邓勇 吴冬梅
（福建中医药大学附属第二人民医院妇产科 福建福州 350013）
【摘要】目的 检测全反式维甲酸对人子宫内膜癌HEC-1-B细胞。方法 采用MTT比色法测定全反式维甲酸对细胞作用后细胞生长抑制率, 逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测S期激酶相关蛋白mRNA的表达。结果 随着全反式维甲酸浓度增加，Skp2mRNA表达逐渐减少，差别有显著性意义，P<0.001。结论 全反式维甲酸对人子宫内膜癌细胞株的增殖具有显著的抑制作用。
【关键词】 全反式维甲酸 子宫内膜癌 Skp2
【中图分类号】R737.33 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2014）02-0125-02
The effect of all-trans retinoic acid on expression of S-phase kinase associated protein 2 in endometrial carcinoma cell HEC-1-B.
Dengyong WongDongMei
Department of Obstetrics & Gynecology; The Affiliated Second People Hospital; Fujian College of Traditional Chinese Medicine ;
【Abstract】Objective: To study the mechanism of all-trans retinoic acid on human endometrial carcinoma cell HEC-1-B.Methods: Cell proliferation was evaluated by MTT assay，the expression level of Skp2 mRNA was examined by reversed transcript polymerase chain reaction (RT-PCR). Results: Conclusion: all-trans retinoic acid can inhibit the growth of HEC-1-B cell line.
【Keywords】 all-trans retinoic acid endometrial carcinoma cell Skp2
子宫内膜癌是女性最常见恶性肿瘤之一。据统计，2010年美国有43470例新发子宫内膜癌患者，7950例死于子宫内膜癌，其主要治疗方式是手术治疗和对高危型患者术后加以辅助治疗[1]，包括化疗。维甲酸是在人体内参与细胞生长和分化调节的重要信号分子，其有多种形式，全反式维甲酸是维甲酸类化合物的活性形式[2]，具有抑制细胞生长、促进细胞分化等多种生物学功能，这已成为肿瘤治疗的研究热点。本研究通过观察全反式维甲酸对人子宫内膜癌HEC-1-B细胞S期激酶相关蛋白（Skp2）表达的影响，探讨其抗肿瘤机制，以期为子宫内膜癌化疗提供新思路。
1 材料与方法
1.1材料
人子宫内膜癌细胞株购自中科院上海细胞库；全反式维甲酸、四甲基偶氮唑蓝（MTT）均购自Sigma公司Trizol购于Invitrogen公司；PrimeScriptTM RT reaget Kit、SYBRRPremix Ex TaqTM购自Takara生物公司；鼠抗人Skp2单克隆抗体购自Invitrogen公司。
1.2方法
1.2.1 细胞培养
人子宫内膜癌细胞株HEC-1-B在DMEM培养液中消化传代。取对数生长期细胞进行实验。
1.2.2 MTT法检测全反式维甲酸对HEC-1-B细胞增殖的影响
接种：取对数生长期的细胞制成单细胞悬液。实验组加入含有不同浓度的全反式维甲酸,设空白对照组。于药物处理1、2、3d各取出一块96孔板，实验重复3次。
1.2.3 RT-PCR检测各组细胞中Skp2mRNA的表达
实验组分别加入不同浓度的全反式维甲酸,对照组不加任何处理。按产品说明书提取总RNA。采用反转录试剂盒按说明书进行反转录反应，合成cDNA。
1.3 统计学处理
用SPSS13.0软件进行统计分析，数据用x-±S表示，处理组与对照组结果采用两独立样本t检验，以P < 0.05为有统计学意义。
2 结果
2.1 表1不同浓度全反式维甲酸对细胞增殖的影响（MTT法检测， x-±SD）
组别 作用时间（d） 1 2 3 Ctrl 0.062±0.016 0.124±0.012 0.221±0.063 10-8mol/L 0.058±0.019* 0.118±0.018* 0.195±0.031** 10-7mol/L 0.057±0.015* 0.094±0.008** 0.171±0.023** 10-6mol/L 0.055±0.014* 0.079±0.015** 0.153±0.018**
同Ctrl组相比，**P＜0.01, *P＜0.05
由表1可知在10-8-10-5mol/L浓度范围内，全反式维甲酸对HEC-1-B细胞均有抑制作用，且各组对细胞的抑制率随作用时间的延长和浓度的上升而增加，呈明显的浓度-时间依赖性。
2.2 不同浓度全反式维甲酸作用于HEC-1-B细胞2d后RT-PCR检测Skp2mRNA表达的变化，其电泳结果如图1所示：
如图1所示：
（1. marker 2.对照组3. 10-8mol/L 4. 10-7mol/L 5. 10-6mol/L 6.10-5mol/L）
结果显示：随着全反式维甲酸浓度增加，Skp2mRNA表达逐渐减少，差别有显著性意义，P<0.001。
3 讨论
子宫内膜癌是目前严重危害妇女健康的一类疾病，目前认为是由于细胞周期调控异常所致。近年来国内外学者关于Skp2作了大量研究，：Huang[3]等人用免疫组化法检测70例粘液纤维肉瘤，发现Skp2高表达者预后差。
目前研究发现，Skp2在子宫内膜癌中表达有不同程度的增高，且与肿瘤的分化程度、恶性进程及预后密切相关。Lahav-Baratz等[4]对正常子宫内膜（包括分泌期和增生期）和子宫内膜癌组织及细胞检测Skp2、p27表达，发现子宫内膜癌Skp2阳性率为（25.75±7.26）％，明显高于正常子宫内膜（16.9±7.3）％。Kamata等[5]用免疫组化法检测20例正常子宫内膜、20例过度增生子宫内膜，136例子宫内膜样腺癌标本中的Skp2染色，发现子宫内膜腺癌中Skp2表达明显高于前两者，而过度增生子宫内膜与正常子宫内膜相比Skp2表达亦增加。
随着全反式维甲酸在血液疾病分化诱导治疗的成功，有关其对实体瘤作用的实验相继开展。全反式维甲酸是维生素A的衍生物，它在胚胎形成中起着重要作用，同时有潜在调节细胞基质形成、生长和分化的能力[6]。本课题将全反式维甲酸作用于子宫内膜癌细胞株HEC-1-B，发现其呈浓度-时间依赖性地抑制细胞增殖，同时发现随着药物浓度增加，S期激酶相关蛋白在mRNA逐渐减少，因此，考虑全反式维甲酸是通过下调S期激酶相关蛋白基因表达，使其不能发挥底物识别亚基功能，使泛素依赖性蛋白水解途径受抑制，这样许多细胞周期调控因子如p21、p27、p53不能被水解，从而使癌细胞滞留于某细胞周期。但全反式维甲酸是否还通过其他机制抑制癌细胞增殖，全反式维甲酸在临床上如何应用，尚需深入研究探讨。本实验可为全反式维甲酸对子宫内膜癌作用的进一步研究及应用于临床提供实验依据。
参考文献
[1].Jemal A,Siegel R Xu J,et al.Cancer statistics.CA Cancer J Clin,2010, 60:277-300.
[2].Theodosion M,Landet V,Schubert,M,From carnat to clinic:an overview of the retinoic acid signaling pathway [J].Cell Mol Life Sci,2010, 67(9):1423-1445.
[3].Huang HY,Kang HY,Li CF,et al.overexpression is highly representstive of intrinsic biological aggressiveness and independently associated with poor prugoosis in primary localized myxofibrosarcomas[J].Clin Cancer Res,2006, 12(2):487-498.
[4].Lahav-Baratz S,Ben-Izhak O,Sabo E,et al.Decreased level of the cell cycle regulator p27 and increased level of its ubiquitin ligase Skp2 in endometrial carcinoma but not in normal secretory or in hyperstimulated endometrium.Mol Hum Reprod,2004,10(8):567-572.
[5].Kamata Y,Watanabe J,Nishimura Y,et al.High expression of Skp2 correlates with poor prognosis in endometrial endometrioid adenocarcinoma. [J].Cancer Res Clin Oncol,2005, 131(9):591-596.
[6].Mattinzoli D,Messa P,Corbelli A,et al.A novel model of in vitro osteocytogenesis induced by retinoic acid treatment [J].Eur Cell Mater,2012,17(24):403-425.
论文作者:邓勇,吴冬梅
论文发表刊物:《医药前沿》2014年第2期供稿
论文发表时间:2014-4-4
标签：反式论文; 甲酸论文; 子宫内膜论文; 细胞论文; 浓度论文; 激酶论文; 癌细胞论文; 《医药前沿》2014年第2期供稿论文;