1胶州市人民医院儿内科 266300；2 胶州市人民医院 266300；3青岛大学医学院附属医院儿内科 266003
摘要：目的：研究IL-17F基因多态性变异，HLA-A27表型与肠道病毒71型（EV71）感染遗传易感性的关系，探讨不同的基因表型变异对EV71感染患病率风险的影响。方法：收集2011年11月-2013年11月EV71检测为阳性的急性期中枢神经系统感染患儿123例，根据病情轻重分成轻症组、重症组；提取患儿外周血白细胞的基因组DNA，用序列特意性引物-聚合酶链反应（PCR-SSP）技术检测EV71感染患儿及正常对照儿童HLA-A27表型的多态性和限制性片段长度多态性一聚合酶链反应（PCR—RFLP）检测IL-17F 7488T/C位点的多态性。结果EV71感染患儿中HLA—A27表型阳性率（24．39％）与健康儿童组阳性率（11．82％）的差异有统计学意义（X2=6，099，P<0，05）。EV71中枢感染患儿位点IL-17F 7488T/C等位基因频率明显高于正常对照组（x2=6．367，P<0.05），感染组IL-17F 7488TT基因型分布频率显著低于正常对照儿童（X2=5．393，P<0．05）；而轻症组与重症组相比，其差异无统计学意义（P>0．05）。HLA—A27（+）患儿中，EV71感染组IL-17F 7488T/C基因型频率明显高于正常对照组（X2=3．866，P<0．05），而在HLA．A27（一）儿童中，其差异无统计学意义。结论 HLA-A27表型、IL-17F 7488T/C位点基因多态性与EV71中枢感染有关。
关键词：肠道病毒71；HLA抗原；IL-17F多态性
肠道病毒71型是儿童手足口病、中枢神经系统、循环系统感染的主要病原菌。与肠道病毒家族的其他成员相比，EV71有较强的嗜血、嗜神经性，更易引起中枢神经系统损伤，严重患儿可出现肺水肿、心包积液而导致死亡。研究发现HLA—A27基因的表型与EV71感染有非常重要的相关性。IL-17F能够促进其他炎症因子及趋化因子（IL-6，CXCL10）的释放，使炎症反应进一步扩大，IL-17F 7488T/C（rs763780）位点具有基因多态性，且与多种疾病具有相关性，但对于IL-17F 7488T/C位点基因多态性与EV71感染相关性研究也有报道。IL-17F参与免疫应答过程白细胞和中粒细胞的生成及转移过程IL-17可引起CRP升高，IL-17F与IL-17具50%同源性，且多于二聚体的形式参与炎症反应，故推测IL-17F也可导致CRP升高。IL-17F7488T/C位点T→C的基因变异降低了EV71脑炎的患病风险，C等位基因是保护基因，而TT基因型、T等位基因是EV71脑炎的遗传易感因素。
对象与方法
一、研究对象
收集2011年11月-2013年11月，在青岛大学医学院附属医院、青岛市儿童医院、胶州市人民医院和滨州市人民医院住院的中枢神经系统感染的患儿123例，平均年龄1．3—6．7岁，其中无菌性脑膜炎83例，脑炎40例，均符合《实用儿科学》的诊断标准，且经RT—PCR定性法检测粪便及脑脊液EV71病毒核酸均为阳性。根据病情轻重分成轻症组、重症组，重症组符合下列条件2项或以上：（1）频繁抽搐或惊厥持续状态；（2）意识障碍，Glasgow昏迷评分<7分；（3）瘫痪；（4）出现脑干症状；（5）脑cT或MRI显示脑实质和（或）脑干内异常密度灶。入院时采集病儿静脉EDTA抗凝血2 ml，于一20℃短暂保存备用，所有标本采集时间均在病程前3 d内。正常对照组110例，为同时期健康体检儿童，临床无感染症状，年龄2.6—7．5岁，血常规及生化指标检查均在正常参考范围内。
二 方法
1、标本基因组DNA的制备；采用天根公司全血DNA提取试剂盒，按试剂盒造作说明自抗凝全血中提取人基因组DNA.
2、HLA-A27表型基因检测；参照Bunce等的报道设计扩增HLA-A27特异性引物。由上海生工生物技术有限公司合成。PCR扩增使用宝生物公司的PremixExTaq，参照试剂盒说明操作。HLA-A27表型扩增条件；950C预变性3min，950C 30S，610C 30S，720C 20S，35个循环；最后720C 10min。扩增产物立即在琼脂糖凝胶上电泳检测。
3、IL-17F引物设计
EV71特异引物 5′-ATGCGTAGAAAGGTGGAGCT-3′（341bp） 5′-CGCATGTCGGTGAATAGCTC-3′
4.组合基因型分型：HLA-A27（+）患儿中EV71感染组TNFRⅡ+196TG基因型频率显著高于正常对照组，经统计学分析，差异有统计学意义（x2=3．8659，P<0．05），而在HLA—A27（一）儿童中，其差异无统计学意义。
5.统计学分析
采用SPSS 17.0统计分析软件包进行数据处理和统计分析IL-17F 7488T/C位点的不同基因型携带者的患病风险（OR）及95％可信区间（CI）采用Logistic回归分析对于IL-17F 7488T/C位点的不同基因型在EV71感染后的血象及CRP的变化采用曼-惠特U检验P<0．05有统计学意义。两组间基因型和等位基因频数分布比较采用x2检验，P<0．05认为差异有统计学意义。
结果
一、HLA-A27表型分析通过PCR扩增，2％琼脂糖凝胶电泳确定HLA-A27
表型的阳性或阴性。结果显示：123例EV71感染患儿中HLA—A27（+）30例，110例健康对照儿童中HLA．A27（+）13例，两组阳性率之间的差异有统计学意义（x2=6．099，P<0．05）。
二、IL-17F7488位点不同基因型炎症反应特点差异CC+CTTTP值两组之间的差异有统计学意义（P<0．05）。
讨论
肠道病毒71型（EV71）有中枢神经系统疾病的婴儿患者的粪便标本中分离出来的。不同的亚型感染后临床症状不完全相痹等多种与神经系统相关的疾病，致残及病死率较高。因此，EV71感染及流行是值得我们密切关注的问题。EV71经口咽部进入人体，主要在口咽或肠黏膜等上皮组织和局部淋巴组织处繁殖。大部分为隐性感染，并产生特异性抗体；少数因缺乏免疫力或是在机体抵抗力低时病毒可进入血流而产生病毒血症。病毒可通过血脑屏障进入中枢神经系统，引起脑实质、脊髓、脑脊膜等处病变。患者在手足口病后出现中枢神经系统损害的表现，部分患者仅表现为手足口病；EV71感染导致中枢神经系统损害以及由EV71感染引起的手足口病中出现中枢神经系统损害所占比例较大。EV71对神经系统的致病毒强，导致中枢神经系统损害的病理表现主要发生在脑干，中脑、脑桥、延髓均可见病变，脑桥被盖部为最易受累的部位，这些病灶可以解释临床所见的肌阵挛、共济失调、意向性震颤、眼球活动障碍、幻视、短暂尿储留、陈-施呼吸等表现。严重病例可见延髓广泛病变，累及脑干的心血管为呼吸中枢，导致急性神经源性肺水肿和循环衰竭，并由此导致患者死亡。本研究通过 123例EV71中枢感染患儿与110例健康儿童HLA-A27表型及IL-17F7488位点基因型，发现EV71中枢感染患儿I-ILA—A27表型阳性率与对照组之间的差异有明显的统计学意义；提示C等位基因频率增高与EV71感染相关，在EV71感染轻症组与重症组的差异有统计学意义。
参考文献：
[1]陈宗波，范希文，董永绥，等．山东地区肠道病毒中枢神经系统感染187例分析．中华儿科杂志，2003，41：119-202．
[2]Weng KF，Chen LL，Huang PN，et a1．I％ural pathogenesis of enterovires71 infection．Microbes Infect+20lO．12：505-510，
[3]付丹，李成荣，何颜霞，等．肠道病毒7l型感染患儿免疫功能探讨．中华儿科杂志，2009，47：829-834．
论文作者:赵娟1,汪宏2,陈宗波3
论文发表刊物:《健康世界》2015年8期供稿
论文发表时间:2015/11/10
标签：表型论文; 统计学论文; 多态性论文; 患儿论文; 肠道论文; 病毒论文; 基因论文; 《健康世界》2015年8期供稿论文;