谭琳, 康由发, 马兵刚, 郑学勤[1]2003年在《芪合酶基因转化番茄产生白藜芦醇的研究》文中研究说明为了获得含有白藜芦醇的转基因番茄,从葡萄雷司令中克隆到芪合酶基因,以之构建了含有组成型启动子的植物表达载体pBS2,用于农杆菌介导对番茄品种TXOO14的遗传转化.通过对诱导愈伤、出芽、生根、再生植株的筛选,得到5株再生小苗.经PCR、Southern检测证实,有3株为真正的转基因植株.用HPLC对3株转基因植株叶片进行白藜芦醇含量鲜重分析,它们中白藜芦醇的含量分别为12.45μg g,5.35μg g,4.55μg g.
谭琳, 郑学勤[2]2002年在《芪合酶基因转化番茄产生白藜芦醇的研究》文中提出白藜芦醇(Resveratrol)是种子植物中的一种植保素,近年来,科学家相继发现它是一种天然抗氧化剂、抗诱变剂。具有预防心脑血管疾病,预防肿瘤和老年痴呆症等保护人体健康等功能。番茄作为一种大众化、日常食用蔬菜,富含维生素A、B和P,特别是其番茄红素对预防前列腺癌具有一定的作用,因此,将合成白藜芦醇的芪合酶基因导入番茄,获得富保健价值的番茄新品种将产生重要的社会和经济效益。
谭琳[3]2002年在《芪合酶基因转化番茄产生白藜芦醇的研究》文中进行了进一步梳理白藜芦醇(resveratrol)是由一些种子植物对受伤作出反应时产生的一种植保素，实验证明白藜芦醇能够调节脂代谢和抑制低脂蛋白的氧化和血小板的凝集，而且能够提供心血管保护，并具备抗炎症和抗癌特性，对保护人体健康十分有益。番茄作为一种大众化、日常食用蔬菜，富含维生素A、B和P，特别是其番茄红素(lyxopene)对预防前列腺癌具有一定的作用，因此，将合成白藜芦醇的芪合酶基因导入番茄，获得更具保健价值的番茄新品种将产生重要的社会和经济效益。 本研究包括四个方面的内容：芪合酶基因(Stilbene synthase gene)的克隆与全序列分析；芪合酶基因(stilbene synthase gene)植物表达载体的构建；农杆菌LBA4404介导的番茄遗传转化：HPLC技术分析转基因植株中表达白藜芦醇的含量。 通过PCR扩增和克隆，获得了来自葡萄(vitis vinefera)品种雷司令和粉红玫瑰叶片中的芪合酶基因(Stilbene synthase gene)。DNA序列分析结果表明，来自雷司令的芪合酶基因全长1617bp，与文献报道的该基因(pVIN)比较，碱基同源率为99％，来源于粉红玫瑰的芪合酶基因全长1622bp，与pVIN的序列比较，碱基同源率为98％。两者都编码392个氨基酸与pVIN一致。 用BamH I和Sac I同时酶切pS2(S2表示来自雷司令的芪合酶基因)、pS1(S1表示来自粉红玫瑰的芪合酶基因)以及pBI121、pEV2，使得S2、S1分别插入替代pBI121、pEV2中的GUS基因，构建成植物表达载体pBS2、pEV2S1，pBS2中含CaMv35s组成型启动子，使S2基因能在番茄植株的各个部位表达；pEV2S1则含有果实特异性启动子TFP2，使S1基因只在番茄果实中表达。经双酶切鉴定，证实S2、S1基因己插入到pBS2和pEV2S1中。将pBS2和pEV2S1通过叁亲交配法导入农杆菌，经PCR鉴定证实pBS2和pEV2S1已导入LBA4404。 番茄TX0014和抗青枯3两个品种对kan的敏感程度差异不大，当kan浓度为50mg／L时，叶盘黄化，几乎不形成愈伤：而50mg/L的kan使番茄植株不能生根和生长。通过对转化条件进行优化，发现在含有100μmol/L AS的MS培养基中，用0D_(600)值为0.1的新鲜活化的LBA4404侵染2-3分钟后子叶叶盘在kan50mg/L的MS培养基上的出愈率和分化率最佳。 通过kan生根筛选，获得转芪合酶基因(S2)的番茄TX0014品种5株，提取这5株转基因植株和一株对照植株的总DNA，作PCR检测，5株均呈阳性，而对照植株无特异片段出现，继续Southern检测，结果表明，芪合酶基因(S2)已整合到其中3株的基因组中。取这3株的嫩叶，对照植株(2株)的嫩叶，作HPLC分析，3株转基因植株中均检测到白藜芦醇的存在。其含量分别为12.45mg／kg，5.35mg／kg，4.35mg／kg，而对照植株未检出，这表明芪合酶基因(S2)已在转基因番茄中表达。 本研究，为番茄的品质改良育种，探索出一条新的方法和途径，具有一定的理论意义和实际应用前景。
郭春叶[4]2007年在《芪合酶基因酵母表达载体的构建及其表达研究》文中指出本试验应用基因重组技术构建葡萄芪合酶基因(stilbene synthase,STS)重组酵母菌,通过半乳糖诱导外源基因表达,验证芪合酶基因在酵母菌中的表达情况,进而为开发一种含有白藜芦醇生物活性成分的酵母微生态制剂提供了重要的试验素材。将从中国野生属葡萄种高抗白粉病的华东葡萄白河-35-1中分离出的芪合酶基因cDNA片段,进行PCR扩增;把纯化回收的目的基因PCR产物定向插入克隆载体pGEM-T Easy中进行测序与序列分析;经DNA测序,克隆片段全长1195 bp,其中编码芪合酶基因的片段长1179 bp(包括起始密码子和终止密码子),共编码392个AA,与Genbank中已有的葡萄芪合酶基因进行同源性比对,其核苷酸同源性达98 %,由此推导出的氨基酸序列与已公布的氨基酸序列同源性为99 %,且位于第164位的半胱氨酸(Cys)酶活中心的碱基未发生突变。将芪合酶基因与克隆载体pGEM-T Easy连接的重组质粒pGEM-T-STS以及酵母表达载体pYES6/CT用BamH I/Xho I双酶切,采用定向克隆的方法将纯化回收的芪合酶基因克隆到大肠杆菌-酵母菌穿梭型载体pYES6/CT上,转化大肠杆菌,提取阳性重组质粒转化酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)菌株INVSc1,经杀稻瘟素(Bsd)抗性筛选出阳性克隆转化子,并进行菌落PCR鉴定;酵母菌落PCR电泳结果显示,在约1200 bp处出现一条亮带,证明芪合酶基因酵母表达载体pYES6/CT-STS构建成功。将含有阳性单克隆的酵母菌用半乳糖诱导表达,收集诱导表达4、8、12、16、20及24 h的酵母菌采用超声波破碎菌体,并进行全蛋白SDS-PAGE电泳分析;SDS-PAGE电泳分析发现与空白菌相比含目的基因的诱导菌有目标带(48 kDa)出现,证明目的基因cDNA片段可以在酵母菌中表达。本试验成功构建了葡萄芪合酶基因酿酒酵母表达载体,并实现了在酿酒酵母菌的大量表达,为下一步利用该菌株生产微生态制剂奠定了基础。
柳忠玉[5]2012年在《虎杖PcRS和PcPKS1基因在白藜芦醇生物合成中的调控作用》文中认为白藜芦醇是植物在长期进化过程中为增强自身对不良环境（如病原菌入侵、紫外线辐射等）而合成的植保素。研究报道白藜芦醇具有广泛的药理作用，包括抗肿瘤、保护心血管系统、延缓衰老等。白藜芦醇合酶是白藜芦醇生物合成途径中的关键酶之一，该酶与查尔酮合酶催化相同的底物。已有的研究表明白藜芦醇合酶基因与查尔酮合酶基因可能在生物合成途径中相互影响和相互调节。尽管关于白藜芦醇合酶与查尔酮合酶基因的研究报道很多，但是来源于虎杖的白藜芦醇合酶和查尔酮合酶基因的研究鲜有报道。已有研究者利用同源克隆的方法从虎杖中分离了基因PcRS和PcPKS1，推测其分别编码白藜芦醇合酶和查尔酮合酶。但是这两个基因在植物体内的功能以及如何调控白藜芦醇生物合成还未见文献报道。本课题通过在转基因拟南芥和虎杖植株中过量表达PcRS基因以及RNA干涉抑制PcPKS1基因的表达这两种策略，来考察分析PcRS基因和PcPKS1基因对白藜芦醇生物合成的调控作用，这对虎杖白藜芦醇生物合成途径的深入了解有非常重要的意义。本文的主要研究结果如下：（1）首先考察了PcRS基因的组织表达特性，Northern blot分析表明该基因在虎杖根茎中特异表达，这种转录模式与HPLC测得的白藜芦醇在虎杖各组织中的分布模式一致，推测PcRS基因与白藜芦醇生物合成有关。（2）为了分析PcRS基因在植物体内的功能，构建CaMV355启动子驱动的PcRS过量表达载体pCAMBIA1380-35S-PcRS并转化拟南芥。经高效液相色谱分析和质谱鉴定，转基因拟南芥植株能产生新的特异成分白藜芦醇苷。进一步分析发现，虽然外源PcRS基因在拟南芥叶、花、茎中组成型表达，但是白藜芦醇苷含量分布具有组织特异性，其中生长4周的叶片中白藜芦醇苷的含量最高（183.73μg/g鲜重）。以上结果证明，PcRS基因在植物体内具有促进白藜芦醇合成的功能，但是白藜芦醇的合成积累可能受PcRS基因的表达与底物浓度共同调控。（3）为了考察转基因拟南芥植株产生白藜芦醇苷是否具有生物活性，测定转基因拟南芥产生的白藜芦醇苷对炭疽病原菌的抑制率，当白藜芦醇苷浓度为50μg/mL时，抑制率达到50%。进一步用离体叶片法鉴定转基因拟南芥对炭疽病的抗性，叶片坏死斑直径减少56-65%，坏死斑上的孢子数减少75-80%，表明转基因拟南芥对炭疽病抗性增强。以上结果表明，转基因拟南芥植株产生的白藜芦醇苷具有抗炭疽病原菌的生物活性，推测PcRS基因可能参与植物抗病性调节。（4）为了确认白藜芦醇苷在转基因拟南芥中的积累是否会影响其它次生代谢物的合成，进行了进一步研究。野生拟南芥种皮颜色为褐色，而转基因拟南芥的种皮变为黄色，转基因拟南芥种皮中单宁合成受到抑制。转基因拟南芥子叶颜色变浅，花青素含量显着减少46-50%，表明转基因拟南芥中的花青素合成受到抑制。以上结果表明，外源PcRS基因的导入引起转基因拟南芥植株自身的黄酮物质的代谢流受阻。而表达分析显示转基因拟南芥内源的查尔酮合酶基因AtCHS表达没有下调。推测这种表型的改变不是由于内源AtCHS基因的下调，而是由于外源PcRS与内源AtCHS竞争底物。（5）在验证了PcRS基因功能的基础上开展了利用过量表达PcRS基因的策略来调控虎杖中白藜芦醇生物合成的工作。首先以虎杖茎尖为转化受体，对影响转化效率的因素如对潮霉素的敏感性、农杆菌液浓度、浸染时间、共培养时间、预培养时间等进行考察，建立根癌农杆菌介导虎杖茎尖遗传转化体系。随后利用该转化体系，将PcRS过量表达载体导入虎杖中并成功获得转基因虎杖。转基因虎杖及其后代表型无显着变化。转基因虎杖中PcRS的表达量是对照植株的1.4～1.9倍；白藜芦醇苷含量是对照植株的1.2～1.9倍。以上结果表明PcRS基因过量表达促进了虎杖中白藜芦醇的生物合成。（6）PcRS基因过量表达在一定程度上能促进虎杖中白藜芦醇生物合成，但是其含量提高的幅度并不大，于是开展了利用RNA干涉抑制PcPKS1基因表达的策略来调控虎杖中白藜芦醇生物合成的工作。首先构建CaMV355启动子驱动的PcPKS1干涉载体（pRNAi-PcPKS1）。随后利用已建立的转化体系将pRNAi-PcPKS1导入虎杖中，并成功获得转基因虎杖。转基因株系中PcPKS1的表达量明显低于对照植株，表达量下调39-87%；白藜芦醇苷含量明显提高，是对照植株的2.5-4.1倍；同时总黄酮含量减少14-42%；槲皮素含量减少22-62%。表型观察发现，表达量下调最多的转基因株系B5及其后代的表型都发生明显变化，其茎杆颜色变浅，花青素含量显着减少52%。以上结果表明，PcPKS1基因的表达下调抑制了虎杖黄酮物质的合成，使代谢流偏向白藜芦醇的合成，从而在一定程度上促进了虎杖中白藜芦醇的生物合成。综上所述，本课题证明PcRS基因编码的酶在植物体内具有白藜芦醇合酶的功能。PcRS过量表达和PcPKS1基因RNA干涉都能促进虎杖中白藜芦醇的生物合成。
谭琳, 郑学勤, 康由发, 施江[6]2003年在《芪合酶基因的克隆与植物表达载体的构建》文中进行了进一步梳理为获得含白藜芦醇且具有保健作用的转基因番茄,进行了芪合酶基因克隆、植物表达载体构建及导入受体细胞的研究。从葡萄2个品种———雷司令和粉红玫瑰的叶片中提取基因组DNA,并以其为模板,经PCR扩增芪合酶基因,各获得一长约1.6Kb的片段,将这2个片段分别连接到pGEM-Teasy和pUCm-T上进行测序,1个片段长为1622bp(命名为S1),另一个片段长为1617bp(命名为S2)。然后将S1正向插入pEV2的果实特异性启动子TFP2和NOS终止子,构建了植物表达载体pEV2S1;将S2正向插入植物表达载体pBI121的35S启动子和NOS终止子之间,构建了植物表达载体pBS2。将重组体pEV2S1和pBS2转化大肠杆菌E.coliXL1,并对重组体进行了筛选和鉴定。
郭辉力[7]2016年在《4-香豆酰辅酶A连接酶（4CL）-芪合酶（STS）基因融合、表达、催化活性鉴定及其在枣树中的过表达》文中进行了进一步梳理枣树是起源于我国的古老果树,目前是我国产量最高的干果类果树。近年来,我国枣树感病寄主呈现不断增加趋势,病原涉及9个真菌属和4个细菌属。枣树真菌病害已严重影响到枣果实的产量和品质。白藜芦醇是植物受到病原性进攻和环境恶化时产生的一种植保素,对植物真菌性病害具有明显的拮抗作用。对人类而言,白藜芦醇具有抗肿痈、保护心血管、抗氧化等多种功能。利用植物基因工程的基木原理和技术,将白藜芦醇生物合成途径关键基因转入枣树,不仅有望提高枣树拈抗真菌病害能力,也有可能改良枣果实的保健品质。白藜芦醇代谢途径中限速步骤较多,单纯过量表达某一个关键酶虽然可能对白藜芦醇的含量产生一定的促进作用,但由于其它步骤的限制,白藜芦醇高水平积累非常困难。要想大幅度提高转基因植物中白藜芦醇的含量,有必要进行多个基因共转化的尝试。通过基因融合技术产生的融合蛋白因存在“邻近效应”而具有更高的催化活性,是多基因共转化的首选,将构建的融合基因遗传转化枣树,有望大幅度提高白藜芦醇在枣树中的积累。白藜芦醇是芪合酶(STS)的产物,不同植物中STS的催化效率差异很大。白藜芦醇生物合成途径中,为STS提供4-香豆酰辅酶A底物的4-香豆酰辅酶A连接酶(4CL)和STS所催化的反应为整个途径的限速步骤。本研究首先从不同植物中鉴定和筛选高活性STS,设计5种不同长度的连接肽(过渡氨基酸链,Linker),将4CL与鉴定获得的高活性STS进行基因融合,构建4CL-STS融合基因。通过原核表达系统,对融合酶进行催化活性鉴定和酶动力学分析,确定融合酶获得最强“邻近效应”的基因融合方式。将鉴定成功的高活性融合酶基因构建植物表达载体,遗传转化枣树,实现融合基因在枣树中的过表达,确定转基因枣树植株中白藜芦醇的积累水平井验证其对真菌性病害的拮抗能力。研究结果如下：1.通过overlap PCR技术从葡萄叶片基因组DNA中克隆得到葡萄STS基因,连同前期丁作中获得的虎杖S璐基因,进行了原核表达分析。诱导表达产物经过Ni2+亲和柱纯化和PD-10柱脱盐后,均得到分子量约43 kDa的可溶性纯化蛋白。酶促产物分析结果表明,两种酶催化产物均为白藜芦醇。酶动力学分析表明,虎杖STS催化效率(Kcat/Km)是葡萄STS的2.4倍。且从植物类型Ⅲ聚酮化合物合酶(Polyketide synthase, PKS)超家族催化活性位点和保守位点角度分析了造成上述两种酶活性产生差异可能存在的原因。2.设计5种不同长度的Linker:(GSG)1、(GSG)2、(GSG)3、 (GSG)4和(GSG)5,通过overlap PCR和大引物降落PCR技术将拟南芥4CL基因与虎杖STS基因进行融合,得到融合基因4CL-xa-STS (x=3,6,9,12,15,a代表氨基酸残基),将其插入到原核表达载体pET30a(+)·的BamH I和Xho Ⅰ酶切位点之间,构建N端携带His标签的融合酶重组表达载体pET30a-4CL-xa-STS。将pET30a-4CL-xa-STS转入大肠杆菌Rosetta,进行原核表达分析。表达产物经Ni2+亲和柱纯化和PD-10柱脱盐后,得到分子量均约104 kDa的5种可溶性纯化融合蛋白。体外酶促产物分析结果表明,5种融合酶均表现出4CL与STS的双重活性,催化产物均为白藜芦醇。酶动力学分析表明,除无Linker、直接融合的4CL-0a-STS活性极低外,随着Linker序列长度的增加,融合酶催化效率依次降低,4CL-3a-STS的催化效率最高。融合蛋白同源模型分析表明两个蛋白结构域之间没有氢键或盐桥等强极性相互作用,活性位点的物理距离可能是影响融合酶活性的唯一因素,较长Linker增加了活性位点问的距离,从而降低了融合酶的活性。3.将经过鉴定的4CL-3a-STS构建植物表达载体,通过根癌农杆菌介导遗传转化壶瓶枣,4CL-3a-STS融合基因在组成型启动子(CaMV35S启动子+Ω增强子)的驱动下,实现了在转基因枣树植株中的过表达。经抗生素筛选和分子鉴定后获得5株转基因阳性植株。PCR、PCR-Southern和Northern检测结果表明融合基因4CL-3a-STS成功整合到赢瓶枣核基因组中,并在转录水平表达。壶瓶枣转融合基因植株中白藜芦醇平均含量明显提高,为2.07μg/g鲜重,是转STS单基因枣树植株的4.6倍。抑菌活性测定表明转基因植株提取物对枣树常见真菌病害——枣黑斑病病原菌枣假尾孢(Isariopsis imdica)和枣黑疔病病原菌细交链孢菌(Alternaria alternate)有明显的抑制作用。
王晓丽[8]2007年在《转基因植物中白藜芦醇生物合成的调控》文中进行了进一步梳理白藜芦醇(Resveratrol,Res)属芪类化合物,是一种植物保护素。它能够预防心脑血管疾病、防治癌症、具有植物雌激素以及抗氧化等作用,因此引起了人们的广泛关注。然而白藜芦醇在自然界的含量并不丰富,因此人们期望能通过植物基因工程的方法在某些植物中大量合成该化合物或者提高葡萄等自身能够合成白藜芦醇的植物中的含量。白藜芦醇通过苯丙烷类代谢途径合成,合成的关键酶是白藜芦醇合酶(resveratrol synthase,RS),它与查尔酮合酶使用相同的底物。本研究主要是利用转基因的方法在生菜中合成白藜芦醇并提高其在转基因植物中的含量;同时我们还发现葡萄、爬山虎、虎杖等植物中合成白藜芦醇与其共生真菌有密切关系,本研究还初步探索了通过促进内生真菌的生长及真菌与宿主植物的相互作用的方法来提高植物生产白藜芦醇的含量。本论文主要涉及以下叁个方面的内容:1.根据已有的白藜芦醇合酶序列设计一对引物,利用RT-PCR的方法从葡萄科植物川鄂爬山虎(Parthenocissus henryana)中分离到RS的长为1179bp全长编码区。该序列与葡萄中RS的核苷酸相似性达94%,并且在164位具有白藜芦醇合酶共有的保守的半胱氨酸残基。2.把克隆得到的RS序列置于组成型启动子CaMV35S启动子的控制下,以除草剂抗性基因为选择标记,并在该表达框两侧引入MAR序列(Matrix Attachment Regions,能提高其序列间的基因的表达),采用农杆菌介导的叶盘法转化生菜(Lactuca Sativa L.)。PCR和RT-PCR等方法证明该基因已经转化到植物中并且能够正常表达。HPLC图谱显示:转基因植物的叶片提取物图谱中有一个与白藜芦醇标准品的保留时间一致的吸收峰。电喷雾离子化质谱(ESI-MS)显示具有该吸收峰的化合物的核质比与白藜芦醇标准品的相同,证明在转基因植物中成功合成了白藜芦醇。在不同植物中白藜芦醇的含量也是不同的,在生菜中为几十微克每克叶片鲜重。3.从爬山虎(Caulis Parthenocissi Tricuspidatae)的内生真菌中克隆得到了白藜芦醇合成的关键酶基因—白藜芦醇合酶基因(RS),该基因与爬山虎中RS基因的核酸序列相似性为95.25%,氨基酸序列相似性为97.45%,经rDNA的18S序列比对鉴定,该菌为枝孢霉属(Cladosporium sp.)。HPLC和ESI-MS分析表明,该菌在离体培养下也能合成与其宿主植物一样的次生代谢物—白藜芦醇。
程皓[9]2015年在《生产白藜芦醇基因工程菌株的构建与表达研究》文中研究表明白藜芦醇(Resveratrol,Res)是一种非黄酮类多酚化合物,广泛存在于虎杖、葡萄等植物中。近年来,研究者发现白藜芦醇具有很多对人类有益的功效,比如抗癌、抗氧化、延缓衰老、预防心血管疾病等,这使得白藜芦醇成为最有前途的天然活性物质之一,不仅有成为抗癌新药的潜力,还广泛用于保健品、化妆品市场。然而,白藜芦醇在植物中的含量较低,从植物中提取纯度低,难度大,无法满足市场的需求,因此,开发制取白藜芦醇新方法尤为重要。本论文的研究以基因工程技术为基础,利用微生物繁殖快,代谢强的特点构建能够生产白藜芦醇的工程菌,并通过工程菌的发酵培养,将原料4-香豆酸转化为白藜芦醇,并达到了一定的产量,为将来的工业化打下了基础。微生物合成的方法不仅工艺成熟,而且目标明确,同时也保护了植物资源。在本论文中,首先将合成白藜芦醇的两个关键酶基因4cl和sts分别从拟南芥和葡萄中克隆出来。4cl基因表达蛋白为4-香豆酸:CoA连接酶,催化底物4-香豆酸合成4-香豆酰辅酶A;sts基因表达蛋白为芪合酶,催化1分子的4-香豆酰辅酶A和3分子的丙二酸单酰辅酶A生成白藜芦醇。构建了 3个重组质粒,第一个是共表达体系pETduet-sts-4cl重组质粒,它能够分别表达4cl和sts基因;第二个是融合表达体系pETduet-sts::4cl重组质粒,它能够表达融合蛋白STS::4CL;第叁个是融合表达体系pETduet-4cl::sts重组质粒,它能够表达融合蛋白4CL::STS。将这3个重组质粒分别导入大肠杆菌表达菌株BL21中,得到能够生产白藜芦醇的工程菌。在这3个工程菌中加入1 mM的底物4-香豆酸,并经过发酵后,HPLC检测白藜芦醇产量分别为:12.0mg/L,61.1mg/L,24.2 mg/L。考虑到作为底物之一的丙二酰CoA在细胞中的含量不足,本研究首次将拟南芥中克隆出来的丙二酰CoA合成酶基因aae构建到产白藜芦醇工程菌中,形成的重组质粒为pETduet-sts::4cl-aae,并利用大肠杆菌BL21作为宿主菌,在加入底物4-香豆酸和丙二酸的条件下,发酵生产白藜芦醇产量达80.8 mg/L。
黄骐[10]2006年在《农杆菌介导花生白藜芦醇合酶基因转化马铃薯研究》文中进行了进一步梳理利用质粒pCAMBIA1301构建以CaMV35S为启动子的花生白藜芦醇合酶基因表达载体pB3RS，通过PCR和限制性内切酶酶切验证构建正确。利用电穿孔法将重组质粒pB3RS导入根癌农杆菌菌株LBA4404中，并通过PCR和限制性内切酶酶切验证。以马铃薯克新3号脱毒种薯为受体材料，最佳分化培养基为MS+ZT 2.0 mg／L+IAA 1.0 mg／L，其愈伤组织诱导率为100％，不定芽分化率为80％。试验表明适宜的转化条件为：转化时外植体无需预培养，菌液OD_(600)=0.1-0.5，接种浸泡时间为5-10 min，共培养时间为2d。共获得10个目的基因PCR检测阳性的马铃薯无性系，对其中的克新3-2无性系进行Southern杂交鉴定，结果为阳性，表明外源目的基因可能已整合到植物基因组中。
参考文献：
[1]. 芪合酶基因转化番茄产生白藜芦醇的研究[J]. 谭琳, 康由发, 马兵刚, 郑学勤. 生命科学研究. 2003
[2]. 芪合酶基因转化番茄产生白藜芦醇的研究[C]. 谭琳, 郑学勤. 加入WTO和中国科技与可持续发展——挑战与机遇、责任和对策（下册）. 2002
[3]. 芪合酶基因转化番茄产生白藜芦醇的研究[D]. 谭琳. 华南热带农业大学. 2002
[4]. 芪合酶基因酵母表达载体的构建及其表达研究[D]. 郭春叶. 西北农林科技大学. 2007
[5]. 虎杖PcRS和PcPKS1基因在白藜芦醇生物合成中的调控作用[D]. 柳忠玉. 华南理工大学. 2012
[6]. 芪合酶基因的克隆与植物表达载体的构建[J]. 谭琳, 郑学勤, 康由发, 施江. 热带作物学报. 2003
[7]. 4-香豆酰辅酶A连接酶（4CL）-芪合酶（STS）基因融合、表达、催化活性鉴定及其在枣树中的过表达[D]. 郭辉力. 北京林业大学. 2016
[8]. 转基因植物中白藜芦醇生物合成的调控[D]. 王晓丽. 石河子大学. 2007
[9]. 生产白藜芦醇基因工程菌株的构建与表达研究[D]. 程皓. 山东大学. 2015
[10]. 农杆菌介导花生白藜芦醇合酶基因转化马铃薯研究[D]. 黄骐. 福建师范大学. 2006
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