孙飞[1]2001年在《CD_34～+细胞选择的临床前研究》文中研究表明自体或异基因移植是目前治疗白血病及部分其他恶性肿瘤、遗传性疾病的一种有效方法。自身移植时，可因移植物中残留的肿瘤细胞回输而复发；异基因移植财，可因供体移植物中的T淋巴细胞而致移植物抗宿主病（GVHD）。 移植后植活成功与否取决于移植物中的“种子细胞”——HSPC的数量与质量，后者的表面带有重要的分化标志：CD34抗原。CD34+HSPC存在于多种造血组织中，但其所占有核细胞（NC）的比例很低。国外研究表明，利用CD34抗原这一标志。通过适当的方法可以达到富集CD34+HSPC，净化CD34-肿瘤细胞和T淋巴细胞，从而可减少复发或GVHD的目的。 富集CD34+细胞的方法主要有阴性选择和阳性选择。阴性选择是指采用适当的方法去除移植物中CD34-细胞，富集CD34+细胞的过程，方法包括密度梯度离心、吞噬磁珠、尼龙毛吸附、大豆凝聚素或免疫磁珠法等。阳性选择是利用抗CD34单克隆抗体（单抗）与某些介质连接，并通过物理或生物的方法将CD34+HSPC从移植物中特异性地分选出来，从而达到纯化CD34+细胞、降低肿瘤细胞和T淋巴细胞残留的目的，主要方法有亲和柱法、免疫磁珠法等，这些方均可以有效地富集CD34+细胞，并净化肿瘤细胞和T淋巴细胞。一般来说，阳性选择获得的CD34+细胞纯度远高于阴性选择。目前可以用于临床量标本处理的磁珠直径有4.5μm和50nm两种。使用4.5μm磁珠时，与细胞结合的磁珠必须去除才能被输入体内。使用50nm磁珠时，与细胞结合的磁珠不必被去除，可直接输入体内。但后者的价格远高于前者，限制了它们在国内临床移植工作中的普遍应用。 羰基铁粉（carbony1 iron，CI）是一种高度纯化的五阶羰基铁微粒（Fe[CO]_5），直径≤5μm，可高温消毒，价格便宜，对人体毒性极小。以往主要用于去除血或骨髓（BM）标本中的单核/巨噬细胞后从事基础实验研究。国内外尚未见将其用于富集CD34＋细胞的报道aNimgaonkar等曾用CD15兔疫磁珠清除了AML患者BM或PBSC中 7个对数级的白血病细胞和 1－4个对数级的CD15＋细胞，不仅净化了白血病细胞，而且富集了CD34＋细胞。但国内未见用CD15富集CD34＋细胞的报道。本研究试图采用CI或CD15 IMB和高能量磁铁作阴性选择，以去除BM、外周血干／祖细胞（PBS）中的CD34－吞噬细胞或单核细胞，富集CD34＋细胞和降低移植物作进一步CD34阳性选择前的起始细胞数量，为临床推广使用 50urn磁珠进行 CD34阳性细胞选择，纯化造血干／祖细胞降低成本提供实验依据。 以免疫磁珠法进行CD34阳性选择虽可净化自身移植物中的CD34的肿瘤细 胞或去除异基因移植物中的T淋巴细胞，但由于缺乏一种精确的评价方法，使移植物移植后病人是否会出现原发肿瘤复发和 GVHD发生的危险性难于预测。如能在体外事先精确评价将被采用的净化方法的有效性，则可大大减少人力与物力。 准确评价净化的效果有赖于敏感、可靠的评价方法。通常采用免疫染色或PCR的方法对净化效果进行评价，但这些方法在测得残留肿瘤细胞量与实际残留肿瘤细胞量之间存在着较大的差异，因此难以准确评价净化方法的有效性和安全性。Paulus等曾采用Hoescht33342（H342）标记淋巴瘤细胞种入PBSC建立移植物细胞模型，采用紫外光激发产生荧光的方法，以荧光显微镜分析CD34 阳性选择后残留肿瘤细胞的净化效果，使实验结果直观。准确。然而，用H342染料标记肿瘤细胞需用紫外光激发才能观察，由于大多数流式细胞仪（FCM）通 常不装备紫外激光光源，且H342染料容易漏出细胞外，给精确评价带来不便。 Calcein叭M是一种荧光染料，它很容易穿透细胞膜进入细胞 内，在酯酶的催 化下，能转化成带有荧光的衍生物滞留于活细胞内。在常用氖激光源蓝色激发 光（波长488urn）的激发下，能产生绿色荧光，并很容易用FCM观察和分析。国 内外未见用该染料建立移植物细胞模型用于评价体外净化的报道。本研究采用 Calcein叭M染料标记肿瘤细胞种入背景细胞中建立儿个移植物细 胞模型，以 FCM精确评价CD34阳性选择后肿瘤细胞清除效率和 CD34＋细胞的 富集效果， 并为寻找更有效的体外净化方法或肿瘤杀伤疗法提供体外实验依据。 2 第一部分 阴性选择 材料与方法1．标本：取肝素钠抗凝 BM 9份，常规分离获得单个核细胞（MNC）；另驭冻存 的 PBSC 9份，解冻后分离除去死细胞。2．方怯：分别以碳基铁粉（CI）、CD15免疫磁珠（IMB）或两者联合选择的方法 作阴性选择以富集 CD34＋细胞。以流式细胞仪（FCM）检测 CD34＋细胞含量， 计算并比较选择前及叁种方法选择后的CD34＋细胞含量、富集倍数、总细胞 回收率和 CD34＋细胞回收率。 结 果1．用CI 对BM 或PBSC 进行阴性选择，选择后CD34＋细胞含量分别为 （3．52士1．75）0／5。34士3．54）％，均比选择前（1．88士1，12）％、（3．49士2．48
杜维霞[2]2018年在《人源化小鼠模型的建立及用该模型进行基因治疗研究的初步探索和白介素-35对诊断早发型新生儿脓毒血症的临床意义》文中进行了进一步梳理第一部分人源化小鼠模型的建立及用该模型进行基因治疗研究的初步探索背景:人源化小鼠模型广泛用于人体生理病理机制研究、药物临床疗效的评估。经过近叁十年的发展,人源化小鼠模型日益成熟。IL2rg和prkdc/rag基因突变的新型免疫缺陷老鼠缺乏T、B、NK细胞,是目前应用最多的人源化小鼠模型。基因治疗是原发性免疫缺陷病患儿无条件进行移植时的首选治疗,其临床应用前需要在体外和和人源化小鼠体内进行安全性和有效性的临床前评估。方法:收集幼年特发性关节炎患儿废弃骨髓标本,磁珠分选CD34+细胞。辐照8-9周龄NOD-Prkdc~(scid) Il2rg~(null)(NPG)雌性小鼠,4小时后通过尾静脉移植入1-5×10~5个CD34+细胞进行人免疫系统重建。移植后4周开始尾静脉取血流式细胞术检测人CD45细胞植入情况,移植后12-14周处死小鼠,流式细胞术分析各免疫器官细胞亚群,组织切片观察脾脏、胸腺形态。利用GFP慢病毒转染CD34+细胞,完成转染后流式细胞术分析转染效率,集落形成试验,移植入NPG小鼠体内观察细胞分化。结果:磁珠分选CD34+细胞纯度均在90%以上;移植NPG老鼠4周后即可在外周发现人CD45+细胞的植入,占外周血白细胞的2.81%±2.27%(n=9),移植后6周外周血人CD45+嵌合率明显上升,之后一直维持在恒定水平。移植后12周,骨髓(43.57%±16.52%,n=6)和胸腺(98.12%±1.75%,n=6)较高人CD45+细胞植入。外周血、脾脏、骨髓均以CD19+B细胞为主,多为IgD+CD27-幼稚B细胞,CD24~(int/hi)CD38~(hi)未成熟B细胞在脾脏大量累积,多数B细胞表现为CD10+未成熟的表型,进一步分析在脾脏检测到CD19+IgM-CD20-CD34+原B、CD19+IgM-CD20-CD34-前B细胞和CD19-CD10+CD38+CD34+共同淋巴样祖细胞。在小鼠的胸腺中检测到人CD4+和CD8+T细胞亚群,胸腺细胞TREC值4560±2907(n=3)。移植后12-14周取外周血血浆人Ig M浓度为932.9±596ng/m L(n=9),IgG未测出。分选后的CD34+细胞进行GFP慢病毒转染,GFP基因标记的CD34+细胞达到30%,载体拷贝数0.55。转染后每1000个细胞形成集落63个,与未转染组相当。转染后细胞移植入NPG小鼠体内发育为各个谱系细胞。结论:使用骨髓来源CD34+细胞可在NPG小鼠体内重建人免疫系统,但重建后的B细胞部分分化,功能不完善,T细胞在胸腺滞留难以迁至外周。GFP转染的干细胞效率达到基因治疗要求,集落形成能力未受损,体内分化能力未受损。第二部分白介素-35对诊断早发型新生儿脓毒血症的临床意义背景:早发型新生儿脓毒血症(Early Onset Sepsis,EOS)是新生儿时期常见疾病,是新生儿死亡的重要原因之一,但是因临床表现不特异,传统感染性标志物诊断价值有限导致诊断困难。本研究评估了新型细胞因子白介素-35对EOS的预测价值。方法:本前瞻性研究纳入157例生后叁天疑诊EOS的患儿,根据围产期危险因素、临床表现和实验室检查分为感染组和低感染可能组。ELISA检测患儿血浆IL-35,记录CRP,PCT,WBC计数,血培养结果,随访临床表现和治疗。统计分析各感染标志物对EOS的预测价值。结果:两组比较发现感染组血清IL-35浓度显着增加(36.4和27.1pg/m L,p<0.001)。各感染标志物ROC曲线下面积为IL-35为0.756,调整年龄后PCT为0.713,CRP为0.670,WBC为0.619。IL-35诊断截点为31.7pg/m L,诊断敏感性和特异性分别为78.48%和66.67%。此外,IL-35与PCT浓度不同,在低感染可能组的新生儿IL-35浓度不随时间波动(p=0.885)。结论:IL-35的诊断性能优于PCT和其他常用标志物,提示IL-35可能是EOS诊断的有价值工具。
徐磊[3]2017年在《建立CRISPR敲除造血干细胞CCR5基因治疗艾滋病新策略》文中研究表明艾滋病是全球性的公共卫生问题和社会问题。目前的主要治疗手段是抗逆转录病毒治疗,这种手段能够有效地控制艾滋病,但不能彻底清除潜伏状态的HIV病毒,并伴有严重的耐药性问题。因此,科学家们不得不寻找新的抗艾策略。2007年,德国医疗小组将CCR5(C-C chemokine receptor type 5)基因缺陷的造血干细胞移植给一名患有白血病的艾滋病患者,经过长达7年的观察与检测未发现HIV病毒及相关症状。这一案例提示我们CCR5可能是艾滋病治疗的理想靶点。另外,由于造血干细胞(Hematopoietic stem cell,HSC)移植在临床上得到成熟的应用,可以治疗多种造血统肿瘤及免疫相关疾病,这一技术为基因治疗提供了优秀的平台。因此,本研究拟建立基于造血干细胞CCR5基因敲除的技术平台,并结合造血干细胞移植建立功能性治愈艾滋病的新策略。为完成功能性治愈艾滋病的临床前研究,本文将针对多方面的内容进行深入探索。本课题将建立高效特异的CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)技术平台,对HSC上的HIV辅助受体基因CCR5进行特异性敲除,并利用人源化免疫系统小鼠HIV感染模型初步探索该策略的安全性和有效性。CRISPR系统由两部分组成:介导识别的sgRNA(single guide RNA)和负责切割的Cas9蛋白。CRIPSR具有切割效率高和操作简便的特点,本文需要针对每个位点设计gRNA即可,Cas9蛋白则是通用的。首先在细胞系中筛选出具有高效切割能力、靶向CCR5基因的CRISPR/sgRNA;然后利用免疫缺陷小鼠模型验证该基因编辑体系的安全性和有效性;通过HIV攻毒实验该策略对HIV病毒感染的抵御能力;最后,针对临床前研究的需求从多方面检测该基因编辑体系的常规安全性。本文将得到经过安全性验证的、具有抵抗HIV感染能力的CCR5基因靶向的CRISPR基因修饰体系,为该疗法进入临床研究和应用打下了坚实的基础。本课题将以CCR5为靶点,联合CRISPR/Cas9技术和造血干细胞移植治疗方案,建立功能性治愈艾滋病的新策略,以期建立一种更为安全和有效的艾滋病治疗技术。首先,本文中设计和构建多个靶向CCR5基因的gRNA表达载体,建立高度纯化、无内毒素Cas9和gRNA载体,建立导入细胞的技术方法以及靶基因诱变效率检测系统。其次,优化人造血干/祖细胞(Hematopoietic Stem/Progenitor Cells,HSPCs)的分离纯化方案。另外,建立造血干细胞基因敲除及效率检测平台。然后,基于免疫缺陷小鼠优化人源化动物模型,建立具有高度造血系统人源化的小鼠模型以及HIV病毒感染与检测技术体系。接下来,筛选出诱变效率高、特异性好、可赋予细胞HIV-1抗性的CCR5靶向CRISPR。最后,在CCR5诱变造血干细胞移植小鼠模型上检测评估对HIV-1感染的抵抗作用,检测病毒载量、CD4+T细胞计数与对照组的差异,并观察小鼠体内CCR5突变细胞的选择富集效应。本文针对人CCR5基因设计了45个sgRNA。将CRISPR/Cas9体系所需质粒采用核转染的方法转染到K562细胞中,经过2–3天的培养后提取基因组并PCR扩增CCR5基因上的对应修饰片段,用T7E1酶切和测序的方法检测该基因的切割效率。经检测,CRISPR切割效率可以达到50%左右。选取最优的CRISPR进行后续的造血干细胞转染实验。通过对现有CRISPER系统进行优化,将两个gRNA导向Cas9对靶序列进行双链切割,从而提高靶序列的敲除效率。在同一批次的CD34+细胞中,优化后的体系对CCR5序列的切割效率可高达32%。本文开展了CCR5基因修饰后的人HSPCs的初步安全性评价。(1)通过软琼脂培养法检测经过基因编辑处理的细胞是否具有类似于肿瘤细胞和转化细胞系的生长能力,结果表明修饰后的细胞与正常细胞相似,在软琼脂悬浮状态下不能扩增生长。通过与对照组进行比较,癌细胞增殖明显,而CCR5基因修饰的CD34+细胞并未出现增殖迹象,证明其不具有体外致瘤性。(2)在裸鼠体内成瘤性评价实验中未检测到淋巴瘤及其症状。(3)通过染色体核型检测,实验组CCR5基因修饰的CD34+细胞并未检测出核型异常。(4)通过豚鼠过敏试验,实验组CCR5基因修饰的CD34+细胞在动物体内输注并未出现过敏症状,对照组输注BSA的动物体内均出现明显的过敏症症状。CCR5基因修饰后的CD34+细胞能够在免疫缺陷小鼠中重建人的造血细胞并在其中检测到CCR5敲除。修饰后的CD34+HSPCs移植到免疫缺陷小鼠体内,8周后开始检测移植小鼠的外周血中CD45+细胞占淋巴细胞的比例,分别进行8周,10周,12周及16周的定期检测。人的CD45细胞长期平均重建效率达40%,最高达90%。同时本文在移植后12周的小鼠外周血检测到32.2%的CCR5敲除比例。为了进一步评价CCR5的缺失在具有长期重建能力的HSC中的比例,本文针对移植后30–47周的小鼠和二次移植的小鼠进行外周血取样,分别检测到31.2%和24.7%。另外,本文成功的实现了CCR5嗜性的BaL-1毒株在人源化小鼠的长期、有效的感染。病毒感染的小鼠的病毒载量达到预期水平,且保持长期稳定。为了检测该策略在体内的抗病毒效果,本文对移植修饰后的CD34+细胞12周左右的小鼠进行Bal-1病毒感染,在感染后2、4、6、8周检测病毒载量变化。与对照组相比,实验组小鼠病毒载量在第8周明显下降。同时,攻毒前后CD4+T细胞明显富集,CCR5敲除比例明显升高。总之,本文在体外和体内水平实现了高效的CCR5基因敲除。本文通过在人CD34+细胞中实现CCR5基因高效、特异性敲除。其次,本文将体外修饰的CD34+细胞移植到小鼠体内,能够高效重建出人的造血系统,证明体外修饰策略不会影响到造血干细胞的重建能力。另外,在免疫缺陷小鼠体内重建的人的外周血单核细胞中检测到CCR5基因敲除,实现了在体内评价体系中敲除CCR5基因的目的。此外,本文在体内、体外水平完成了常规性安全实验,初步探索了本策略的安全性。在进行临床试验之前,本文对该治疗策略的安全性方面做初步的评估,提示我们利用CRISPR技术在CD34+细胞上实现CCR5基因敲除是一种安全的基因修饰方案。人源化小鼠攻毒实验结果显示,在小鼠感染R5噬性HIV-1病毒第8周对照组小鼠病毒载量处于较高水平,而CCR5基因修饰的实验组小鼠病毒载量明显下降。该实验结果表明利用CRISPR修饰造血干细胞CCR5基因重建的人源化小鼠具有抵御HIV-1病毒感染的能力。因此,本研究表明基于CCR5基因敲除治疗艾滋病的新策略能够在体内安全、有效的控制HIV病毒的载量,具有转化到临床研究的重要价值。
胡泽斌, 王立生, 崔春萍, 陈津, 吴祖泽[4]2013年在《干细胞临床应用安全性评估报告》文中指出目的通过对现阶段干细胞治疗技术的安全状况进行系统评价,为各层次决策者包括卫生行政部门和患者等提供合理选择干细胞治疗技术的科学信息和决策依据。方法采用卫生技术评估方法对造血干细胞、间充质干细胞、胚胎干细胞、神经干细胞、脂肪干细胞和诱导多能干细胞在临床研究和应用中的死亡率,伤残率,不良反应的发生率、持续时间以及严重程度等方面进行系统评估。结果造血干细胞移植最常用于治疗血液系统的恶性肿瘤,这一类别研究报告的不良反应较多,多数与合并使用的放化疗和移植前的预处理有关;异体造血干细胞移植易出现急慢性移植物抗宿主病(GVHD),严重影响患者的预后。自体造血干细胞移植还常用于肿瘤或自身免疫性疾病放化疗后的支持,此时虽然仍会出现一些放化疗的不良反应,但不会出现GVHD。自体造血干细胞移植尝试治疗一些肝脏和缺血性疾病等,不良反应报道相对较少。②无论是自体还是异体来源的间充质干细胞移植,在临床试验中未见明显的毒性反应和致瘤性报道,无GVHD报告。临床上见到的不良反应多数较轻微,短暂发热和注射部位局部疼痛偶有报道,有些不良反应与注射途径和部位有关。③胚胎干细胞移植的动物实验均表明有畸胎瘤的形成,尚未有关于直接用胚胎干细胞进行临床研究的报道。④神经干细胞移植多见于治疗神经系统疾病,未发现严重不良反应,无致瘤性报道。⑤脂肪干细胞移植治疗肛周瘘,未发现严重不良反应,无致瘤性报道。⑥诱导多能干细胞研究目前多数仍为方法的研究,无临床文献报道。动物实验表明诱导多能干细胞移植后其后代会发生肿瘤,同时诱导过程中反转录病毒的使用对安全性的影响仍需研究。结论造血干细胞移植开展最早、研究最为深入和广泛,间充质干细胞是继造血干细胞之后临床应用研究最多的一类干细胞,神经干细胞和脂肪干细胞目前也进入临床试验阶段,胚胎干细胞和诱导多能干细胞因其致瘤性等安全问题,目前还在临床前研究阶段,临床试验报到很少。从目前文献看,自体造血干细胞、间充质干细胞、神经干细胞、脂肪干细胞等成体干细胞移植,相对来说比较安全。由于目前多数干细胞的临床研究尚处于试验阶段,病例数不多,特别是干细胞不似普通药品或生物制品,各项研究采用的制备方法、质量控制不尽相同,一项研究的数据不一定能全面反应所有同类干细胞的安全性,因此,干细胞的安全性需要随着干细胞的研究进展不断加以总结和完善。
李铁山[5]2017年在《骨髓间充质干细胞对制动大鼠骨骼肌细胞凋亡及肌卫星细胞增殖的影响》文中提出研究背景骨骼肌约占人体重量的40%左右,健康的肌肉状态不仅是运动的必要条件,也是人们提高生活质量的保障。运动负荷可以维持肌肉处于良好状态,而制动会导致运动负荷丧失或减少,从而引起肌肉生理、生化及生物力学等的改变。受制动影响最大的肌肉包括比目鱼肌、腓肠肌、股外侧肌等。制动引起的废用性肌萎缩表现为肌纤维体积减少、肌重量降低、肌细胞大量凋亡、肌纤维缩短。这样的萎缩多发生于骨或中枢神经系统损伤、慢性病,或其他神经系统疾病以后等。PI3K/Akt/mTOR通路是蛋白质合成的关键通路,制动后肌肉状态的恢复取决于与蛋白质合成相关的代谢改变是否维持在正氮平衡状态。Akt的磷酸化能促进肌肉肥大而抑制肌肉萎缩。同时,研究发现抑制肌细胞的凋亡能有效减缓制动引起的肌萎缩及纤维化过程。抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax是B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)家族的重要成员,作用分别为抑制细胞凋亡和促进细胞凋亡,它们被认为是细胞凋亡的核心调控因子。研究发现,骨骼肌萎缩后大量肌细胞凋亡并伴随着凋亡易感基因Bcl-2和Bax表达的变化,结果显示Bcl-2和Bax蛋白参与了肌萎缩的全过程。肌纤维细胞属于成肌分化的最后产物,而一旦肌纤维损伤,机体的自我修复过程需要少量位于肌膜和肌纤维基底膜之间的肌卫星细胞参与。肌纤维损伤后,卫星细胞被激活,分裂增生后形成新的肌纤维或修复现有的纤维。长期制动能引起肌肉的废用性萎缩,肌卫星细胞在此过程中相应减少,这可能是与肌卫星细胞增殖过程被破坏有关。此前普遍认为肌肉损伤或萎缩后,肌卫星细胞是最佳的移植细胞。可是,研究发现机体内肌卫星细胞对肌纤维的修复或重建的影响极其有限。首先,肌卫星细胞随着年龄的增长逐渐减少,它的修复潜能是有限的。严重的肌营养不良,长期的修复过程耗尽了肌卫星细胞,在此过程中肌纤维逐渐被结缔组织所替代。其次,肌卫星细胞移植后会出现迁移受限及凋亡问题,这极大限制了肌肉修复及重建的有效性。另外,研究发现体外培养、增殖肌卫星细胞会导致其重建肌肉能力的丧失。骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,MSCs)具有多向分化潜能,能促进骨、软骨、肌肉、韧带、肌腱、脂肪等间充质组织的再生。MSCs具有易获得、易培养、分化、增殖等优点,越来越受再生医学的青睐。有文献报道,在心脏毒素所导致的肌损伤模型中,MSCs能保护肌卫星细胞的功能。同时大鼠骨骼肌缺血性损伤模型也证实MSCs能有效减少受损肌细胞的进一步凋亡,但MSCs对制动所引起的废用性肌萎缩中肌卫星细胞增殖和肌细胞凋亡影响的研究还未见报道,仍需要深入研究。研究目的(1)明确MSCs对制动大鼠骨骼肌中肌卫星细胞增殖的影响,(2)明确MSCs对制动大鼠骨骼肌细胞凋亡的影响。(3)明确MSCs对大鼠制动后骨骼肌中Akt磷酸化水平的影响研究方法l.MSCs的原代分离培养及纯化选取5只6～8周幼龄大鼠麻醉后,无菌条件下取出股骨和胫骨剪掉股骨和胫骨的骨骺端,露出骨髓腔,用添加100u/mL青、链霉素的α-DMEM培养基冲出骨髓,反复吹打将冲出的骨髓制成单细胞悬液,离心弃上清,接种于培养瓶中。2天后进行首次换液,清除非贴壁细胞,以后每3天全量更换新鲜培养基。1:3的比例进行传代培养。实验选取3-5代MSCs使用。2.MSCs鉴定通过流式细胞仪检测细胞表面标记,鉴定所取细胞。具体过程如下:细胞传至4代时,选取生长状态良好细胞,0.25%胰酶消化,4℃离心,1200 r/min,5min,用PBS清洗细胞3次,各管依次加入单克隆抗体CD34、CD44、CD45、CD90。同时每管样品设立未加抗体的阴性对照。避光冰上孵30min,用PBS洗涤细胞3次,以除去未结合抗体,用500 μLPBS重悬细胞,通过流式细胞仪进行检测分析。3.慢病毒转染自身失活慢病毒表达增强型绿色荧光蛋白(GFP)基因的β控制下的巨细胞病毒(CMV)肌动蛋白/β 珠蛋白基因内含子的杂合启动子(LV-GFP)应用(19)。MSCs以5× 104个/孔的密度接种在六孔板上,在37℃的环境下培养24h,感染复数(MOI)为50。后除去含病毒的培养基,将MSCs培养在标准培养基上48小时。含GFP标记的MSCs通过流式细胞仪分选。4.动物实验分组及模型制备根据随机数字分组法将48只大鼠分成WB(weight bearig)组,IM-MSCs(immobilized and MSCs received)组,IM-PBS(immobilized and PBS received)组。IM-MSCs和IM-PBS组大鼠右F肢采用石膏固定法制动14天,WB组未制动,下肢捆绑同重量石膏,但未限制关节活动,1M天后各组大鼠解除右后肢石膏固定,取标本分析。模型制备过程如下:大鼠行8%水合氯醛腹腔内注射麻醉后,在其右侧后肢的踝关节及腹股沟等血管容易受压处衬一层薄厚适宜的棉垫,为保证负重等量可塑性石膏,将石膏绷带裁剪成1.5cm宽,20-25cm长,固定大鼠右下肢:足趾屈120°,膝关节伸直[10],使比且鱼肌处于缩短位。5.骨髓间充质干细胞移植造模成功后24小时,IM-MSCs组及IM-PBS组所有大鼠麻醉后去除可塑性石膏。IM-MSCs组大鼠比目鱼肌局部多点注射LV-GFP-MSCs;WB组和IM-PBS组大鼠比目鱼肌注射等量PBS。具体操作过程如下:消化已经准备好的4代骨髓间充质干细胞,并计数,将每1×106个骨髓间充质干细胞重悬于50 ul无菌生理盐水中,IM-MSCs组大鼠右侧比目鱼肌肌腹多点注射50 ul间充质干细胞悬液,WB组和IM-PBS组大鼠于相同位置注入等体积的PBS。注射完成后再次可塑性石膏制动,2周后去除可塑性石膏,取材分析。6.肌肉组织学及肌肉力量检测各组大鼠固定14天,8%水合氯醛行腹腔内注射麻醉后,仔细解剖出比目鱼肌,用不可吸收的手术线将两端绑牢。将肌肉放入22℃-24℃的林格氏液中,使肌肉处于松弛状态,一端以手术线固定在实验架上,并将电极深埋在结扎附着点附近,另外一端以手术线为牵引,连接于肌肉张力换能器的传感器上,并连接计算机。调节强直刺激电流强度100Hz,时间400ms,采集数据并分析。其余肌肉组织用常规甲醛固定后经过夜脱水,横向切成约3 um厚的组织切片。切片行HE染色切片后在光学显微镜下进行评估,并用数码相机拍摄的照片。7.Bromodeoxyuridine(Brdu)的标记与测量24h后各组大鼠连续腹腔注射BrdU(0.8 mg/ml)3天,14d后取比目鱼肌分析。样品洗净后切片,与小鼠抗BrdU单克隆抗体孵育(1:200,sigma,美国)和Pax7抗体(1:200,Abcam)4℃过夜。随后孵育 Alexa 594 山羊抗小鼠 IgG(1:500,Abcam)和Alexa 488羊抗兔IgG(1:500、Abcam)二抗。滴适量DAPI于标本上用于染核,放置lmin。被FITC标记的小鼠抗BrdU单克隆抗体显示绿色荧光,而Pax7抗体显示红光。后放置在荧光显微镜下数取Pax7/BrdU阳性细胞的数量。技术方法:通过Image-pro plus 5.0软件及其配套的系统完成图像采集及计数,每组大鼠取25张切片计数,从而得出Pax7/BrdU阳性细胞平均数量。8..脱氧核苷末端转移酶介导的缺口末端标记(TUNEL)法检测肌细胞凋亡肌细胞的凋亡采用TUNEL法检测,试剂盒来自美国Roche公司,实验步骤遵循说明书:肌肉组织切成6微米厚度的切片(已被多聚赖氨酸处理)20分钟,后在TUNEL反应混合物中避光孵育60分钟,温度37℃。DAPI染核,在显微镜下观察观察阳性细胞数,Image J软件分析。9.蛋白质印迹(Western Blotting,WB)肌肉匀浆混合在溶解缓冲液和蛋白酶抑制剂中,煮沸,经SDS-PAGE电泳,转至 PVDF 膜上,5%奶粉封闭,Phospho-AktSer473(1:1,000,#9271,Cell Signaling Technology,Danvers,MA,USA),Akt(1:1,000,#9272 Cell Signaling Technology),Bcl-2(1:1,000,G9545,Sigma-Aldrich),Bax(1:1,000,B3428,Sigma-Aldrich)等一抗4℃孵育过夜,相对应的二抗孵育,生物成像系统成像,条带通过Image J软件分析。10.统计分析数据采用GraphPadPrism软件分析处理。实验结果以x±s表示。采用t检验和单因素方差分析(ANOVA)进行统计学比较。所有数据均以均数±标准差表示。统检验水准α=0.05,P<0.05为差异有显着性意义,P<0.01为差异有非常显着性意义。研究结果1.MSCs培养、扩增和鉴定原代培养24 h后有少量细胞贴壁,漂浮细胞较多,大多为血细胞。2d后首次换液,可见散在的贴壁细胞,呈短梭形、椭圆形、叁角形等。以后每隔3 d换液。3～7d后贴壁细胞增多,逐渐伸展呈多角形、长梭形。随着培养、换液的进行,血细胞等非贴壁细胞基本去除,细胞形成集落单位。7～12 d细胞铺满瓶底80%～90%。以1:3传代,以后5～6 d传代1次。流式细胞仪检测第4代BMSCs表面标记,CD44,CD90表达阳性,CD34,CD45表达近乎阴性,CD44和CD90的阳性率分别为93.83%,96.88%;而 CD34 和 CD45 的阳性率分别为 6.32%,8.32%。2.肌肉湿重、肌横截面积、最大肌收缩力结果14d后各组大鼠体重比较,无明显统计学意义。大鼠麻醉后获取比目鱼肌标本,比较肌肉湿重、肌横截面积、最大肌收缩力等指标。与WB组比较,IM-MSCs组,IM-PBS组比目鱼肌横截面积、最大肌收缩力、湿重、肌湿重/体重数值明显降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。但IM-MSCs、IM-PBS组间比较,差异无明显的统计学意义(P<0.05)。3.MSCs促进肌卫星细胞增殖Pax7通常作为肌卫星细胞的特异性标志物,而BrdU标记法可以显示新生增殖细胞。我们通过荧光染色双标Pax7阳性细胞核及BrdU阳性细胞,测定肌卫星细胞的增殖情况。结果显示大鼠下肢制动14d后,与WB组比较,IM-PBS组中Pax7+、Pax7+/BrdU+细胞下降明显,而IM-MSCs组中Pax7+、Pax7+/BrdU+细胞明显增高,差异有统计学意义(P<0.05)。为有效的比较各组肌卫星细胞的增殖情况,我们还比较了 Pax7+/BrdU+双阳性细胞占Pax7+阳性细胞比值。与IM-PBS组比较,WB组、IM-MSCs组中Pax7+/BrdU+双阳性细胞占Pax7+细胞比率明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)。表明MSCs不仅阻止了肌卫星细胞数量的下降,也引起明显的卫星细胞增殖。4.MSCs抑制肌细胞凋亡TUNEL检测法又称DNA断裂的原位末端标记法,是一种常用的检测细胞凋亡的方法。实验中,绿色荧光代表断裂或凋亡的DNA,蓝色荧光代表细胞核,我们每组标本随机选取1000个肌细胞,计算其中荧光双标染色数目。与WB组比较,IM-PBS组、IM-MSCs组荧光双标染色数目明显增加,显示肌细胞凋亡数量明显增加,差异有统计学意义(P<0.05)。而IM-PBS组、IM-MSCs组相比较,IM-MSCs组荧光双标染色数目明显少于PBS组,差异有统计学意义(P<0.05)。5.MSCs提高Akt磷酸化水平,调控了 Bax、Bcl-2蛋白表达抗凋亡蛋白Bcl-2的表达:与WB组比较,IM-MSCs组和IM-PBS组比目鱼肌中Bcl-2蛋白表达量明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。与IM-PBS组比较,IM-MSCs组比目鱼肌中Bcl-2蛋白表达量显着增高,差异有明显统计学意义(P<0.05)。凋亡蛋白Bax的表达:与WB组比较,IM-MSCs组和IM-PBS组比目鱼肌中Bax蛋白表达量明显升高,差异有统计学意义(P<0.05),与IM-PBS组比较,IM-MSCs组中Bax蛋白的表达明显降低,差异有明显统计学意义(P<0.05)。p-Akt/t-Akt比值结果:与WB组比较,IM-MSCs组和IM-PBS组比目鱼肌中蛋白p-Akt/t-Akt比值明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。与IM-PBS组比较,IM-MSCs组比目鱼肌中p-Akt/t-Akt比值显着增高,差异有明显统计学意义(P<0.05)。结论在制动所导致废用性肌萎缩模型中,局部注射骨髓间充质干细胞可促进肌卫星细胞的增殖,抑制肌细胞凋亡。
付卫江[6]2016年在《恩度对Lewis肺癌成熟和未成熟血管作用差异及超声造影血流动力学评价》文中研究说明第—部分恩度对Lewis肺癌中成熟和未成熟血管的作用差异研究背景及意义新生血管形成是多步骤、多途径的复杂现象,可见于多种生理及病理状态,尤其是恶性肿瘤的发生、发展及转移中起着重要的作用。恶性肿瘤的新生血管形成与生理状态下的区别在于肿瘤中促新生血管生成及抗新生血管生成的因子之间的平衡被打破了。所以与正常组织中大部分新生血管最终成为成熟血管不同,恶性肿瘤中既有成熟的新生血管,也有不成熟的新生血管。而且肿瘤内不同分化程度的血管所占比例的差异与肿瘤的恶性程度有相关性。血管成熟是指在血管形成的后期,血管通过内皮细胞与血管周围细胞间的相互作用完成血管“重塑”的过程,包括部分微血管的退化,微血管周围某些细胞参与血管基底膜的构建,最终内皮细胞逐渐成熟,出现相应的表达分化,并和血管基底膜及各种周围细胞建立良好的相互关系以完善成熟血管的血流动力学特·征及弥散功能。目前研究发现肿瘤内的新生血管生成也存在血管生成后的成熟问题,多项研究证实了肿瘤内的新生血管即有成熟血管,也有未成熟血管,而且肿瘤内的成熟血管在肿瘤的血液供应中起更重要的作用。目前抗肿瘤血管生成药物致肿瘤血管正常化仍是研究的热点,抗血管生成药物致肿瘤血管正常化的观点为提高抗新生血管药物治疗的疗效展示了广阔的前景和探索的方向。但目前有关肿瘤血管正常化的机制及发展过程仍未明确。抗血管生成药物可以导致肿瘤血管正常化,是因为其治疗后肿瘤内的血管数目和结构发生了变化,可以推测其可能对肿瘤内不同分化程度的血管作用存在差异,从而导致肿瘤内血管的形态、功能趋于正常化改变。已有多项研究关注抗血管生成药物治疗后肿瘤微血管的形态学改变及药物弥散功能的变化,但抗血管生成药物对于肿瘤内的成熟血管和未成熟血管的作用差异未见报道。内皮抑素是一种具有很强的抗血管生成作用的药物,内皮抑素的衍生物恩度是我国自主研发的抗肿瘤血管生成的药物,不但解决了批量生产中的蛋白质复性,并获得了更高的生物活性及稳定性。大量的基础及临床前研究证实了其抗肿瘤血管生成作用,同时已有多项临床研究证实了恩度与化疗或放疗联合应用可以使肺癌等多种肿瘤患者获益,并有多项基础研究通过不同的方式证实恩度致肿瘤血管正常化存在。但其对不同成熟程度的肿瘤新生血管的作用差异未见报道。基于上述思路,我们设计了此项研究以观察恩度对成熟和未成熟的肿瘤血管的作用差异。研究目的本研究通过建立鼠Lewis肺癌的皮下移植瘤模型、采用不同的血管标记识别肿瘤内成熟及未成熟微血管(已有多项研究证实CD31阳性而CD34阴性代表未成熟血管,而CD31阳性且CD34阳性代表成熟血管),计算恩度治疗后肿瘤内成熟及未成熟肿瘤微血管的变化来判断恩度对不同成熟度肿瘤新生血管的作用差异,并通过双光子显微镜直观的观察恩度治疗后Lewis肺癌模型中肿瘤微血管结构形态的变化。研究方法建立40只小鼠Lewis肺癌皮下移植瘤模型,待移植瘤生长至长径约6-7mm时,随机分为4组,次日起分别经腹腔注射生理盐水钠(normal saline, NS)、低剂量恩度(5mg/kg)、中剂量恩度(25mg/kg)或高剂量恩度(50mg/kg),每天给药1次,连续给药14天。用药后每天观察两组小鼠的一般情况,并每隔一天测定小鼠肿瘤的大小。药物治疗7天后,实验小鼠尾静脉注射荧光素标记的葡聚糖(FD2000S),并于当日使用双光子显微镜观察肿瘤血管形态改变。药物治疗14天后,处死小鼠,并完整切除肿瘤,免疫组织化学检测肿瘤CD31及CD34的表达情况,并分别计数CD31及CD34标记的肿瘤血管的微血管密度(MVD)。研究结果1.药物治疗开始后,隔日测定并计算各组小鼠皮下移植肿瘤的平均体积,获得各组肿瘤生长曲线,观察到药物治疗14天后,各剂量恩度治疗组体积均明显小于对照组,尤其是高剂量恩度治疗组更加明显(低、中、高剂量恩度治疗组肿瘤体积分别为3991.51 ± 761.87mm3,2735.06±558.30mm3和1433.86±275.27mmm3,而对照组为4869.80±989.95mm3,P<0.05)。高剂量恩度治疗组的肿瘤体积也明显小与低、中剂量恩度治疗组(P<0.05)。2.药物治疗7天后,双光子显微镜观察发现与小鼠正常下肢肌肉血管比较,与对照组的血管紊乱无章不同,不同剂量恩度治疗后Lewis肺癌移植瘤显微镜下观察微血管形态更加接近于正常下肢肌肉的微血管,也即：恩度治疗后导致的肿瘤血管正常化表现；并随着恩度剂量的提高,微血管的数目依次减少。3.不同标记免疫组化染色发现：CD31免疫组化染色标记的血管明显比CD34免疫组化染色标记的血管增多提示CD31标记血管与CD34所标记血管的显着不同。4、与对照组相比,不同剂量恩度治疗14天后CD31MVD均明显减少,尤其是在高剂量恩度治疗组(低、中、高剂量恩度治疗组CD31MVD分别为61.56±6.53、52.80±5.77和39.22±6.94,与对照组68.98±7.62相比,P<0.05)。然而,与对照组相比,不同剂量恩度治疗14天后CD34MVD并未见明显减少(低、中、高剂量恩度治疗组CD34MVD分别为28.02±3.15、26.52±2.54和24.68±4.13与对照组27.54±2.98相比,P>0.05)。5、CD31+ CD34或CD31 MVD减去CD34 MVD代表未成熟的血管,而CD34+代表成熟血管。与对照组相比,不同剂量恩度治疗后,CD31 MVD减去CD34 MVD值明显下降,并且随着恩度剂量的增加,这种下降更不明显。(低、中、高剂量恩度治疗组CD31MVD-CD34MVD分别为3.54±5.97,26.28±5.33和14.54±3.61与对照组41.44±6.62相比,P<0.01)；而CD34无明显变化,提示不同剂量的恩度主要抑制了未成熟血管,而对成熟血管无显着抑制作用。研究结论1、不同剂量的恩度对Lewis肺癌移植瘤有抑制作用,而且随着药物剂量的提高,这种抑制作用逐步增强。2、CD31免疫标记及CD34免疫标记所标记的Lewis肺癌移植瘤中的微血管有很大的不同,可以据此判断肿瘤内存在的成熟血管及未成熟血管。3、不同剂量恩度治疗第7天,有肿瘤血管形态趋于正常血管的变化趋势。4、不同剂量的恩度作用14天后,主要表现为肿瘤CD31标记的微血管密度的下降,而CD34标记的成熟血管的微血管密度变化不明显,进一步分析可得出结论恩度主要抑制了肿瘤内的未成熟血管,而对成熟血管无明显抑制作用。第二部分超声造影评价恩度治疗后Lewis肺癌血流动力学动态变化的研究研究背景及意义抗肿瘤血管生成治疗是目前治疗肿瘤的研究热点和重点。抗新生血管生成药物的作用已经逐渐发展为包括抑制肿瘤血管生成、致肿瘤血管正常化、改善肿瘤微环境等涉及各个方面的多方探索。由于抗肿瘤血管生成药物作用于肿瘤内异常的新生血管,其治疗首先导致肿瘤新生血管的变化,继而会引起肿瘤内血容量、血流灌注速度及其它血流动力学指标的改变,因为这种新生血管的改变和肿瘤血流动力学的变化早期不一定伴随有肿瘤的缩小,所以采用观察肿瘤体积变化的方法来判断抗肿瘤新生血管治疗的疗效显然不能早期预测疗效甚至是不科学的。所以监测抗肿瘤新生血管治疗后肿瘤微血管的改变或者某些血流动力学指标的改变成为临床上评价抗血管生成治疗的有效指标。肿瘤内新生血管数量及结构异常、毛细血管通透性改变等导致肿瘤组织内血容量、血液灌注等血流动力学异常是肿瘤影像学检查异常增强的理论基础,而新生血管生成治疗后肿瘤血管的正常化也就可以表现为其原有异常强化形式的改变,所以目前很多影像学手段被探索用于抗肿瘤新生血管生成治疗后的疗效评估,这些手段主要包括：CT、MRI、核医学技术及超声造影。而其中超声技术因其易于进行、可携带、低耗费、超安全,卓越的空间分辨率和实时影像能力在临床获得最广泛应用,超声造影技术最早应用于良恶性肿瘤的鉴别,在乳腺、肝脏等某些器官有独特的影像技术优势。近年来多项临床前及临床研究探索其作为判断抗血管生成药物治疗肿瘤后的早期疗效评估,取得了大量有意义的结果,但大多集中在与微血管密度相关的无创性显示肿瘤微血管数目减少及肿瘤血流灌注下降的方面,关于抗血管生成药物治疗早期阶段的肿瘤血管正常化时间窗内的肿瘤血液灌注及血流动力学动态改变报道极少,而这对于判断抗血管生成药物治疗与放化疗联合应用的最佳时间剂量模式至关重要。恩度作为一种重要的抗血管生成药物,其抑制肿瘤血管及致肿瘤血管正常化已被多项临床前及临床研究证实,但尚没有研究探索恩度治疗后肿瘤微血管的血流动力学动态变化。研究目的：本研究采用Lewis肺癌移植瘤小鼠模型进行腹腔内注射恩度治疗或生理盐水对照治疗,每隔2天行超声造影检查动态观察两组肿瘤各血流灌注参数：峰值强度、达峰时间及平均通过时间的变化,观察恩度治疗后肿瘤内血流动力学的动态改变特定,并于治疗结束后,行免疫组化CD31的微血管密度计数,并将超声造影参数与肿瘤的微血管密度进行相关性比较,旨在探讨恩度治疗后各超声造影参数的动态变化来推断恩度导致的肿瘤微血管结构或功能变化。研究方法建立12只小鼠Lewis肺癌皮下移植瘤模型,待移植瘤生长至长径约6-7mm时,随机分为2组,次日起分别经腹腔注射生理盐水钠(normal saline,NS)或恩度(5mg/kg),每天给药1次,连续给药14天。用药后每天观察两组小鼠的一般情况,并每隔一天测定小鼠肿瘤的大小。药物治疗后,分别于第2、5、8、11、14对各动物模型移植瘤行超声造影检查,并应用超声造影定量分析软件进行脱机分析,获取峰值强度(PI)、达峰时间(TTP)和平均通过时间(mTT)等血流动力学参数。药物治疗14天行超声造影检查后,处死小鼠,并完整切除肿瘤,免疫组织化学检测肿瘤CD31并计数微血管密度(MVD),比较各超声造影参数与微血管密度之间的相关性。研究结果1、成功建立移植瘤,动态观察各组移植瘤大小并记录,药物治疗结束时,对照组及恩度治疗组小鼠移植瘤体积分别为：生理盐水组：5098.88±498.17mmm3,低剂量恩度治疗组：4374.21±242.05 mm3,P<0.05。2、分别在药物治疗治疗后2、5、8、11和14天行超声造影检查,记录每次测量相关血流动力学参数,随着治疗时间的延长,恩度组的峰值强度逐渐低于对照组,于第11天时与对照组开始有显着性差异(25.89±10.27dB vs 35.17±12.33 d. P<0.05):恩度组治疗后各时间点的达峰时间均较对照组略延长,至第8天时与对照组相比差异有显着性(10.54±5.36 vs 6.54±4.23 at day 8,P<0.05),第14天时达峰时间差异不显着。而恩度组与对照组相比,其平均通过时间略有缩短,从第5天即开始有统计学差异(59.35±11.22 vs 82.25±11.36 at day 5,P<0.05),至第11天以后又不再有差异。3、实验结束后,对照组免疫组织化学检测的微血管密度为72.93±12.20,恩度治疗组的微血管密分别为54.07±10.76。与对照组相比,恩度治疗组的微血管密度显着减少,恩度治疗组与对照组相比差异具有统计学差异(P＜0.05)4、对超声造影定量及拟合曲线分析(团注法)测定的肿瘤灌注参数与反映肿瘤血管生成的微血管密度进行相关性分析显示：峰值强度(PI)与微血管密度呈正相关(r=0.682,P＜0.05),而其它参数：达峰时间(TTP)、平均通过时间(mTT)与微血管密度之间无明显相关性(P>0.05)。研究结论1、超声造影可以用于评价恩度治疗后Lewis肺癌移植瘤血流动力学动态变化,其指标的变化可以从一些方面反映肿瘤微血管结构及功能的变化。2、在恩度治疗过程中,不同的超声造影血流动力学参数表现为不同的变化规律,这些不同的参数代表肿瘤微血管结构或功能对血流灌注的影响。3、峰值强度主要与肿瘤内微血管密度相关,而平均通过时间及达峰时间与微血管密度不相关,结合这不同参数的变化规律,提示恩度在致肿瘤微血管密度明显下降以前就
谢琴[7]2017年在《多靶点酪氨酸激酶抑制剂AL3810实验治疗甲状腺癌及机制研究》文中提出甲状腺癌(Thyroid Cancer,TC)是内分泌腺系统中最常见的恶性肿瘤,目前其治疗主要以手术治疗、手术后放射性碘(Radioactive Iodine,RAI)治疗以及促甲状腺激素(Thyroid Stimulating Hormone,TSH)释放抑制治疗为主。尽管在过去的几十年研究表明,恶性甲状腺癌的治疗有新突破,已经有新的有效的药物和制剂出现,目前大部分晚期甲状腺癌病人对常规的放射性碘131的治疗并不敏感,且可供选择的治疗有限。因此,积极寻找有效的、新的治疗药物和治疗策略对提高甲状腺癌的疗效、改善患者的生存率及提高他们的生活质量具有重大意义。本课题通过体内外不同模型系统评价了小分子多靶点酪氨酸激酶抑制剂AL3810对甲状腺癌的实验治疗效果。结果显示,该化合物能显着抑制多种甲状腺癌细胞的体内外增殖。AL3810作用72或120小时后,可以剂量依赖性的抑制甲状腺癌细胞TT、TPC-1和SW579的增殖,IC50值分别为2.56?M、7.03?M和590 nM。在体内实验中AL3810对细胞株来源的人源甲状腺癌SW579、TT等裸小鼠皮下移植瘤也均具有显着的抑制作用。SW579模型中,AL3810以5 mg/kg连续口服给药叁周抑制率可达97.57%左右,与索拉菲尼60 mg/kg实验治疗效果相当。更令人欣喜的是,在该模型中连续实验治疗叁周后,停药两周该组肿瘤仍未有明显生长。我们还尝试模拟肿瘤后期给药,即当肿瘤生长至2000 mm3左右开始实验治疗,AL3810在此方案下依然能发挥很好的抑制肿瘤生长的效果。AL3810 10 mg/kg实验治疗组给药后小鼠所荷肿瘤明显缩小,五周时该组肿瘤平均体积已缩至300 mm3左右。同样,在另一个甲状腺癌TT模型中,AL3810 10mg/kg也能显着抑制TT裸小鼠皮下移植瘤的生长,给药处理28天后抑制百分数为66.15%,抑制作用优于Sorafenib 60 mg/kg和XL184 30 mg/kg。我们前期的研究结果表明AL3810是一个新生血管抑制剂,因此在以上甲状腺肿瘤的实验治疗中,我们以内皮细胞表面标记物CD34为检测指标,免疫组化(Immunohistochemistry,IHC)考察其对肿瘤内新生血管生成的影响。结果显示AL3810能够显着降低瘤组织内微小血管的数目:当SW579裸小鼠移植瘤组织内AL3810给药剂量为5 mg/kg和10 mg/kg时,瘤组织CD34表达量分别下降了81.88%和92.83%;TT模型中结果类似,AL3810给药剂量为0.4、2和10 mg/kg时,瘤组织内CD34表达量分别下降了59.06%、63.78%和81.10%。这些结果显示该化合物的抗甲状腺肿瘤活性与其抗血管新生能力密切相关。流式细胞仪的检测结果展示,AL3810可浓度依赖和时间依赖地阻滞甲状腺癌细胞于G1期,并诱导细胞发生凋亡,最终导致甲状腺癌细胞死亡。0.5?M AL3810作用48小时即可诱导约20%的SW579细胞发生凋亡。我们进一步检测裸小鼠甲状腺癌皮下移植瘤在AL3810作用后的情况。免疫组化染色凋亡标记物TUNEL结果显示,无论是TT模型还是SW579模型中,AL3810作用后,瘤组织中TUNEL染色阳性率具有显着升高。在SW579模型中,当AL3810剂量为0.4、2和10 mg/kg时,凋亡率分别为4.66%、22.00%和36.00%;TT模型中,凋亡率则分别为6.66%、13.66%和22.66%。再次证实AL3810确实可引起甲状腺癌细胞发生凋亡。同样该化合物还可引起细胞周期阻滞的发生,AL3810 1?M作用24小时,64.2%的SW579细胞被阻滞处于G1期。相应的Western Blot结果则表明,在AL3810处理后,与G1期阻滞相关的周期调控蛋白如p21和p27的表达量显着上升,而蛋白CyclinD1、CDK2和P-Rb的表达量则显着下调,这与流式周期的结果一致。AL3810的前期研究结果提示,该化合物在分子水平可抑制RET磷酸化的发生。鉴于RET在甲状腺癌发生发展中的重要作用,我们进一步考察该化合物是否通过抑制RET信号通路而抑制RET依赖的人甲状腺癌细胞的体内外生长。我们首先选用转染RET的Ba F3工具细胞考察。结果表明,AL3810能显着抑制转染RET的BaF3的体外增殖,可阻滞细胞于G1期,并诱导细胞发生凋亡,但对亲本细胞BaF3的生长则无明显影响。Western Blot结果证实,该化合物能显着抑制BaF3-RET以及人源甲状腺癌细胞TT和TPC-1细胞内RET磷酸化的发生,同时下调其下游蛋白AKT、ERK1/2以及STAT3的磷酸化。以上结果表明,该化合物在分子水平和细胞水平对RET信号通路均有抑制作用。综上,AL3810能够显着抑制RET依赖和RET非依赖的甲状腺癌,抗肿瘤疗效显着,是一个有前景的抗肿瘤药物。这些结果为AL3810的临床应用于甲状腺癌的治疗提供了扎实的实验依据,也使我们更加确信AL3810是一个值得进一步研究的光明的多靶点酪氨酸激酶类抗肿瘤药物。
栾佐[8]2015年在《细胞移植治疗小儿严重脑损伤及神经残疾专家共识》文中提出一、概述小儿严重脑损伤及神经残疾是指一系列由多种原因引发的、常规方法很难获得疗效的重度脑损伤及其后遗症,大致分为中-重度围产期脑损伤、中-重度急性缺氧(缺血)脑损伤、中-重度中枢神经残疾、难治性自身免疫相关性脑病及代谢性脑病等。据不完全统计,目前我国足月新生儿缺氧缺血性脑病(hypoxic-ischemic encephalopathy,HIE)的发病率为3‰~5‰,早产儿脑白质损伤发病率为10﹪~17﹪,
毛斌[9]2015年在《人类多潜能干细胞体外分化红细胞发育过程中表型分子的研究》文中研究表明研究目的：人类多潜能干细胞(human pluripotent stem cells, hPSCs)主要包括人胚胎干细胞(human embryonic stem cells, hESCs)和人诱导性多潜能干细胞(human induced pluripotent stem cells, hiPSCs),二者兼具体外自我更新、无限增殖及多分化潜能的特性。它们的成功建株,极大地推动了干细胞基础研究和临床应用研究。研究的一个重要方向是将hPSCs向特定谱系的成熟血液细胞定向诱导分化。因为一直没有合适的研究人类早期造血发生的模型,以往的研究主要都是基于小鼠等动物模型。hESCs体外诱导分化红细胞的过程,模拟了人类胚胎期体内红系发生发育过程,为研究红细胞正常发育的调控机理奠定了实验基础。另一方面,利用患者hiPSCs体系建立体外诱导分化红细胞的方法,将为研究红细胞早期发育异常相关疾病的致病机理和开发个体化治疗手段提供理想的平台。在所有血细胞中,成熟红细胞因为不含细胞核,并携带着最小量的遗传物质,寿命较长等特点,有望作为最早的干细胞来源的细胞治疗产品而应用于临床。但在成功实现hPSC来源的红细胞临床应用前,还存在诸多问题需解决,例如：培养体系的不健全导致的体外扩增效率低、成熟程度低；脱核调控机制不明；没有合适的活体移植模型等。这些困难需要通过对hPSC来源红细胞的发生和成熟过程中的关键调控机理的理解来攻克。为了精密地研究hPSCs体外诱导分化红细胞的发育过程,在方法学上有两个亟待解决的问题。(1)现有实验数据已显示不同诱导体系产生的红细胞成熟程度有差异。这种差异指向一个事实,即成体造血微环境来源的基质细胞的诱导对hPSCs产生成熟红细胞是必需的。所以需要建立一套高效并趋于自然的共培养方法,以得到类似于自然发育过程产生的成熟红细胞。(2) hPSC来源的红细胞分化培养体系中,同时存在原始造血及成体造血过程,并且红细胞在早期发育存在不同的发育阶段。为了辨别不同的细胞,需要建立一种快捷、方便且准确的标识方法。在成体干细胞向红细胞分化发育过程的研究领域,已成功利用表型分子来区分红细胞的不同发育阶段,启示我们也可能利用表型分子来区分hPSC来源红细胞的早期不同发育阶段。研究方法：我们比较了不同的成体造血微环境来源的基质细胞,选择了小鼠主动脉-性腺-中肾(Aorta-Gonad-Mesonephros, AGM)细胞作为共培养体系的基质细胞。AGM区域是最早的支持成体造血的位点。我们建立了将hPSCs与AGM来源的细胞系AGM-S3体外向红细胞分化的培养方法。首先将hPSCs细胞与AGM-S3细胞系先共培养诱导造血分化的发生,再经悬浮培养向红细胞定向分化并扩增。以成体干细胞hCB-CD34~+来源的红细胞为对照,用先进的多色流式分析技术,探索hPSCs与AGM-S3共培养来源红细胞特异的表型分子表达谱系。随后以分别表达特异表型分子的红细胞亚群GPA~+CD36-和GPA~+CD34~+为切入点,利用荧光激活细胞分选(Fluorescence Activated Cell Sorting, FACS)技术,精确地将各目标细胞亚群分选出。然后利用瑞姬氏(May-Grunwald-Giemsa, MGG)染色方法观察细胞形态,通过免疫荧光染色方法考察血红蛋白组分来评价红细胞的成熟程度,并采用qRT-PCR技术检测造血及红细胞发育相关的重要基因的转录水平。研究结果：我们建立了高效的hPSC/AGM-S3共培养造血诱导分化体系,可以产生大量的高纯度和高成熟度红细胞,共培养12天再悬浮培养24天时,红细胞数量约为起始未分化H1细胞数量的300倍,其中85%以上表达成体型血红蛋白p。hPSC/AGM-S3共培养体系来源的红细胞p血红蛋白的表达率远远高于其他实验室报道的数据。我们在这个高效体系上进一步研究了hPSC/AGM-S3共培养体系来源红细胞发育过程的表型分子表达谱系,发现共培养阶段红系特有的表型分子GPA阳性(GPA~+)细胞上的其他共表达表型分子模式与已知的成体型红细胞的发育模式不同。其中GPA和成熟红细胞的特定分子CD36和造血干细胞的特有分子CD34的共表达均存在hPSCs分化发育的特有模式。我们根据这两条线索,进行了进一步细致地研究工作。本工作通过精密细致地研究,首次发现并论证了hPSC来源的早期红细胞可根据GPA和CD36抗原的共表达的表达变化指示不同的发育阶段。在共培养阶段相当长一段时间(6-18天)红细胞表型为GPA~+CD36-,悬浮培养后逐渐变为GPA~+CD36low/~+,10~+5天时达到一半左右,然后又再逐渐变为GPA~+CD36-。我们在不同时间点将CD36表达不同的红细胞亚群利用流式分选技术分离出来,通过对特定红细胞亚群Hb组分、表型分子及基因转录相对水平的比较,进一步揭示了这一系列的表型变化过程同时伴随着中胚层及内皮细胞特性的丢失,原始造血向成体造血特性的转变以及红细胞成熟度逐渐升高等变化过程。综合我们的实验数据,提示红细胞的初期发育是源于中胚层向内皮造血的途径,远在成体造血干／祖细胞被确定诞生之前。进一步的研究还发现hPSC/AGM-S3共培养阶段红细胞最初存在于表型为GPA~+CD34~+的细胞亚群中,细胞亚群比例先增加后减少。流式分选出共培养10天中的GPA~+CD34~+,对其细胞形态,人血红蛋白表达以及分化潜能进行了研究。现有数据显示GPA~+CD34~+是带有很强内皮细胞特性的细胞,约60%表达人Hb。我们拟进一步深入研究GPA~+CD34~+细胞与内皮细胞的关系,找出GPA~+CD34~+细胞的前体细胞,有望揭示hPSCs细胞来源最早红细胞的起源和发育过程。
冯凯[10]2002年在《造血干/祖细胞的体外定向诱导分化的临床前研究》文中研究说明造血干细胞为人类最早发现的一种干细胞也是目前为止研究最多的一种干细胞。进入90 年代后,随着分子生物学、免疫学、细胞生物学、激光、纳米材料和电子计算机等学科和技术的高速发展,使纯化造血干/祖细胞成为现实,也为造血干/祖细胞的体外扩增、定向诱导分化、基因治疗、生物免疫治疗、建库和移植奠定了基础。造血干细胞具有自我更新和多向分化的性能特征,过去的相当长的一段时期内,造血干细胞的来源还仅限于骨髓,近几年的研究表明,人们可从脐带血及动员的外周血获得大量的造血干/祖细胞,从而为造血细胞的基础及应用研究提供充足的细胞资源。对于造血干细胞,以往研究的重点在其体外扩增以满足临床患者移植的需要。而随着对于细胞性能的更深的认识,使人们意识到可利用造血干细胞多向分化的能力,利用体外操作技术,使我们获得足够数量的需要的细胞。从而完成“体外造血”,为细胞治疗提供应用手段。脐带血中富含造血干/祖细胞,且具有来源丰富,对供者无任何影响等优点,是极具潜力的造血干细胞来源。本文利用脐带血分离出造血干/祖细胞,分别研究其在体外定向诱导分化为粒系细胞、红系细胞、巨核系细胞及树突状细胞的能力。细胞治疗的方案应考虑如下的因素:能否获得足够数量的细胞;所获得的细胞是否具有其相应的功能;体外操作所获得的细胞是否有癌变的可能。为探讨利用人造血干/祖细胞体外定向诱导分化的人粒系细胞、红系细胞、巨核系细胞及树突状细胞应用于临床的可行性,我们利用源自人胎盘脐带血的CD34~+细胞及(SCF、IL-3、IL-6 和G-CSF)、(SCF、
参考文献：
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[10]. 造血干/祖细胞的体外定向诱导分化的临床前研究[D]. 冯凯. 中国人民解放军军事医学科学院. 2002