫保护作用。研究结果如下：1．新城疫病毒F基因疫苗研究 用新城疫病毒D26株F基因的cDNA与含人巨细胞病毒CMV启动子的真核表达载体pcDNA3重组，构建了新城疫F基因疫苗（pcDNA-F）。直接免疫接种SPF鸡后免疫鸡产生了针对新城疫病毒的抗体，免疫接种后前2周，免疫鸡的抗体产生并不明显，第3周后出现稍为明显的抗体反应。攻毒后，免疫鸡的抗体回忆反应十分迅速和强烈，出现一个较陡而又较高的峰值。而非免疫鸡在攻毒后，抗体反应相当弱。免疫组有部分试验鸡（30％）耐过强毒攻击。说明重组质粒的F基因已在体内得到表达，并诱导了机体的免疫应答反应和免疫保护作用。证明以F基因做为新城疫基因免疫的免疫原基因是可行的。2．鸡IL-2在新城疫病毒F基因疫苗免疫中的作用研究 用含鸡IL-2基因真核质粒与新城疫F基因疫苗联合免疫SPF雏鸡。抗体监测结果显示添加鸡IL-2质粒试验鸡的抗体滴度高于单独接种F基因疫苗试验鸡的抗体滴度；其中两种质粒混合接种组（pcDNA-F+IL2）抗体滴度又明显高于这两种质粒的分别接种组（pcDNA-F/IL-2）抗体滴度。 MTT法检测免疫鸡T、B淋巴细胞增殖反应：免疫后不同周龄，各免疫组试验鸡胸腺T淋巴细胞对ConA、法氏囊B淋巴细胞对PMA均有明显的反应性。接种鸡IL-2质粒试验鸡胸腺T淋巴细胞对ConA的反应性、法氏囊B淋巴细胞对PMA的反应性又显著高于单独接种F基因疫苗组，差异极显著（P＜0.01）。说明接种鸡IL-2表达质粒后，F基因疫苗诱导的体液免疫和细胞免疫应答均得到了加强。在添加IL-2质粒的两组中，混和接种IL-2质粒组的T、B淋巴细胞增殖反应又明显高于分别接种组，差异极显著（P＜0.01）。表明鸡IL-2质粒免疫增强作用的发挥有赖于同抗原基因的共同接种。 攻毒保护试验显示：混合接种组（pcDNA-F+IL2）中有50％的试验鸡耐过；分别接种组（pcDNA-F/IL-2）有40％试验鸡耐过。 添加IL-2质粒组试验鸡体液免疫、细胞免疫的增强及免疫保护率（50％）的提高，说明IL-2真核质粒在鸡体内得到表达，并且具有免疫增强作用。一方面刺激T淋巴细 东北农业大学 中文摘要 博士学位论文 胞的增殖、分化，增强细胞免疫应答；另一方面作用B细胞，促进其活化分泌Ig，加 速抗体生成，进而加强体液免疫。 3．新城疫病毒F基因与鸡thZ重组DNA疫苗的研究 利用国内首次克隆得到的鸡IL2与新城疫弱毒D26株的F基因，经载体改建，将 二者以非融合表达形式共同克隆于真核表达质粒pCDNA3上，经酶切分析、PCR鉴定 证实成功构建了共表达鸡 IL－2与新城疫 F蛋白的重组质粒（pCDNA－F－ILZ）。采用胸肌 多点注射方法接种 14日龄 SPF雏鸡，免疫后每周采集试验鸡胸腺、法氏囊、血液，无 菌分离T、B淋巴细胞和血清，以 MTT法和 ELISA分别检测免疫鸡 T。B淋巴细胞增 殖反应和抗体变化规律。结果显示：与单独接种F基因疫苗试验组相比，接种重组质 粒试验组鸡只的体液免疫和细胞免疫均明显增强；且免疫效果优于两种质粒的混合注 射。免疫后以新城疫标准强毒F。。巳攻击，接种重组质粒试验鸡有70％存活；混合接种 F基因和几－2质粒试验鸡有 5（）％存活；单独接种 F基因疫苗试验鸡只有 3（）％存活。试 验结果表明共表达IL．2可极大提高新城疫DNA疫亩的效力。 新城疫F基因与鸡IL。二重组质粒的成功构建在国内外尚未见报道，不仅首次证实 了鸡IL－2在新城疫基因免疫中的免疫增强作用，而且为鸡IL2这一新型佐剂在禽类基 因免疫中的应用提供了试验依据。同时山为探讨禽类重组基因疫苗的构建奠定了基础。 4．新城疫基因疫苗、鸡IL．2质粒免疫SPF雏鸡免疫器官的组织学变化 新城疫基因疫苗免疫后．试验鸡胸腺皮质增厚，其中淋巴细胞数目增客。法氏囊 淋巴滤泡明显增大，淋巳细胞数目增多。脾脏白髓区增大，淋巴小结数量增多，体积增 大，其中淋巴细胞数量增多。以上主要免疫器官在免疫后的组织学变化再次证实了基因 疫苗免疫可以诱导体液免疫和细胞免疫的结论。 另外，将几．2免疫鸡与空白对照鸡、F基固疫苗免疫鸡进行了形态学和组织学的 比较，接种IL．2质粒试验鸡剖检末见病理变化：整个免疫过程中，接种几－2质粒试验 鸡的
姜永厚, 陈奖励, 宋秀龙, 童光志, 孔宪刚[2]2001年在《鸡新城疫病毒F基因和鸡IL-2重组DNA疫苗的构建》文中提出利用已克隆到的新城疫D2 6株F基因和鸡IL_2基因 ,经过载体改建 ,将他们共同克隆于真核表达质粒pCDNA3上 ,经酶切分析、PCR鉴定证实成功构建了共表达鸡新城疫病毒F基因和鸡IL_2的重组质粒 ,为探讨禽类重组基因疫苗的构建及鸡IL_2在基因疫苗中的作用奠定了基础
曾伟伟[3]2009年在《密码子优化和分子佐剂增强新城疫病毒F基因DNA疫苗免疫效果》文中提出新城疫是由新城疫病毒引起的禽的一种急性、高度接触性传染病,一直是危害养禽业的主要疫病,是世界公认的两大重要禽病之一。传统全病毒灭活疫苗和弱化疫苗在有效预防和控制新城疫的实践中发挥了重要作用,但也存在干扰常规血清学流行病监测、难于区分疫苗免疫与自然感染免疫反应的缺陷。为此,开展新城疫基因工程疫苗的研究,为新城疫的防制提供新的防疫手段具有重要意义。DNA疫苗的抗原合成和提呈过程与病原的自然感染相似等诸多优点,被认为是最具潜力的基因工程疫苗之一。本研究对新城疫病毒F基因进行了优化,并用IL-2和不同拷贝数的C3d作为分子佐剂,构建了F基因真核表达质粒,对其体外表达水平及体内免疫保护效果进行了评估,以期遴选出免疫剂量小、经济成本低、有商品化潜力的NDV DNA疫苗。首先,对NDV F48E9株的F基因进行优化,将F基因ORF的密码子全部替换为鸡体内偏嗜的密码子,在上游引入Kozak序列,改造后的基因通过人工合成后命名为optiF,插入到真核表达载体pVAX1获得重组质粒pVAX1-optiF。间接免疫荧光和Western-blot检测结果显示,与未经修饰的F基因(pVAX1-F)相比,optiF基因体外瞬时表达水平明显提高;2周龄SPF鸡接种试验(200μg/只剂量,间隔2周加强免疫,二免2周后攻毒)表明,F基因密码子的优化可显著提高NDV F48E9株DNA疫苗诱导的保护性体液免疫和细胞免疫应答水平,增强免疫保护效果,一免后2周,pVAX1-optiF质粒免疫鸡的特异性抗体水平显著高于pVAX1-F质粒免疫鸡(P<0.05),一免后27天,pVAX1-optiF质粒免疫鸡的CD4+、CD8+及TCRγδT淋巴细胞百分含量和淋巴细胞增殖反应OD570值均显著高于pVAX1-F质粒免疫鸡(P<0.01),所有pVAX1-optiF免疫鸡均获得完全保护,其保护率(12/12)显著高于pVAX1-F免疫组(2/12)。其次,构建含有密码子优化的NDV F48E9株F基因(optiF)的表达质粒pV-optiF、表达鸡源IL-2的真核表达质粒pV-IL-2和融合表达1-6个拷贝C3d(鸡源)与optiF基因的质粒pV-C3dn-optiF(n=1-6),以进一步探讨分子佐剂C3d和IL-2对低剂量NDV F基因DNA疫苗的免疫增强作用。结果表明,融合单拷贝分子佐剂C3d的重组质粒pV-C3d-optiF以及pV-optiF共免疫表达IL-2的质粒所诱导的保护性体液免疫、细胞免疫以及对强毒的攻击保护效果比相应的其他质粒好。其中,以免疫20μg pV-C3d-optiF和200μg pV-optiF共免疫表达IL-2的免疫效果最佳。总之,通过密码子优化和引入分子佐剂(C3d和IL-2)可以显著提高新城疫病毒F基因DNA疫苗的免疫应答水平,使其有效免疫保护剂量降低至20μg水平,具备推广应用的经济可行性。pVAX1-C3d-optiF和pVAX1-optiF+IL-2作为免疫效果良好、成本低廉的优化DNA疫苗,有望成为新城疫的高效、安全新型基因工程疫苗。
董建宝[4]2007年在《新城疫病毒广西分离株DNA疫苗的构建、动物免疫试验及体内分布的研究》文中研究指明新城疫(Newcastle Disease，ND)是一种急性、高度接触性和致死性的禽类传染病，该病的发生给世界养禽业带来了巨大的损失，被国际兽疫局(Office International des Epizooties，OIE)列为A类疫病，其病原为新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)。近年来对新城疫病毒生物学特性的测定、新型疫苗的研究以及分子流行病学调查等一直是研究的热点。本文对NDV广西分离株GX7／02进行了生物学特性的测定和NDA疫苗的构建，动物免疫试验及体内分布的研究。参照国际上规定的新城疫病毒生物学特性判断的标准及方法，对新城疫广西分离野毒株GX7／02进行了生物学特性研究，结果显示，该毒株的鸡胚半数致死量(ELD50)为10~(-9.42)／0.1mL，鸡胚半数感染量(EID50)为10~(-9.57)／0.1mL，鸡胚最小致死量平均死亡时间(MDT)为54.0h，鸡胚成纤维细胞(CEF)组织培养半数感染量(TCID50)为10~(-9.50)／0.1mL，脑内致病指数(ICPI)为1.925，6周龄鸡静脉内接种致病指数(IVPI)为2.43。表明该分离株具有与新城疫病毒速发型相类似的毒力，隶属于强毒株。用该分离株对16日龄的鸡、鸭、鹅分别进行人工感染试验，发病率分别为100％、40％和100％，死亡率分别为100％、0和60％。且试验证明GX7／02毒株属于血凝快速解脱型，血凝素热稳定性较差。设计两对特异性引物，采用RT-PCR技术扩增出新城疫广西分离株GX7／02的F和HN基因，将其分别克隆入真核表达载体pTracer-CMV2质粒中，置于PCMV启动子之下，构建成pTracer-CMV2F和pTracer-CMV2HN重组质粒。另设一对特异性引物，采用PCR技术从重组质粒pMD18-T-IL2中扩增出IL2基因，克隆入pTracer-CMV2F和pTracer-CMV2HN重组质粒中，置于PEF1启动子之下，构建成pTracer-CMV2FIL2和pTracer-CMV2HNIL2重组质粒。经酶切和序列测定正确后，采用脂质体法将重组质粒转染于BHK-21细胞。采用间接免疫荧光和RT-PCR方法检测到目的基因的表达。将pTracer-CMV2FIL2和pTracer-CMV2HNIL2以单独和联合(1：1)接种的方式分别免疫于两周龄的SPF鸡只，每只200ug。其中混合免疫的鸡只包括三个组，分别接种一次、两次和三次。接种后每周采血一次，ELISA方法检测抗体水平，并于接种后6周进行攻毒试验。试验结果显示，接种DNA疫苗的各组抗体水平明显高于对照组，差异极显著(P＜0.01)；pTracer-CMV2FIL2和pTracer-CMV2HNIL2分别单独免疫组抗体水平差异不显著(P＞0.05)；而联合免疫组的抗体水平均明显高于单独免疫组，差异显著(P＜0.05)；且抗体水平随着免疫次数的增多而升高，差异显著(P＜0.05)。攻毒试验显示联合免疫组的保护率均高于单独免疫组。为了研究接种以后DNA疫苗在体内的分布情况、表达时间、持续存在的时间以及在血液中的动态分布情况，将3周龄的三黄鸡肌肉接种200μg DNA疫苗pTracer-CMV2FIL2，巢式PCR法检测血清、心、脾脏、肺脏、法氏囊、脑、骨髓、胸腺和肌肉接种部位中pTracer-CMV2FIL2出现和存留的时间；荧光定量PCR法检测其在血液中的动态变化；RT-巢式PCR法检测其在上述部位的表达情况。试验结果表明，接种后2～3小时血清中可检测到pTracer-CMV2FIL2，6h时在血液中的含量最高，7d时已经检测不到；4h后在上述器官中可陆续检测到pTracer-CMV2FIL2的出现，13d后陆续消失；1d后可陆续检测到质粒所转录的mRNA，13d后陆续消失；接种后2h可在肌肉接种部位的细胞中检测到pTracer-OMV2FIL2的出现，10h可检测到mRNA，150d时仍然可以在肌肉接种部位的细胞中检测到质粒和mRNA存在。本研究为DNA疫苗的临床应用提供可靠的试验依据。参照国家兽医生物制品质量标准，分别用新城疫病毒广西分离株GX1／06(基因Ⅶ型)、传统疫苗株Lasota(基因Ⅸ型)以及国内参考强毒株F48E9(基因Ⅱ型)制备灭活油乳剂疫苗。免疫3周龄的SPF雏鸡，每周采血测定HI滴度，并于免疫接种4周后使用强毒株GX1／06进行攻毒试验。攻毒结果显示，三种油苗对免疫鸡只的保护率均为100％。
于淼[5]2009年在《山东鸡新城疫病毒分离鉴定与Ⅱ+Ⅶ基因型灭活疫苗研究》文中认为近年来,我国新城疫(Newcastle disease, ND)的流行日益复杂,免疫失败屡屡发生,给养禽业,特别是养鸡业造成了不可估量的经济损失。为更好地防制新城疫的发生,探索有效的防制措施,本研究对山东省鸡新城疫进行了流行病学调查,掌握了新城疫的流行状况,并分离获得了12个新城疫病毒流行株。在此基础上,对新城疫病毒LY1分离毒株的致病性及变异性状开展了检测分析,然后以此分离株制备灭活疫苗进行免疫保护试验,同时,构建了新城疫病毒HN基因C3dP29补体融合基因疫苗,探明了C3d P29基因的分子佐剂效果,为新城疫防制奠定了重要基础。主要研究包括以下4个部分：1.NDV的分离鉴定与生物学特性研究从山东省8个地区22个养禽场82份疑似新城疫病料中,分离和鉴定出12株NDV。将12株NDV进行了MDT、ICPI和IVPI检测,结果表明,6个分离株(WF10、WF13、LY1、LY7、ZB10和JN2株)MDT均小于60h、ICPI均大于1.6、IVPI均在2.00以上,表明为强毒株；DY2、LC3和BZ7株的MDT分别为63.6h、69.6h和62.4h, ICPI值为1.4、1.44和1.35,IVPI值为1.74、1.85和1.49,为中毒力毒株；WF3、LY14和TA6株为弱毒株。经动物回归试验,各毒株NDV均可导致鸡发生不同程度的发病和死亡,且发病和死亡的鸡均出现ND典型症状和剖检变化。2. NDV LY1株F和HN基因的克隆与序列分析利用RT-PCR技术,对山东省新城疫病毒LY1分离株的F基因主要功能区片断和HN基因全部的核苷酸序列进行了克隆和序列分析。结果显示：(1)LY1株F基因开放性阅读框架(ORF)为1662bp,编码489个氨基酸。与国内外发表的部分新城疫病毒强毒株和弱毒株之间相同序列进行比较,该毒株F基因核苷酸序列的同源性在84.1%～88.7%之间,氨基酸同源性在88.1%～93.3%之间；F蛋白裂解位点区(112-117)氨基酸组成与强毒株一致。从分子水平证明NDV山东分离株(LY1)为新城疫强毒株。LY1株病毒在101位和121位分别为K(赖氨酸)、V(缬氨酸)两种特征氨基酸,具有Ⅶ型基因型NDV的典型特征。该毒株与我国标准毒株的同源性较低,与强毒株F48E9的同源性只有86.3%,与新城疫标准弱毒株C30的同源性只有84.2%,说明已发生一定的变异,这可能是高抗体水平压力下引起鸡群发病的原因。(2)HN基因ORF大小为1716bp,编码571个氨基酸。与国内外发表的部分新城疫病毒强毒株和弱毒株之间相同序列进行比较,HN基因核苷酸序列的同源性在82.1%～87.4%之间,氨基酸同源性在87.6%～90.9%之间,属于强毒的C群,这与该病毒生物学鉴定的结论是一致的。3.新城疫病毒不同基因型灭活油乳疫苗的研制及免疫效果测定将新城疫病毒基因Ⅶ型LY1分离株和传统的LaSota株(基因Ⅱ型)与油佐剂按1：3比例混合乳化,分别制成油包水型LY1分离株、LY1分离株+LaSota株油乳剂灭活苗；无菌试验和物理性状检验合格；鸡体倍量注射试验结果证明疫苗安全性好；用LaSota株抗原进行HI试验,检测免疫接种鸡抗NDV-HI抗体,结果显示,LY1分离株+LaSota株油乳剂灭活苗于接种后的14d、21d、28d所产生的平均HI抗体效价与商品化灭活疫苗(LaSota株)无明显差异(P>0.05),至35d后两种疫苗的抗体效价均达到7.2Log2以上；而LY1分离株灭活疫苗组各个时期(接种后7天除外)所产生的平均HI抗体效价与LY1分离株+LaSota株油乳剂灭活苗组及商品化灭活疫苗(LaSota株)组的抗体效价差异显著(P<0.05)。LY1分离株+LaSota株油乳剂灭活苗组、LY1分离株灭活疫苗组和商品化灭活疫苗(LaSota株)组HI抗体效价上升规律相同,均与对照组各个时段所产生的平均HI抗体效价差异均极显著(P<0.01)。免疫后4周用LY1分离株进行了攻毒试验。结果证明,LY1分离株+LaSota株油乳剂灭活苗组免疫保护率可达100%,LY1分离株灭活疫苗组和商品化灭活疫苗(LaSota株)组的免疫保护率分别为90%和70%。表明单纯使用LaSota株商品化灭活疫苗产生的保护力较低,而用分离株配以LaSota株制备的不同基因型(基因Ⅱ型+基因Ⅶ型)灭活油乳疫苗则能产生较强的保护能力。4.鸡C3d分子佐剂-NDVHN基因疫苗的构建与免疫保护效果研究以RT-PCR扩增新城疫病毒LY1株的HN基因,定向克隆至真核表达载体pCDNA-P29n中P29n的上游,将鸡补体C3d的受体结合功能区P29作为分子佐剂与新城疫病毒的HN基因连接,构建了NDVpCDNA-HN-P29.4和pCDNA-HN-P29.6分子佐剂基因疫苗,免疫接种3周龄SPF鸡,结果显示,免疫后3-4周pCDNA-HN-P29.4、pCDNA-HN-P29.6和pCDNA-HN免疫组均能诱导鸡体产生HI抗体,但pCDNA-HN-P29.4、pCDNA-HN-P29.6免疫组HI抗体水平明显高于pCDNA-HN免疫组(P<0.01),但低于商品化灭活苗免疫组。攻毒试验结果表明,pCDNA-HN-P29.6和商品化灭活苗免疫组能够较好地抵抗致死量病毒的攻击,保护效率达90%,明显高于pCDNA-HN免疫组,表明鸡C3d分子对NDV-HN基因具有明显协同作用。该研究结果为进一步研究开发和利用鸡C3d奠定了基础。
梁雪芽[6]2002年在《减毒沙门氏菌作为鸡新城疫口服DNA疫苗载体的基因免疫研究》文中进行了进一步梳理细胞内感染性细菌减毒后作为DNA疫苗载体是目前基因免疫研究的热点之一。沙门氏菌(Salmonella typhimurium)是一种较为常见的侵袭性胞内菌，通过基因工程方法减毒后对宿主致病性显著降低，但仍保留良好的侵袭力，可直接将真核表达质粒携带进入动物细胞内表达相应的蛋白而诱导特异性的免疫应答反应。但目前国内外还未见用减毒沙门氏菌作为载体传递禽类DNA疫苗的报道。 新城疫(Newcastle Disease, ND)是目前危害世界养禽业最严重的传染病之一。该病的病原新城疫病毒(Newcastle Disease Virus, NDV)属副粘病毒科，为有囊膜的负链RNA病毒。融合蛋白(F)和血凝素-神经氨酸酶蛋白(HN)是NDV的主要宿主保护性抗原，以F基因和HN基因为免疫原研制的DNA疫苗能诱导一定程度的免疫应答，但注射免疫或基因枪免疫途径因实际操作和成本等问题难以推广应用，而直接口服重组质粒DNA免疫效果不理想。本研究探讨了利用沙门氏菌dam基因和phoP基因双突变株为载体传递NDV DNA疫苗的免疫原性和可行性。 本研究应用RT-PCR扩增了新城疫病毒强毒株F_(48)E_9株融合蛋白(F)基因，并将其插入到pcDNA_3的CMV启动子下游，构建成真核表达质粒pcDNA3-F。序列测定结果表明，克隆的F基因全长1668 bp，编码553个氨基酸。序列分析和二级结构预测表明，F_(48)E_(9)株F蛋白含有3个分别由25个氨基酸组成的疏水区，存在6个潜在的糖基化位点，13个半胱氨酸残基，裂解位点区域的氨基酸序列为RRQRRF，说明F_(48)E_9株是一株典型的强毒株。氨基酸序列同源性比较发现，F_(48)E_9与鸡源NDV毒株的同源性在91.3%-95.5%，其中与Australia-victoria株同源性高达95.5%，而与鸽源的Ch/98-1株和鹅源的ZJ1株的同源性相对较低(90.6%)。 将真核表达质粒pcDNA3-F高压电转化dam和phoP基因双突变的减毒鼠伤寒沙门氏菌ZJ111株(ZJ111/pcDAN3-F)，并直接转染Vero细胞，分别提取细胞总DNA和总RNA，DIG标记探针均可检测到阳性杂交信号。FITC标记的羊抗鸡IgG进行间接免疫荧光试验可检测到特异性的黄绿色荧光。ELISA检测结果表明，转染后48hF蛋白开始表达，随后逐渐增多。SDS-PAGE和免疫印迹可检测到55kD的蛋白条带。上述试验结果证实减毒沙门氏菌不仅可将目的基因呈递给Vero细胞，而且还得到了转录和表达，表达的F蛋白具有免疫反应性。 小鼠安全性试验表明，ZJ111/pcDNA3-F菌株只有在10~9cfu高剂量口服后引起个 别小鼠的死亡，其它各口服剂量组菌没有出现死亡。将ZJ帅CDAN3f以10、fu 的口服剂量口服接种3 日龄非免疫来航鸡，未见任何不良反应，也不影响鸡只的增 重，脾脏、肝脏等主要器官的沙门氏菌在二次免疫后2周己被鸡体的免疫系统所清 除，表明利用 ZJlll作为载体传递 DNA疫苗具有相对安全性。用酶切和 PCR鉴定 法证实在体内外无抗生素存在的条件下重组质粒在受体菌 ZJ 111菌株内比较稳定， 表明 ZJ 111为载体传递 DNA疫苗具有良好的稳定性。上 为了进一步探讨利用减毒鼠伤寒沙门氏菌为载体传递NDV DNA疫苗的免疫原 性，将 ZJlll／pCDNA3F菌株分别给 3日龄非免疫鸡以 10、fu、10、fu和 10、fu的 剂量进行首兔，2周后H免，H免后4周攻击强毒株F。止。，观察其免疫原性；同时 设只含空载体pCDNA3的 ZJlll／pCDNA3菌株对照及口服 PBS对照组。结果表明： 重组 ZJlll／PCDNA3F菌株 10、fu和 10、fu免疫组均具有良好的免疫原性，对强毒 株攻击的保护率达66．7％，略高于 10、fu兔疫组K0％人 ZJll帅CDNA3F菌株的 各免疫剂量组于至二免后二周开始出现抗体，随后逐渐上升，10、fu组、10’。u组 10’。刊组至二免后第3周和第4周达到较高水平，但三者并无统计学差异（P＞0刀5）， 而且抗体产生规律也基本相似。ZJll l／pCDNA3F菌株免疫组二免后 4周诱导产生 的法氏囊 B淋巴细胞和胸腺 T淋巴细胞增殖反应显著高于 ZJlll／pCDNA3对照组 （P＜0刀5人这些结果表明ZJ 111 ／pCDNA3＊菌株10、fu为比较理想的免疫剂量， 并提示减毒沙门氏菌为载体不仅可直接将F基因呈递给鸡体细胞进行表达，而且还 能诱导产生抗NDV的体液兔疫和细胞免疫应答。 本试验还比较了减毒沙门氏菌为载体传递NDV DNA疫苗、裸质粒DNA疫苗 和弱毒疫苗的免疫效果。ZJlll／pCDAN3F 以 10bfu的剂量口服免疫，裸质粒 PCDNA3F以 200叱肌肉注射免疫，NDV 11系弱毒疫苗按常规方法滴眼和滴鼻免疫， 2周后每组各以相同的剂量和途径进行二免，二免后4周攻击致死剂量的强毒株 F。术。，观察其免疫效力。结果表明：ZJll l／pCDNA3F免疫组对强毒株的攻击保护 率为66．7％，高于pCDNA3f裸质粒肌肉注射组u0％人11系弱毒疫苗的保护率可三 达 93．3％。三种疫苗都能诱导雏鸡产生NDV抗体，ZJlll／pCDAN3F组和 pCDAN3－
王学艳[7]2008年在《NDV分离株F及HN基因的遗传变异分析与核酸疫苗质粒的构建》文中提出新城疫病毒(NDV)是副黏病毒科副黏病毒亚科禽病毒属的成员,是有囊膜的负链RNA病毒,可引起禽类的新城疫。我国经过多年的综合防制,现已基本控制了该病的流行。近年来,我国新城疫的发生出现新的特点,即非典型新城疫病例日益增多,高抗体鸡群出现发病等。许多学者认为这可能与NDV毒株变异有关。开展NDV的病原研究和新型疫苗的开发显的尤为重要。本研究对6株NDV分离株的F、HN基因的遗传变异进行研究,目的是从分子水平上了解我国NDV流行毒株与疫苗毒株的分子差异,探索新城疫疫苗免疫失败的原因;采用生物信息学工具对NDV分离株的F蛋白的结构与参考毒株进行了比较分析,目的为在核苷酸和氨基酸水平解释NDV分离株生物学特性的变异提供依据;克隆了NDV-F基因和鸡的IL-2基因,构建了鸡新城疫核酸疫苗质粒,旨在为预防NDV感染的辅助免疫提供理论基础和技术支持。研究内容如下:1.应用RT-PCR方法对6个NDV分离株(ZD、JZ、XB、CA、ZZ、CC)的F基因主要功能区片段进行了扩增,各扩增产物经克隆、测序后与GenBank登录的NDV参考毒株的F基因进行核苷酸及推导氨基酸序列分析。结果表明,6个NDV分离毒株间的F基因核苷酸和F蛋白氨基酸同源性分别在99.6%~99.9%和99.1%~99.8%之间;分离毒株与参考毒株F基因核苷酸和F蛋白氨基酸序列同源性分别在83.2%~87.3%和90.2%~93.8%之间;F蛋白裂解位点的氨基酸顺序为112R-R-Q-K-R-F117,符合强毒株的分子特征;其F基因的分子特性显示6个分离株均属基因Ⅶ型。研究结果提示,6个NDV分离株可能是同一毒株在传播过程中发生的不同变异株。NDV分离株与临床常用疫苗株的F基因同源性较低,在遗传进化上亲缘关系较远,这可能是疫苗免疫鸡群发病的重要原因之一。2.应用RT-PCR方法对6个NDV分离株的HN基因进行了扩增,各扩增产物经克隆、测序后与GenBank登录的NDV参考毒株的HN基因进行了核苷酸及推导氨基酸序列分析。结果表明,6个NDV分离毒株间的HN基因核苷酸和HN蛋白氨基酸同源性分别在98.7%~99.8%和98.1%~99.7%之间;分离毒株与参考毒株HN基因核苷酸HN蛋白氨基酸序列同源性分别在78.22%~85.3%和82.6%~90.0%之间;6个NDV分离株的HN蛋白均属于HN571亚型,分离株与常用疫苗株的HN基因同源性较低。5个NDV分离株中的HN蛋白在538~540aa缺失潜在糖基化位点。3.对NDV分离株ZD的F基因进行了序列测定,对其推导氨基酸序列与GenBank登录的NDV参考毒株的F蛋白序列进行了结构分析。ZD株的F基因的开放阅读框架编码553个氨基酸的F蛋白。二级结构分析后发现,ZD株的F蛋白的α螺旋中心、β-折叠、转角和无规则卷曲的分布与JS-2-06株最为接近,与常规疫苗株La Sota、Clone-30、B1和V4等毒株相比,在124-167aa的α螺旋中心分为两段,在377-386aa少一个β-折叠区域。对蛋白B细胞抗原表位、跨膜结构分析后发现,ZD株B细胞抗原表位4个参数共同区的分布与F48E9、Mukteswar和JS-2-06相似。而比La Sota、Clone-30、B1和V4株在110-117aa区段多一个共同区域。利用生物学软件对ZD株F0蛋白的三维空间结构进行了预测。这为在核苷酸和氨基酸水平解释NDV分离株生物学特性的变异提供了研究线索。4.将NDV分离株的F基因成功地插入到pcDNA4/HisMax,构建了新城疫核酸疫苗质粒pcDNA4-F;将NDV的F基因和鸡IL-2基因串联插入pcDNA4/HisMax,构建了新城疫核酸疫苗质粒pcDNA4-F+IL-2,并进行了鸡的免疫试验。试验显示,构建的新城疫核酸疫苗质粒对NDV感染有一定的保护作用。这为新城疫的核酸疫苗研究提供了有用的资料。
程相朝[8]2003年在《新城疫病毒地方株分子流行病学调查及其疫病控制》文中指出针对近年来新城疫(Newcastle Disease Virus，ND)流行日益复杂，免疫失败屡屡发生的现状，为更好地作好本地区新城疫的防制工作，本文从以下6个方面进行了新城疫病毒地方株分子流行病学调查及所致疫病控制的应用研究。 1、新城疫病毒地方株的分离鉴定与生物学特性 对1998～2002年间洛阳地区15个代表性新城疫发病禽群中的NDV进行了分离鉴定和生物学特性的研究。结果表明，所分离的15株NDV均呈现良好的血凝活性和特异的血凝抑制活性，对鸡胚的致病作用可被新城疫阳性血清所抑制。通过MDT、ICPI和IVPI指数的测定证实，LD-6-01和LR-2-00株是弱毒株，其余均为强毒株。弱毒株的血凝素热稳定性好，属慢速血凝解脱型；强毒株的血凝素热稳定性差，属快速或中速血凝解脱型。所有毒株均可较好地凝集鸡和人(O型血)的红细胞，但对其它动物的红细胞凝集性差异较大。对HI抗体为6log_2的12日龄试验雏鸡攻毒表明，15个分离株中两个弱毒株可得到完全保护(100％)；13个强毒株中，LG-1-99、LR-1-98、LD-4-01和LD-3-00得到了基本保护(70—90％)，而其它9个分离株(LD-1-98、LD-2-99、LD-5-01、LD-7-02、LR-3-02、LW-1-02、LG-2-00、LA-1-99和LE-1-01)则基本上得不到保护(0～20％)。但所有得不到保护的试验鸡的发病死亡时间均明显向后推迟。 2、新城疫病毒地方株的分子流行病学调查 利用RT-PCR技术，对所分离到的15个新城疫代表性地方毒株的F基因主要功能区片断进行了克隆和序列分析，并根据其47～435位核苷酸序列构建了系统进化树，确定了其毒力强弱和基因型。结果显示，15个地方毒株依据核苷酸和推导的氨基酸同源性的不同可分为明显的三群，群内各毒株同源性较高，而群间差异较大，未发现有因分离禽品种不同而引起的明显株间差异。其中第一群包括9株，涉及到各时间段分离的毒株和各分离禽种，属典型的基因Ⅶ型强毒株，高度集中于进化树的基因Ⅶ型C亚群区；第二群包括4株，属传统的基因Ⅵ型强毒株，分散于进化树的基因Ⅵ型区；第三群包括2株，属古典基因Ⅱ型弱毒株，分散于进化树的基因Ⅱ型区。综合说明本地区目前流行的NDV以新型的基因Ⅶ型最为普遍，同时兼有传统的基因Ⅵ型和古老的基因Ⅱ型；并提示基因Ⅶ型各毒株来源相近，在本地区流行时间较短，株间差异不大。 3、新城疫病毒地方株不同基因型三价灭活油乳苗的研制 应用两株当地流行的新城疫病毒基因Ⅵ型和Ⅶ型代表株(LD-3-00和斯城改病毒地方株兮各流行病李们女践其改扁拉刊LD一7-02)，配以传统的La sota株(基因11型)成功地研制了不同基因型三价新城疫灭活油乳苗.经实验室检验及大田试验证明，该三价苗安全可靠，在接种后第42天时Hl抗体效价仍保持在7.51092，攻毒试验保护率达100%;在大田试验中，与新城疫弱毒疫苗联合应用，整体保护率可达99%以上，能有效地控制当地新城疫的暴发和流行。 4、NDV地方株三价灭活油乳苗与La sota株灭活油乳苗免疫效果比较 将研制的地方株三价灭活油乳苗与La Sota株单价灭活油乳苗进行了免疫效果的比较.结果显示，三价苗免疚组在接种后各个时期所产生的HI杭体效价与La Sota株灭活苗免疫组无明显差异(P>0.05)，至接种后第42天二者均具有7.31092。但在对具有相同HI杭体水平的试验鸡进行的不同毒株攻毒试验中，二者差异较大.对于F48E9标准强毒株的攻击，无论是La Sota株疫苗免疫鸡还是三价灭活苗免疫鸡，在Hl杭体效价为6109:以上时均能100%地被保护;而在La sota株疫苗免疫鸡HI效价为6109:左右时，对基因vn型野毒株的攻击，保护率却只有O%一20%;此时，三价疫苗免疫鸡则具有60%一70%的保护率;当HI效价达81092左右时，La Sota株疫苗免疚鸡对基因vII型野毒株的攻击也只有80%的保护率，而三价疚苗免疚鸡可100%地被保护;La sota株疫苗免疫鸡只有HI效价在9109:以上，方可100%地抵杭基因vn型野毒株的攻击.说明应用由地方分离株不同基因型野毒株配以传统的La Sota株所制备的三价灭活苗的免疫效果明显优于常规的单价La sota株灭活苗，是控制目前新形势下新城疫流行的有效措施. 5、NDVF基因DNA疫苗对地方株三价灭活油乳苗的免疫协同作用 为进一步探讨控制新城疫发生和流行的新途径，本文首次观察了F基因peDNA3真核表达质粒(DNA疫苗)对地方流行株三价灭活油乳苗的免疫协同作用.结果显示:在7日龄时应用三价灭活油乳苗和DNA疫苗联合免疫的鸡群，到56日龄整个观察期内，不但利用MTT法检测的T、B淋巴细胞增殖情况显示出联合免疫组鸡的胸腺T淋巴细胞对ConA、法氏囊B淋巴细胞对PMA的反应均明显强于单纯三价油乳苗免疚组(其中除在接种后第7天时两组鸡B淋巴细胞增殖的OD570值差异不显著外，其余各检测时间两组间均表现为差异显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)，特别是T淋巴细胞增殖情况在接种14天后均表现为差异极显著，p<0 .01.);而且联合免疫组的HI杭体效价也持续性高于单纯三价油乳苗免疫鸡群，并在免疚接种后35一49天时差异显著(p<0 .05).在56日龄(免疫接种后第49天)时进行的LD一7一02野毒株攻毒保护试验中，
许宗丽[9]2013年在《鸭源新城疫病毒广西强毒分离株遗传进化分析、检测方法的建立及DNA疫苗的研究》文中研究指明新城疫(Newcastle disease)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)引起禽类的一种高发病率和死亡率的烈性传染病。目前我国山东、浙江和广东等地相继报道该疾病在鸭群中流行,已给养鸭业带来较大的经济损失。本文对鸭源NDV广西分离株GX19/2011进行生物学特性的研究,结果表明：广西分离株GX19/2011的ELD50为10-9.48/0.1mL、MDT为51.4h、ICPI为1.80、IVPI为2.82,推测该分离株GX19/2011为NDV强毒。用该毒株分别对35日龄和50日龄的鸭进行人工感染,35日龄、50日龄的鸭的发病率都为100%,死亡率分别为100%,70%。对鸭源NDV广西分离株GX19/2011的全基因进行测序并进行分析,该毒株全长为15192bp,与F48E8,GD09-2,JS/1/02/Du,JS/1/97/Ch参考毒株的亲缘关系较近,F基因核苷酸同源性为98.9%-99.1%,氨基酸的同源性为99.6%-99.8%。但与Lasota的同源性相对较低,F基因核苷酸的为88.1%,氨基酸为91.9%。进化树分析表明,该分离株属于基因Ⅸ。该分离株F蛋白裂解位点的氨基酸序列为112R-R-Q-R-R-F117,符合强毒株的裂解位点的氨基酸组合。根据GenBank中鸭源NDV的F基因和鸭圆环病毒(Duck circovirus, DuCV)的V1/rep基因的保守序列各设计一对特异性引物,并优化扩增条件,建立了同时检测鸭NDV和DuCV的二重PCR方法。该方法特异性好,对番鸭细小病毒、鸭瘟病毒、鸭肝炎病毒、鸭源小鹅瘟病毒、鸭H9亚型流感病毒、鸭疫里默氏杆菌、大肠杆菌、禽多杀性巴氏杆菌等病原核酸无特异性扩增。该方法的敏感性高,对鸭NDV的核酸最小检测量为40龟,对DuCV的为20fg。根据GenBank公布的鸭源NDV、鸭瘟病毒(Duck Plague virus, DPV)和DuCV基因序列,设计了3对特异性引物并建立了鉴别诊断鸭源NDV、DPV和DuCV的多重PCR检测方法。该方法特异性好,对番鸭呼肠孤病毒、鸭源GPV、H5亚型流感、鸭源H9亚型流感病毒、鸭疫里默氏杆菌、E.coli、禽多杀性巴氏杆菌等病原核酸无特异性扩增；敏感性高,鸭源NDV、 DPV和DuCV的核酸最低检出限分别10pg、4pg、1.5pgo对180份病料进行检测,结果DuCV阳性10份,阳性率为5.6%；鸭源NDV阳性1份,阳性率为0.56%。结果表明,建立的多重PCR方法可以应用于鸭源NDV、DPV和DuCV的临床检测和流行病学调查。根据鸭源NDV和DuCV保守基因序列,设计了2对针对鸭源NDV和DuCV的特异性引物和2条不同荧光基团标记的TaqMan探针,建立了鸭源NDV和DuCV的二重实时荧光定量PCR检测方法。该方法特异性性好,对番鸭细小病毒、鸭瘟病毒、鸭肝炎病毒、鸭源小鹅瘟病毒、鸭H9亚型流感病毒、鸭疫里默氏杆菌、大肠杆菌、禽多杀性巴氏杆菌等病原核酸无特异性扩增；敏感性高,对鸭源NDV的最小检测量是160拷贝,DuCV的为140拷贝。应用该方法对保存118份临床病料核酸进行检测,结果检出鸭副粘病毒和鸭圆环病毒阳性感染率分别为0.85%和8.47%,无混合感染。试验结果表明,建立的三种方法都具有快速、特异、敏感等优点,适用于兽医临床和实验室检测。根据鸭源NDVF基因和DuCV Cap基因开放阅读框序列,设计了2对特异性引物,PCR扩增出鸭源NDV的F基因和DuCV的Cap基因,并将其克隆到真核表达载体pcDNA3.1,成功构建重组融合表达质粒pcDNA3.1-F-Cap。经酶切和测序鉴定正确后,将重组质粒pcDNA3.1-F-Cap转染Vero细胞,采用间接免疫荧光检测到目的基因的体外表达。将pcDNA3.1-F-Cap作为DNA疫苗对2周龄的SPF雏鸭以胸部肌肉多点注射的方式进行免疫,根据接种剂量的不同,分3个实验组,每组10只,即接种剂量分别为100μg/只、200μg/只和300μg/只,同时设载体质粒空白组和灭活疫苗组,一免后两周进行一次加强免疫。每次免疫前和攻毒前各采一次血,ELASA检测抗体水平。试验结果显示：各DNA疫苗免疫组的NDV抗体和DuCV抗体水平明显高于载体空白对照组,差异显著(P<0.05)；二免后不同DNA剂量组间的抗体水平随着免疫剂量的增大而增加,差异显著(P<0.05)；二次免疫后,各疫苗试验组的抗体水平明显高于一次免疫(P<0.05),说明加强免疫有利于抗体水平的提高。于第二次免疫后2周,使用分离株GX2011/19以滴鼻的方式每只SPR鸭接种0.5m110648ELD50剂量进行攻毒试验。试验结果显示,免疫灭活疫苗组的鸭只保护率为100%,接种pcDNA3.1-F-Cap剂量为300μg/只免疫组的保护率为40%,高于pcDNA3.1-F-Cap为200μg/只组(30%)、pcDNA3.1-F-Cap为100μ g/只组(10%)和载体空白组(0%)。试验结果表明,构建的DNA疫苗对新城疫病毒的强毒攻击具有一定的抵抗了,此疫苗的保护率随着免疫剂量的增大而有所增加。
王杰[10]2013年在《截短的NDVF蛋白表达及其免疫原性研究》文中研究说明新城疫(Newcastle disease,N D)是一种高度接触性传染病，给全球养禽业造成了严重的经济损失。新城疫病毒（NDV）主要感染鸡、火鸡、鸵鸟等禽类，该病毒的融合蛋白（F）和血凝素神经氨酸酶（HN）是主要的保护性抗原，在致病过程中起到重要的作用，所以F蛋白和HN蛋白成为研究亚单位疫苗的首选抗原。参考GenBank中已发表的LaSota株的全基因序列，根据F蛋白的抗原表位设计了两对特异性引物。将LaSota弱毒疫苗接种鸡胚，收获鸡胚尿囊液，提取新鲜病毒的RNA，应用RT-PCR方法扩增F_(780)和F_(760)两个片段，将这两个片段分别克隆到pMD18-T载体上，再将鉴定后的阳性重组子克隆到pET30表达载体上的多克隆位点BamHⅠ和HindⅢ之间，得到重组质粒pET30-F_(780)和pET30-F_(760)，将质粒转化进大肠杆菌BL21(DE3）中，经IPTG诱导后表达出目的蛋白，大小约为27.9kDa和31.1kDa，经SDS-PAGE和Westem-blotting鉴定，重组蛋白F_(780)和F_(760)具有良好的反应原性。将表达出的重组蛋白F_(780)和F_(760)纯化后与弗氏佐剂等体积混合，对10日龄的雏鸡（HI约为2）进行肌肉注射免疫。将雏鸡随机分成3个不同剂量组，即I组、II组、III组，分别免疫50ug/羽、100ug/羽、150ug/羽的重组蛋白，其中每组又随机分成3个不同免疫原小组，分别肌肉注射F_(780)、F_(760)、F_(780)和F_(760)混合的蛋白，IV组肌肉注射免疫LaSota弱毒疫苗，V组肌肉注射无菌PBS。在免疫后应用血凝抑制试验(HI)检测血清中的抗体效价，结果LaSota弱毒疫苗在免疫后14天时就可以产生较高的抗体水平，并且高于I组、II组和III组，而且与PBS组存在显著差异（P＜0.01)。I组产生的抗体效价分别低于II组和III组，II组和III组之间的抗体效价差异不显著。相同免疫原HI效价的比较结果表明，F_(780)和F_(760)混合的蛋白免疫和截短蛋白免疫小组差异不显著但是和空白对照差异显著。应用间接ELISA方法检测血清中IgG抗体水平，在免疫后14d重组蛋白组和LaSota弱毒疫苗组的IgG抗体水平明显高于对照组。结果表明，重组蛋白和LaSota弱毒疫苗均可以使机体产生体液免疫。在二免后14d用10~5EID_(50)F48E8强毒进行攻毒保护性试验，I组的F_(780)、F_(760)、和混合组的保率分别为25%，12.5%，25%； II组的F_(780)、F_(760)、和混合组的保护力分别为50%、25%、50%，III组的F_(780)、F_(760)、和混合组的保护力分别为50%、37.5%、50%。IV组的LaSota弱毒疫苗保护率为100%，V组PBS的保护率为0%。由此可见，构建的重组蛋白对新城疫强毒具有一定的免疫保护力。
参考文献：
[1]. 新城疫病毒F基因与鸡IL-2重组DNA疫苗的研究[D]. 姜永厚. 东北农业大学. 2000
[2]. 鸡新城疫病毒F基因和鸡IL-2重组DNA疫苗的构建[J]. 姜永厚, 陈奖励, 宋秀龙, 童光志, 孔宪刚. 中国预防兽医学报. 2001
[3]. 密码子优化和分子佐剂增强新城疫病毒F基因DNA疫苗免疫效果[D]. 曾伟伟. 中国农业科学院. 2009
[4]. 新城疫病毒广西分离株DNA疫苗的构建、动物免疫试验及体内分布的研究[D]. 董建宝. 广西大学. 2007
[5]. 山东鸡新城疫病毒分离鉴定与Ⅱ+Ⅶ基因型灭活疫苗研究[D]. 于淼. 南京农业大学. 2009
[6]. 减毒沙门氏菌作为鸡新城疫口服DNA疫苗载体的基因免疫研究[D]. 梁雪芽. 浙江大学. 2002
[7]. NDV分离株F及HN基因的遗传变异分析与核酸疫苗质粒的构建[D]. 王学艳. 西北农林科技大学. 2008
[8]. 新城疫病毒地方株分子流行病学调查及其疫病控制[D]. 程相朝. 南京农业大学. 2003
[9]. 鸭源新城疫病毒广西强毒分离株遗传进化分析、检测方法的建立及DNA疫苗的研究[D]. 许宗丽. 广西大学. 2013
[10]. 截短的NDVF蛋白表达及其免疫原性研究[D]. 王杰. 黑龙江八一农垦大学. 2013
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