湖南省湘潭市中心医院病理科 湖南省湘潭市 411100
摘要：目的：分析脑肿瘤干细胞与神经上皮肿瘤病理级别的相关性，探讨脑胶质瘤的发生机制。方法：选择本院病理科2015年1月～2016年的手术标本，合计30份，采用10%甲醛固定，组织石蜡切片，21例星形细胞瘤（Ⅰ级5例、Ⅱ级8例、Ⅲ-Ⅳ级8例），胶质母细胞瘤9例（Ⅱ-Ⅲ级4例、Ⅲ-Ⅳ级5例），分离纯化获得BTSCs，进行增殖分析、免疫组化。结果：Ⅰ级、Ⅱ级、Ⅲ-Ⅳ级肿瘤组织获得的BTSCs第6h、1日、3日、6日的单细胞浓度、吸光值差异有统计学意义（P＜0.05），血清培养6h，Ⅰ级、Ⅱ级、Ⅲ-Ⅳ级肿瘤组织获得的BTSCs单细胞浓度差异有统计学意义（P＜0.05）。Ⅰ级、Ⅱ级、Ⅲ-Ⅳ级开始分化时，CD133表达存在明显差异，高级别的肿瘤BTSCs中CD133表达明显，Ⅰ级、Ⅱ级、Ⅲ-Ⅳ级肿瘤组织获得的BTSCs的G0/G1期、G2/M期、S期比重存在显著差异（P＜0.05）。结论：脑肿瘤干细胞与神经上皮肿瘤病理级别存在相关性，高级别的肿瘤肿瘤干细胞增殖能力更强。
关键词：脑肿瘤干细胞；神经上皮肿瘤病例；相关性分析
脑是肿瘤好发部位，脑肿瘤是人类神经系统疾病第二大死亡原因，仅次于脑卒中。神经上皮肿瘤即胶质瘤，多见于中青年人群，也好发于10岁左右儿童，是儿童常见颅内肿瘤，其具体发病机制尚不清楚，表现为三高一低，预后较差，完整切除率低，肿瘤转移、复发极快，具有强大的血管生成能力，与干细胞特性存在相似性[1]。关于胶质瘤的发生机制尚无明确的定论，近年来陆续从各系统肿瘤中分离得到肿瘤干细胞，肿瘤干细胞假说认为实体瘤和流涕瘤同样是由部分有现分化能力的细胞组成[2]。本次研究试分析脑肿瘤干细胞与神经上皮肿瘤病理级别的相关性，探讨脑胶质瘤的发生机制。
1材料与方法
1.1 样本来源
选择本院病理科2015年1月～2016年的手术标本，合计30份，采用10%甲醛固定，组织石蜡切片，21例星形细胞瘤（Ⅰ级5例、Ⅱ级8例、Ⅲ-Ⅳ级8例），胶质母细胞瘤9例（Ⅱ-Ⅲ级4例、Ⅲ-Ⅳ级5例）。
1.2 仪器与试剂
主要包括小鼠单抗CD133单克隆抗体，小鼠抗人Ki67单克隆抗体，常规免疫组化试剂盒，表皮生长因子，胎牛血清，胰蛋白酶等等。仪器设备主要包括CO2恒温恒湿培养箱，荧光显微镜和成像系统，台式低速离心机，数码相机，4℃电冰箱，微量可调移液器，无菌显微手术器械等。调配得到的基础培养基（BM）、无血清培养基（SFM）、血清培养基础（SCM）、红细胞裂解液，0.05M磷酸盐缓冲液（PBS），0.4%台盼蓝染色剂等。
1.3 方法
肿瘤组织均在手术无菌条件下获得，无边缘无囊变坏死钙化、电凝处理的的样本，立即置于无菌无血清培养基，4℃冷藏，是实验室进行分离培养。无菌条件下剪去外周坏死组织、血管、血块，必要时去除纤维组织，冲洗，剪碎，吹打单细胞悬液，74μm孔径筛网过滤，过滤液1000r/min离心5min，弃上清，取余液，按照1：体积加入预热37℃红细胞裂解液，静置2min，离心5min，弃上清，添加1ml无血清培养基，进行染色计算活细胞数。DMEM/低糖培养基，培养，4-5h换液1次，高级别肿瘤获得细胞每隔2-3日换液1次，显微镜下观察。采用细胞流式细胞学技术鉴定第4代干细胞，微镜下进行鉴定。放弃培养液，预冷PBS，清洗2遍，0.25%胰酶消化1-2min，制作细胞悬浮液，将其转入到离心管，1000r/min，离心5min，弃上清，加入5ml培养基，继续观察培养。参照陈晓敏等方法进行原代细胞培养2周，进行4次换液传代，筛选纯化与免疫荧光鉴定。采用细胞技术与MTT法检测BTSCs细胞增值率。取2瓶第4代生长良好的BTSCs消化离心，加入细胞培养液，制成悬浮液。显微镜下计数，调整浓度，分别种植在6孔板，每隔5×104个，进行标记，第0、1、3、5进行消化离心，加入培养液，制成悬浮液，取500μl悬浮液进行细胞计数，绘制细胞生长曲线。MTT闭塞实验：通过酶标仪在490～570nm波长下测定吸光值，检测活细胞数量。MTT溶液为自配，每孔加入1mlMTT溶液，分别在地0、1、3、5日检测吸光度值，反应细胞增殖情况。
1.4 观察指标
Ⅰ级、Ⅱ级、Ⅲ级肿瘤BTSCs无血清培养瓶6h、1日、3日、6日细胞浓度与吸光度，血清培养6h细胞浓度，生长周期，CD133表达情况。
1.5 统计学处理
采用SPSS20.0软件进行统计学计算，单细胞浓度、吸光值采用（Mena±SD）符号（ ±s）表示，服从正态分布组间两两比较采用t检验，多组间比较采用F检验，计数资料采用例或率符号n、%表示，采用 检验或Fisher精确性检验进行组间比较，以P＜0.05表示差异具有统计学意义。
2 结果
Ⅰ级、Ⅱ级、Ⅲ-Ⅳ级肿瘤组织获得的BTSCs第6h、1日、3日、6日的单细胞浓度、吸光值差异有统计学意义（P＜0.05），三者呈递进关系，Ⅲ-Ⅳ级第6h、1日、3日、6日的单细胞浓度、吸光值高于Ⅰ级、Ⅱ级，Ⅱ级高于Ⅰ级，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。血清培养6h，Ⅰ级、Ⅱ级、Ⅲ-Ⅳ级肿瘤组织获得的BTSCs单细胞浓度分别为（2.25±0.04）×105/ml、（2.50±0.13）×105/ml、（12.43±1.34）×105/ml，差异有统计学意义（P＜0.05）。Ⅰ级、Ⅱ级、Ⅲ-Ⅳ级开始分化时，CD133表达存在明显差异，高级别的肿瘤BTSCs中CD133表达明显。
注：与Ⅰ级相比，*P＜0.05；与Ⅱ级相比较，△P＜0.05。
Ⅰ级、Ⅱ级、Ⅲ-Ⅳ级肿瘤组织获得的BTSCs的G0/G1期、G2/M期、S期比重存在显著差异（P＜0.05），随着分级上升，S期占比也明显上升。见表2。
3 讨论
从本次研究来看，脑肿瘤干细胞与神经上皮肿瘤病理级别存在相关性，高级别的肿瘤肿瘤干细胞增殖能力更强，与此同时S期的占比也更高，反映了肿瘤干细胞随着病理级别的上升，生长能力也增强，生长周期发生显著变化，这可能是高级别神经上皮肿瘤更容易出现转移、复发、耐药的原因[3]。
参考文献：
[1]尹丰，张剑宁，赵明明，等.胶质瘤干细胞与神经干细胞基因表达差异的微阵列基因芯片分析[J].军杂，2014，39（10）：800-803.
[2]蒋静，陈力，于顺江，等. 神经胶质瘤生物治疗的研究现状与进展[J].中华临床医师杂志（电子版），2014，8（3）：517-519.，
[3]徐国政，袁先厚．脑胶质瘤靶向治疗新进展[J].中国临床神经外科杂志，2011，16（9）：568-571.
论文作者:罗文伟
论文发表刊物:《中国误诊学杂志》2017年第6期
论文发表时间:2017/6/9
标签：肿瘤论文; 干细胞论文; 细胞论文; 血清论文; 单细胞论文; 统计学论文; 浓度论文; 《中国误诊学杂志》2017年第6期论文;