金乔[1]2004年在《马立克氏病疫苗二次免疫增强抗肿瘤免疫机理的研究》文中提出马立克氏病是由疱疹病毒引起鸡的最常见恶性淋巴肿瘤性疾病，自七十年代RL Witter和Okazaki等用火鸡疱疹病毒(HVT)成功地研制出MD疫苗以来，疫苗免疫已成为控制MD流行最有效的措施之一。尽管CVI988、SB1+HVT、Z4+HVT等免疫力较强的MD活疫苗相继应用于生产，但随着养鸡业集约化及MD流行病学变化，MD疫苗免疫效果差或免疫失败现象屡见不鲜，因此，国内外兽医工作者和研究人员探索了新的MD免疫策略——二次免疫。 本试验用HVT冻干苗、CVI988液氮苗和HVT+Z4二价苗分别一次和二次免疫SPF鸡进行实验室免疫效力实验，结果表明：叁种疫苗一次免疫的保护指数为63.2～88.2，二次免疫的保护指数为88.2～94.1，二次免疫可以显着提高疫苗的保护率。在实验室条件下验证了MD疫苗二次免疫增强免疫鸡群抗MDV诱导肿瘤的免疫力是客观的现象。 目前，虽然学术界对MD二次免疫表示赞同，但依然不能对此作出科学的解释。根据最近几年国内外对MD致病机理和免疫机理的最新成果，结合我们对MD的一些新认识，认为再次免疫疫苗毒存在生产性感染并能增强免疫鸡群抗肿瘤免疫力。通过用间接免疫荧光试验(IFA)分析HVT一次免疫和二次免疫鸡血液淋巴细胞表面表达MDV相关的gB抗原动态，发现HVT一次免疫鸡在免疫后7天左右淋巴细胞表面表达gB抗原达到一个高峰(8.06％～13.07％)，随后很快下降并维持一个很低的水平(0.56％～2.41％)；而HVT二次免疫鸡在第一次免疫后gB抗原表达达到一个高峰，在第二次免疫后7天左右又达到一个gB抗原表达高峰(16.84％)，随后也下降并维持很低的水平(0.575％～2.08％)。说明再次接种的MD疫苗毒也从生产性感染开始进行增殖，在经一段时间后也转为潜伏感染。二次免疫使免疫鸡群受到了再一次大量免疫原刺激，在第一次免疫记忆存在的条件下，获得了更强的体液和细胞免疫应答，大大增强了抗肿瘤的免疫力。同时各免疫组扬州大学硕士研究生论文鸡用RBIB强毒攻毒后发现二次免疫组比一次免疫组更能抑制强毒在体内的复制。 用淋巴细胞增殖试验检测血淋巴细胞(MTT法)表明:二次免疫组鸡血液淋巴细胞增殖活性比一次免疫组鸡显着增强。流式细胞术(FCM)分析一次和二次免疫组鸡血液淋巴细胞cD3+、CD4+、CDS+T淋巴细胞的百分含量，发现在第二次免疫后7日龄左右时二次免疫组鸡的CD3+、CDS+T淋巴细胞的百分含量比一次免疫组鸡显着提高。初步验证了MD再次免疫疫苗毒存在生产性感染并增强免疫鸡群抗肿瘤免疫力。
梁萍[2]2005年在《马立克氏病疫苗一次和二次免疫的比较研究》文中认为马立克氏病(Marek's Disease,MD)是由疱疹病毒(Herpesvirus)引起鸡的最常见恶性淋巴肿瘤性疾病,自上世纪七十年代R L Witter和Okazaki等用火鸡疱疹病毒(Herpesvirus of turkey, HVT)成功地研制出MD疫苗以来,疫苗免疫已成为控制MD流行最有效的措施之一。尽管CV1988、SB1+HVT、Z4+HVT等免疫力较强的MD活疫苗相继应用于生产,但随着养鸡业集约化及MD流行病学变化,MD疫苗免疫效果差或免疫失败现象仍屡见不鲜,因此,有必要对新的MD控制技术——疫苗二次免疫进行研究。 用HVT冻干苗和CVI988活疫苗分别一次和二次免疫狼山鸡进行实验室免疫效力实验,结果表明:在受到强毒GA株攻击时两种疫苗一次免疫的保护指数为68.7～87.5,二次免疫的保护指数为87.5～93.7;而在受到特超强毒584A株的攻击时,一次免疫的保护指数为44.4～77.8,二次免疫的保护指数为88.9～100。由此可见,二次免疫可以显着提高疫苗的保护率。在实验室条件下验证了MD疫苗二次免疫能够增强免疫鸡群抗马立克氏病病毒(Marek's disease virus,MDV)诱导肿瘤的免疫力。 为了探索二次免疫增强抗肿瘤的免疫机理,我们通过流式细胞术(Flow cytometry,FCM)分析了HVT、CVI988疫苗免疫鸡外周血淋巴细胞(PBLC)表面MDV相关抗原的动态分布,发现1日龄一次免疫鸡在免疫后6天左右MDV抗原阳性的淋巴细胞数达到高峰(分别为11.42%和14.92%),随后很快下降并维持很低的水平:同样的7日龄一次免疫鸡在免疫后7天左右MDV抗原阳性淋巴细胞数也达到高峰(分别为13.62%和11.6%),随后也很快下降并维持很低的水平;而1日龄和7日龄二次免疫鸡在第一次免疫后7天左右阳性细胞数达到高峰(分别为7.92%和13.29%),在第二次免疫后7天左右又达到另一个抗原表达高峰(分别为
彭大新[3]2001年在《表达鸡马立克氏病病毒糖蛋白B基因及共表达糖蛋白B和鸡γ干扰素基因的重组鸡痘病毒的构建及其免疫保护作用》文中指出鸡马立克氏病（MD）是由马立克氏病病毒（MDV）引起的一种淋巴组织增生性肿瘤疾病，常因造成免疫抑制和大批死亡而给养禽业带来巨大的经济损失。虽然常规疫苗在控制MD的发生中起到非常重要的作用，但也存在难以克服的缺点，常规的HVT冻干疫苗使用方便而免疫效力欠佳，常规的液氮冷冻疫苗保护效力高而保存和运输不方便。为了能研制新一代安全、高效、使用方便的基因工程疫苗，本研究对鸡痘病毒的复制非必需片段进行优选，对人工合成启动子进行组合筛选，以优选的复制非必需片段和强启动子构建了高效表达MDV gB基因的重组鸡痘病毒及共表达MDV gB和γ干扰素基因的重组鸡痘病毒（rFPV），并在不同品种鸡中测定了rFPV的免疫效力。现从五个方面将本论文进行的研究概述如下：一、鸡痘病毒复制非必需片段的优选 pSV-Gal经HindⅢ和BamHI双酶切回收β-半乳糖苷酶基因（LacZ）片段，插入到BamHI单酶切的质粒pp18中P7.5下游，构建成含P7.5-LacZ基因盒的pB7.5，以HindⅢ和XbaI双酶切pB7.5，回收P7.5-LacZ基因盒，插入到3个含鸡痘病毒复制非必需片段的质粒pFPV18、pFPV7s、pFPV9s的EcoRV位点构建成转移载体pFB18、pFB7s和pFB9s，以转移载体和脂质体共转染已感染FPV中国疫苗株282E4的鸡胚成纤维细胞（CEF），经多次蓝斑筛选和纯化，得到稳定生长的重组病毒；将纯化后的重组鸡痘病毒感染次代CEF，于感染后72小时收获细胞，制备细胞提取物，检测提取物中β-半乳糖苷酶的活性。通过比较活性的高低及片段长短的优势，我们选取了pFPV7s作为构建高效表达载体的复制非必需片段。经序列测定，该片段由2909个核苷酸组成，是新鉴定出的FPV复制非必需片段。 －d－ler。esn ie州大学博士学位论文二、鸡痘病毒强启动子的合成和筛选 根据痘苗病毒天然启动子P7．5的结构，考虑核昔酸的种类、数目、分布与启动效率之间的关系，人工合成一条寡核昔酸，经磷酸化，变性退火后各形成一个早期G）和一个晚期启动子（L），其首尾可相互连接；用 T4 DNA连接酶使早、晚期启动子自身连接或混合连接，将不同启动子的组合克隆到pUC t体中，通过原位杂交筛选，酶切、电泳及测序来确定启动子数目，获得了IO个较有代表性的启动子组合P81．10：PSI（L）、PSZ（LL）、PS3（LLLL）、Ps4（EE）、PSS（LE）、Ps6（LELE）、Ps7（LLEE）、Pss（LLEEEE）、Psg（LLES）和 Pslo（LLE18）。在质粒Psllo的不同启动子下游插入LacZ基因后，用BamHI和Hindlll双酶切回收PS－LacZ基因插人到含鸡痘病毒复制非必需片段的质粒pFPV7S形成转移载体pFBSllo，脂质体转染，蓝斑筛选和纯化得到重组病毒OFPVSllo）；以含P7．5－eZ基因的重组病毒为对照，含合成启动子的重组病毒于感染CEF后10、24、36、48、72小时收获细胞，制备细胞提取物，检测p－半乳糖昔酶的活性。通过活性强弱的比较，筛选出最强的启动子组合LLEE，其表达活性为P7．5的3．5倍。和其表达效率相近的启动子组合为LLLL。我们选用LLEE来构建高效表达载体。叁～高效表达MDVgB＆因的重组鸡痘病毒的构建 人工合成2＆寡聚核昔酸，形成一个多克隆位点，与EcoRV＄切的pFPV7s相连形成含多克隆位点的yV7S；将pG18用BamHI酶切，回收PlllncL基因盒插入到含强启动子LLEE的PS的EcoAI位点构建pOS，使LLEE与Pll－eZ处于相对方向；再将 pGS中的 PSLacZPll基因盒插入到 FPV7S中构建成插入载体PFGSll 最后将 CVI988 gB基因插入到 pFGSll中的 PS下游构建成转移载体pFGBS，利用 PS来调控 MDV gB的表达；通过酶切和 SOUthern blot鉴定后，转染已感染 FPV 282E4的 CEF，经蓝斑筛选和纯化得到重组病毒rFPVPS－gB，以抗MDV gb单抗作间接免疫荧光试验可见感染重组病毒的CEF的细胞膜和细胞浆有特异性的黄绿色的荧光，与P7．5调控MDV gB基因表达的重组病毒dpVI7．5－gB相比，d7T，v－PS伊的gB基因的表达量是后者3倍以上。证明了优选的复制非必需片段可用于构建稳定的鸡痘病毒载体，筛选的强启动子可提高目的基因的表达量。四、共表达MDVgh和可干扰素基因（WN）的重组鸡痘病毒的构建 彭大新：表达 MDV gB基因及共表达 gB和鸡 Y干扰素基因的重组鸡痘病毒的构建及其免疫保护作用 f 将含 PE／LJFN基因盒的质粒用 EcoM酶切补平后插入到 pFGBS的 Smal位点， 通过酶切鉴定和斑点杂交获得了PEIJFN与PS唱B同向和相对的转移载体 pFGBSll和pFGBSIZ。选择pFGBSIZ经脂质体转染，蓝斑筛选纯化得到稳定的重 组病毒rFPVPS唱B工FNJ。以间接兔疫荧光法证实，LLEE调控的MDV gB可正
参考文献：
[1]. 马立克氏病疫苗二次免疫增强抗肿瘤免疫机理的研究[D]. 金乔. 扬州大学. 2004
[2]. 马立克氏病疫苗一次和二次免疫的比较研究[D]. 梁萍. 扬州大学. 2005
[3]. 表达鸡马立克氏病病毒糖蛋白B基因及共表达糖蛋白B和鸡γ干扰素基因的重组鸡痘病毒的构建及其免疫保护作用[D]. 彭大新. 扬州大学. 2001