芮琪[1]2004年在《小麦叶片衰老过程中内肽酶同工酶变化和特性及Rubisco降解的研究》文中指出为了了解植物叶片衰老过程中细胞内蛋白质降解和蛋白水解酶的变化行为，本论文对小麦(Triticum aestivum L. cv．Yanmai 158)叶片衰老过程中内肽酶同工酶的变化和特性以及Rubisco在叶衰老过程中的降解进行了研究。主要研究内容如下： 1、小麦叶片衰老过程中内肽酶的变化 蛋白质的降解需要蛋白水解酶，包括内肽酶和外肽酶的参与，叶衰老过程中发挥主要作用的是内肽酶。小麦叶片暗诱导衰老和自然衰老过程中，内肽酶活力均先上升后下降，这一过程伴随着内肽酶同工酶谱的变化。采用多种改进的内肽酶同工酶梯度凝胶电泳方法，检测到多种在衰老期间表达的内肽酶同工酶，当以血红蛋白为底物时，在暗诱导衰老过程中先后出现4种新的内肽酶，而在自然衰老过程中先后出现5种新的内肽酶，有一种只在自然衰老过程中才检测到，而且一些原来就存在的内肽酶同工酶活力也发生变化。当以明胶为底物时，衰老过程中主要检测到5种新的内肽酶同工酶，它们在自然衰老过程中也能检测到，并且以明胶为底物所得的内肽酶同工酶谱与以植物蛋白Rubisco为底物所得的同工酶谱比较接近。而采用将明胶为底物的SDS-PAGE方法只能检测到一种新内肽酶同工酶的出现，因此衰老期间表达的内肽酶同工酶大都是对SDS敏感的或多亚基的蛋白水解酶。另外，采用不同的内肽酶同工酶电泳方法研究中均发现自然衰老和暗诱导衰老过程中的内肽酶同工酶谱变化基本相似，因此暗诱导衰老可以作为一种研究叶片自然衰老过程中出现的蛋白水解酶的特性的模式。 2、叶衰老过程中内肽酶的特性研究 采用明胶为底物的梯度凝胶电泳方法研究小麦叶片内衰老相关性蛋白水解酶的表达和生化特性发现，衰老相关性蛋白酶的表达由核基因控制，外源激素处理也影响这些蛋白酶的表达，如6-BA(6-苄氨基嘌呤)能延缓这些同工酶的出现，而ABA(脱落南京农业大学博士学位论文小麦叶片衰老过程中内肤酶同工酶变化与特性及Rubisc。降解的研究酸)则加速它们的表达.衰老期间的6种主要的内肤酶同工酶(EPI一P6)中，EPI、EPZ、EP4、EPS、EP6是衰老期间才表达的，它们呈现活力的pH范围及温度范围较窄;EP3不是到衰老期间才表达的，但它在叶衰老过程中活性增强，其表现活力的pH范围和温度范围均较宽.另外，EP3、EPS、EP6对热不太敏感，EPI、EPZ、EP4对热相对较敏感.加入不同蛋白酶抑制剂处理的实验结果表明，EPI、EPZ是需金属离子的半脱氨酸型内肤酶，EP4是丝氨酸型内肤酶，EPS和EP6的活力能被丝氨酸型蛋白酶抑制剂部分抑制，而选用的几种抑制剂对EP3都没有明显的抑制效果。 3、小麦叶片衰老过程中1，5一二磷酸核酮糖数化酶伽氧酶(RubiscoEC 4.1.1.39)的降解 小麦叶片暗诱导衰老和自然衰老过程中，Rubisc。大亚基(LSU)发生裂解，产生50叨的降解产物，这是首次在叶衰老过程中检测到Rubisco的体内(in vivo)降解产物.进一步的研究发现LSU发生这步裂解时，Ruhisco全酶没有解离，SOkD降解产物仍能组装在Rubisco全酶中.当以幼嫩叶片的粗酶液为研究体系时，在pH为5.5，温度为30一35℃时也能检测到LSU裂解产生的SOkD的降解产物;而以衰老叶片的粗酶液为研究体系时，在pH7.5时能检测到反应明显发生，反应的温度也为30一35℃.从幼嫩叶片中提取的叶绿体，在pHS.5和7.5的条件下均不能产生50kD的降解产物;而从衰老叶片提取的叶绿体，在酸性条件下该反应不能进行，但在pH7.5时则能检测到有SOkD降解产物的出现.抑制剂实验还表明，不管是在幼嫩叶片还是衰老叶片中，Lsu由5 3kD降解为50kD这一反应都能被半脱氛酸型蛋白酶抑制R.JE一64和leuPePtin抑制，同时，金属蛋白酶抑制剂能部分抑制该反应.对50kD降解条带N一末端测序发现降解位点是LSU第14号氨基酸赖氨酸残基和第巧号氨基酸丙氨酸残基之间的肤健，该位点位于Rublsco分子中LSU与LSU、LSU与SSU相互作用的区域. 以上研究结果有助于更全面地了解植物体内的蛋白质降解和蛋白水解酶，有助于阐明叶衰老过程中Rubisco快速降解的分子机制，丰富生物体内蛋白质降解理论;而且能为从分子水平上改造Rubisco，调控其活性和降解，并为发现新的蛋白水解酶提供线索;同时还能为今后农业生产实践上延缓作物衰老，提高作物产量和品质提供科学依据.
张鹏[2]2006年在《黄瓜叶片衰老过程中内肽酶变化及其生化特性的研究》文中提出叶片衰老是叶片生长发育过程中一个重要阶段，该期间蛋白质的降解是叶片衰老过程中一个极其重要的事件，蛋白质降解后的营养物质会运送到生长旺盛的组织或贮藏器官被再利用对后者的生长具有重要意义；另一方面叶片蛋白质，尤其Rubisco的降解影响光合作用的进行，对生物产量的形成和提高造成不良影响。因此研究和弄清叶片蛋白质降解机制具有重要的意义。许多研究认为内肽酶在叶片蛋白质降解中起主要作用，但不同植物中内肽酶种类、特性等存在差异，因此深入研究不同植物中内肽酶变化规律及其功能对揭示蛋白质降解机制有重要作用。黄瓜是我国栽培面积较大的蔬菜作物，由于黄瓜为无限生长植物，在生产中叶片早衰是影响黄瓜产量的重要因素，因此，延缓黄瓜叶片衰老无疑将显着增加其产量。但国内对黄瓜叶片衰老的研究主要集中在光合特性变化和栽培措施等方面，对其衰老机制尤其是叶片蛋白质降解与内肽酶的关系研究则几乎未见报道。本文研究了黄瓜叶片衰老过程中的主要生理生化特性变化，并重点对叶片蛋白质降解及其内肽酶同工酶变化及其生化特性等进行了研究，结果表明：黄瓜叶片衰老过程中，叶片的叶绿素含量、净光合速率、蛋白质含量和SOD活性降低，但MDA含量和POD活性增加；叶绿体结构发生明显变化，外形由长椭圆形逐渐趋于圆形；叶绿体内淀粉粒由多而大逐渐变少而小，油脂则由小而少变大而多；基粒片层由细长沿叶绿体长轴方向排列，逐渐变粗短，排列杂乱至模糊不清，内含物向细胞中扩散而最终导致叶绿体解体。因此叶片蛋白质的降解可能与叶绿体结构的变化和叶片内的氧化胁迫增加有关。为研究黄瓜叶片衰老过程中内肽酶变化对可溶性蛋白质降解的影响，采用以明胶为底物的梯度凝胶电泳活性染色方法，首次对自然衰老过程中黄瓜叶片内肽酶同工酶的变化进行了研究。结果表明，黄瓜叶片自然衰老过程中蛋白质含量在叶片伸出后15天左右最高，随后开始降低；内肽酶活性在叶片伸出35d后显着升高，此时叶片中蛋白质明显发生降解。黄瓜叶片内肽酶的最适pH为7.0，最适温度为40℃，内肽酶活性可被Ca~(2+)、半胱氨酸等激活，内肽酶抑制剂分析显示丝氨酸类型的内肽酶活性占总活性的57％左右。梯度凝胶电泳活性染色方法检测到至少4种黄瓜叶片内肽酶同工酶，各同工酶活性变化和出现时期在自然衰老过程中不同；丝氨酸内肽酶同工酶2，3随叶片衰老活性增强，为黄瓜叶片中主要的内肽酶同工酶。为进一步了解黄瓜叶片衰老期间的各种内肽酶同工酶变化及其生化特性，采用离体叶片暗诱导处理进行试验，结果表明，暗诱导使叶片衰老加速，叶绿素含量快速下降，叶片蛋白质降解与内肽酶活力升高呈负相关。应用活性电泳方法检测到了黄瓜叶片暗诱导衰老过程中有9种内肽酶同工酶(CEP1-9)，其中6种(CEP1，5，6，7，8，9)与衰老进程相关。而且，黄瓜叶片在自然衰老中出现的同工酶，在暗诱导衰老中也出现。对内肽酶同工酶生化特性研究表明，各种同工酶在40℃时活性最高，适宜的pH为6.0-8.0；其中CEP3热稳定性最高。所检测到的内肽酶同工酶中，CEP2，3，4，9内肽酶活性较强，为黄瓜叶片衰老中主要的内肽酶，它们在pH5.0-9.0的范围内均有活性，最适pH为7.0；温度低于25℃或高于60℃各内肽酶均没有活性。蛋白酶抑制剂试验分析表明，CEP2，3，4，9属于丝氨酸型内肽酶，CEP6为半胱氨酸型内肽酶，因此认为丝氨酸型内肽酶在黄瓜叶片衰老中具有重要作用。为深入了解黄瓜衰老叶片中活性最强的丝氨酸内肽酶的生理作用，采用丝氨酸内肽酶抑制剂AEBSF、ABA和GA处理的方法，研究了其对黄瓜叶片衰老的影响，结果表明，50μM 6-BA与丝氨酸内肽酶抑制剂AEBSF处理不仅能抑制叶片内肽酶活性的升高、延缓叶片蛋白质降解，而且能提高SOD活性，降低POD活性；而50μM ABA则促进了内肽酶活性的升高；但50μMABA+10mmol／L AEBSF处理后叶片内肽酶活性低于单独ABA处理。活性电泳显示，黄瓜叶片中检测到6条内肽酶同工酶，其中4条(CEP2，3，4，6)为丝氨酸型内肽酶，内肽酶抑制剂AEBSF抑制了叶片中丝氨酸内肽酶同工酶的活性，而ABA使丝氨酸内肽酶CEP2，3，4的活性显着增强，再次暗示了丝氨酸型内肽酶在黄瓜叶片衰老以及叶片Rubisco降解中具有重要作用，而且除了丝氨酸内肽酶外，可能还有其它因素参与了衰老的调控。还应用外源氮肥处理，研究了其对黄瓜叶片中蛋白质降解与内肽酶活性及同工酶变化的影响，以期了解N素对植物内肽酶表达和活性表现的影响。结果表明，随着叶面施氮浓度的提高，叶片蛋白质含量增加、而内肽酶活性减弱，在一定N浓度范围内，叶片生长正常，叶片没有衰老症状。高氮处理间内肽酶同工酶组成上变化不明显，但在低氮处理中，内肽酶同工酶活性增强、同工酶种类增加，可溶性糖含量增加，Rubsico出现降解现象，外源氮肥处理后14天后，各处理与缺氮培养叶片内肽酶变化相似并有新的内肽酶同工酶出现。
钟军华[3]2008年在《盐胁迫下不结球白菜幼苗叶片内肽酶同工酶变化及其生化特性研究》文中研究表明内肽酶是细胞内一类十分重要的水解酶,在植物体内它也分布广泛,在植物生长的各个阶段,如在种子萌发,器官衰老以及各种逆境胁迫过程中发挥着重要的作用,尤其在促进蛋白质的周转和再利用,维持细胞的稳态以及参与细胞信号转导中调控蛋白质降解等事件中起直接的作用。目前,国内外对植物的正常生长,如种子萌发和器官衰老等过程中内肽酶同工酶及其功能方面研究较多,而有关植物在逆境胁迫下内肽酶变化方面的研究较少,尤其未见有蔬菜在盐胁迫下内肽酶同工酶的变化和功能研究。同时,外源NO供体SNP的研究也大多集中于NO对植物的缓解作用以及在信号转导中的地位和功能,而SNP对盐胁迫下植物内肽酶的影响未见报道。不结球白菜(Brassica campestris L.ssp.chinensis Makino)是一种非常重要的大众化蔬菜,在我国尤其南方人们日常生活的蔬菜生产和供应上占有十分重要的地位。暑绿(Shulü)是近年培育出的一种优良不结球白菜新品种。本试验以暑绿为材料,主要研究了不同盐浓度胁迫暑绿和SNP缓解盐胁迫下暑绿的幼苗叶片形态、蛋白质含量和内肽酶同工酶活性及特性等变化情况,结果表明:1、盐胁迫下暑绿幼苗叶片内肽酶同工酶变化及其生化特性暑绿幼苗在50、100、150、200、250、300、500 mmol·L~(-1)的不同NaCl浓度胁迫下1天后,结果发现,与对照相比,当盐浓度达到200 mmol·L~(-1)时,叶片明显萎蔫,而且随着盐浓度的增加萎蔫症状也更加逐渐明显;100和200 mmol·L~(-1)NaCl处理时的叶片内肽酶同工酶变化差异较大。为进一步研究盐胁迫与暑绿叶片内肽酶同工酶变化的关系,采取100、200mmol·L~(-1)NaCl处理暑绿幼苗不同时间后发现,在100mmol·L~(-1)NaCl处理的第四天,叶片内肽酶活性较对照有所增强,叶蛋白质含量下降;当在200 mmol·L~(-1)NaCl处理相同天数时,叶片内肽酶活性较对照及100 mmol·L~(-1)处理的更明显增强,1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/力口氧酶(Rubisco)等蛋白发生明显降解,叶片走向衰老。结果还发现,暑绿叶片中共有5种内肽酶同工酶(EP1～EP5),其中EP3和EP5为半胱氨酸型内肽酶,EP1和EP2为丝氨酸型内肽酶,而EP4几乎不被所试的各类内肽酶抑制剂所抑制。内肽酶的最适pH为6.0,最适温度为50℃,各同工酶的热稳定性有较大差异,其中EP3、EP4和EP5的热稳定性较好,在60℃下保温1h还保留较高活性;在100mmol·L~(-1)盐浓度处理的4天中,叶片内EP4活性增强,其它四种同工酶活性变化不明显;当在200 mmol·L~(-1)盐浓度处理时,EP2、EP4、EP5活性明显增强,并随着时间推移活性不断升高,而EP1、EP3活性明显降低。以上结果表示,EP2、EP4、EP5可能在盐胁迫诱导的叶片衰老中起主要作用。2、SNP对盐胁迫下暑绿幼苗叶片内肽酶同工酶的影响200mmol·L~(-1)NaCl胁迫明显抑制了暑绿叶片的生长,但当采用低浓度SNP(25和50μmol·L~(-1))处理后,发现叶片形态与对照相近;但高浓度SNP(大于100μmol·L~(-1))处理反而加剧了暑绿叶片的损伤。在单独盐胁迫5天后,暑绿叶片可溶性蛋白质含量降低,仅为CK的76%,内肽酶同工酶种类基本不变,但各同工酶活性都增强;当在低浓度SNP(10、25和50μmol·L~(-1))范围处理下,叶片内肽酶同工酶活性都逐渐降低,但当SNP浓度大于100μmol·L~(-1)时,叶片内肽酶同工酶活性都逐渐增强。为进一步研究SNP对盐胁迫下暑绿幼苗叶片内肽酶变化的影响,试验采用把盐处理浓度提高至300 mmol·L~(-1),SNP处理浓度分别为25、50、100、200、400μmol·L~(-1)。结果显示,在单独盐胁迫3天后,暑绿叶片明显开始黄化,Rubisco蛋白明显被降解,内肽酶总活力增加,活性电泳只检测到3种内肽酶同工酶(EP2、EP4和EP5),其中EP4活性增强,EP2和EP5活性降低或基本不表现出活性;当再加入25μmol·L~(-1)SNP处理后,暑绿叶片早期(第叁天前)黄化有所缓解,但是最后不能逆转300 mmol·L~(-1)盐胁迫对叶片的伤害,内肽酶EP2、EP4和EP5活性明显增强;但当SNP大于50μmol·L~(-1)时,叶片损伤更严重,可溶性蛋白质含量明显降低,叁种内肽酶同工酶活性都逐渐降低,但仍具有一定的活性,其中只有EP4表现比较稳定。以上研究结果表明,一定浓度的SNP对盐胁迫下暑绿叶片衰老有一定的缓解作用,这种作用具有浓度效应,且与盐胁迫的浓度有关;另外进一步表明了EP2、EP4和EP5在盐胁迫促进叶片衰老的蛋白质降解过程中起重要作用。3、暑绿叶片自然衰老期间内肽酶同工酶的变化为进一步了解不结球白菜暑绿叶片衰老过程中内肽酶的变化情况,对自然衰老过程中内肽酶同工酶和可溶性蛋白含量的变化也进行了研究。研究结果表明,在第四片叶伸出后的第2个星期,叶片中蛋白质的含量达到最高值,此后叶片蛋白质含量开始下降,内肽酶活力逐渐升高,在第6星期后叶片可溶性蛋白质含量仅为最高值的48.8%;不同生长时期第四片叶内肽酶活性电泳显示,EP1和EP2同工酶活性条带由于相互扩散而彼此相连,EP4活性达到最强以至也与EP3相连:Rubisco在衰老后期的降解比较明显,在第5星期后的电泳胶上能清楚的检测到两条Rubisco被降解条带。还研究分析了4叶期暑绿植株不同叶位叶片内肽酶同工酶的差异。试验结果表明,不同叶位叶片中均能检测到5种内肽酶同工酶,但刚伸出的第4张叶中各内肽酶同工酶活性都比较弱,Rubisco含量较低且未发现有降解的现象;第3、第2和第1张叶片中5种内肽酶同工酶活性都比较强,Rubisco被降解现象比较明显,其中第1张叶片(即最早伸出的叶片)中各内肽酶同工酶活性活性都达最强,说明这叁种叶片处于不同的衰老进程中。总之,内肽酶EP1、EP2和EP4在暑绿叶片衰老过程中的活性不断增强,而EP3和EP5的活性在衰老后期呈现下降的趋势,因此,EP1、EP2和EP4可能在叶片自然衰老过程中,尤其蛋白质的降解中起主要作用。
张颖[4]2010年在《盐胁迫下小麦根系内肽酶同工酶的变化及生化特性和叶片Rubisco大亚基的降解》文中认为内肽酶是细胞内一类十分重要的蛋白水解酶,它主要能水解多肽链内部的肽键而达到降解蛋白质的目的。内肽酶在植物体内分布很广泛,在植物生长的各个阶段,如在种子萌发,器官衰老以及在各种逆境胁迫过程中均发挥着重要的调控作用。目前,国内外对植物正常生长过程中内肽酶同工酶及其功能方面的研究较多,而有关逆境胁迫下植物内肽酶同工酶的变化方面研究较少,尤其少见有盐胁迫下植物根系内肽酶同工酶的变化及生化特性的研究。为了了解小麦在盐胁迫过程中蛋白质降解和内肽酶同工酶的变化等情况,本论文以小麦(Triticum aestivum L.)耐盐品种H6756为实验材料,对其根系在盐胁迫过程中的生长生理和氧化损伤的几种指标(如根长、TBARS含量、O2·-产生速率等)、内肽酶同工酶的变化和其特性以及叶片中Rubisco及其大亚基的降解情况进行了研究。主要研究内容和结果如下：1、盐胁迫下小麦根系生长及其氧化伤害的变化小麦H6756幼苗在0(对照)、25、75、150、300mmol·L-1NaCl处理下0-8d,结果发现：25mmol·L-1NaCl处理下的小麦根长与对照无明显差异;而300mmol·L-1NaCl胁迫下的小麦根长则与对照的差异显着,第8天时的根长仅是对照的66.2%；随着处理时间的延长和NaCl浓度的提高,75和150mmol·L-1NaCl处理的小麦根长与对照之间的差异也逐渐由不显着达到显着水平。不同浓度NaCl处理可以不同程度的升高小麦根系内O2·-的产生速率。其中,25和75mmol·L-1NaCl处理下小麦根系O2·-的产生速率分别在处理的第8天和第6天达到最大,与对照的相比分别升高了39.2%和39.65%；150和300mmol·L-1NaCl处理下小麦根系O2·-的产生速率均在处理第二天达到最大,随后在处理的4-8天中,前者开始下降但维持在稍高于对照的水平,而300mmol·L-1NaCl处理下的小麦根系O2·-的产生速率一直保持较高水平,其产生速率在处理的2-8天中一直大约是对照水平的2倍。低浓度(25、75mmol·L-1) NaCl处理过程中小麦根系中的TBARS含量与对照的基本相同或十分接近,而高浓度(150和300mmol·L-1) NaCl处理下根系TBARS的含量在第2天开始上升,于第4天时都达到了最大值,分别比对照的增加了22.08%和44.42%,然而150mmol·L-1NaCl处理下根系的TBARS含量呈现出先上升,6天后又逐渐降至接近对照的水平,300mmol·L-1NaCl处理的小麦根系中TBARS含量却一直高于其他处理的水平。2、盐胁迫下小麦根系内肽酶总活力及其同工酶的变化小麦H6756幼苗在0(对照)、25、75、150、300、400和500mmol·L-1不同NaCl浓度处理下0-8天,结果发现：在盐胁迫过程中,小麦根系总内肽酶比活力均有不同程度地上升,同时可溶性蛋白含量在不同程度上均有下降。25、75和150mmol·L-1NaCl处理的小麦根系总内肽酶比活力在8天中都略高于对照的,且随着处理时间的延长其比活力缓慢升高；300mmol·L-1NaCl处理的0-4天过程中,根系内总内肽酶比活力随着胁迫处理时间的延长而急剧上升,随后其比活力升高的速率放缓,但继续升高到第8天时达到了对照的1.86倍；400和500mmol·L-1NaCl处理的0-8天过程中,根系内总内肽酶比活力随着盐胁迫处理时间延长而持续急剧上升,并且一直高于同期的300mmol·L-1NaCl处理的水平。25和75mmol·L-1NaCl处理的根系中可溶性蛋白含量变化的趋势与对照的基本相似；150mmol·L-1NaCl处理的根系中可溶性蛋白含量在第6天达到最小值,然后到第8天又上升至接近对照的水平；300mmol·L-1NaCl胁迫处理下根系中可溶性蛋白含量一直持续下降,第8天根系中的可溶性蛋白含量只有对照的34.2%。400和500mmol·L-1NaCl处理的0-8天过程中,根系中的可溶性蛋白含量随着盐胁迫处理时间延长而持续急剧下降,并且一直低于于同期的300mmol·L-1NaCl处理的水平。采用以明胶为底物的内肽酶梯度凝胶电泳方法,检测到盐胁迫期间小麦根系中存在五种内肽酶同工酶(RE1-5),它们在盐胁迫过程中分别表现出不同的情况.其中,RE1仅在NaCl处理后能检测到其活力,而在对照根系中没有检测到,并且RE1的活力随着NaCl处理浓度的升高而增强；RE2的活力在NaCl处理中呈现先升后降的趋势；RE3和RE4的活力在NaCl浓度为300mmol·L-1NaCl及以上浓度处理时明显增强；RE5的活力随着NaCl处理时间的延长以及NaCl浓度的升高呈现先增高然后降低的趋势,且它的活力在五种同工酶中是最弱的。根据上述结果,我们推测,在以上五种内肽酶同工酶中,RE1和RE2可能是与小麦H6756根系耐盐性比较密切相关的两种同工酶.研究还发现,外施适宜浓度的ABA或GA3能够通过抑制根系中因盐胁迫升高的内肽酶活力来达到减少根系蛋白质降解的目的。3、盐胁迫下小麦根系总内肽酶及两种内肽酶同工酶的生化特性根据前面试验的结果,选用300mmol·L-1NaCl处理6d的小麦H6756全根作为实验材料,研究了根的总内肽酶以及两种与耐盐性紧密相关的内肽酶同工酶(RE1和RE2)的生化特性。研究结果如下：盐胁迫下小麦根系总内肽酶的最适pH为4；最适温度为50℃；在4～40℃处理1h后总内肽酶的比活力变化不大,维持其较高活力水平,但随着温度的再升高其比活力逐渐降低,不过在80℃处理1h后总内肽酶的比活力还保持有4℃时的68.7%；金属蛋白酶抑制剂EGTA、EDTA和丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF对总内肽酶的抑制效果最为明显,而ATP可显着提高总内肽酶的活力。内肽酶同工酶RE2的最适pH为6,最适温度为50℃；在较宽的pH范围(pH3-10)和温度范围(20-80℃)内都表现有活力,在70℃水浴中保温1h后仍有较高活性,因此表现出具有良好的pH和热稳定性；而RE1的最适pH为5,最适温度为40℃；活力表现的pH和温度范围分别是3-9和30-70℃；RE1对热的表现为相对不稳定,在50℃及以上水浴中保温1h后其活性大量丧失；添加不同蛋白酶抑制剂处理后的实验结果表明,RE1和RE2均属于丝氨酸型蛋白酶,而RE2还兼属于金属蛋白酶。采用GPAGE和western blot经及蛋白酶抑制剂处理等方法,根据实验获得的740KDa左右的RE1相对分子量、RE1活力能被丝氨酸型蛋白酶抑制剂AEBSF和PMSF以及蛋白酶体特异性抑制剂MG115明显抑制以及RE1能与20S蛋白酶体抗体发生免疫印迹反应等实验结果,REl进一步被确定为20S蛋白酶体。RE1(20S蛋白酶体)在pH5的200mmol·L-1醋酸缓冲溶液中具有最大的酪蛋白水解活性。此外,通过GPAGE分离和western blot方法,我们还检测到根中20S蛋白酶体的含量随着NaCl处理的浓度升高和处理时间的延长而逐渐下降现象。4、盐胁迫对小麦叶片Rubisco大亚基降解的影响小麦H6756幼苗在0(对照)、25、75、150和300mmol·L-1NaCl的不同浓度下处理8d,结果显示：与对照的相比,25和75mmol·L-1NaCl处理对小麦H6756的生长几乎没有影响；但150和300mmol·L-1NaCl处理均能抑制小麦H6756的生长,且随着NaCl处理浓度的升高或处理时间的延长,这种抑制作用逐渐显着。到第八天,300mmol·L-1NaCl NaCl处理的小麦幼苗只长出两片真叶,而同期对照已长出叁片真叶。本研究发现,与没有盐处理的对照相比,不同盐浓度处理的0-4天中小麦第一片叶内蛋白质含量呈现迅速下降的趋势,然后于4-8天中基本维持在一个稳定的水平上；叶片内肽酶比活力在0-8天中均呈现不断升高的趋势,然而在6-8天中的升高幅度明显变小。其中,300mmol·L-1NaCl处理的叶片中内肽酶比活力上升最快,其比活力也最高,相应叶片内可溶性蛋白质的含量表现为最低。由此可见,NaCl胁迫也可诱导叶片中内肽酶活力的升高,从而加快叶片内蛋白质的降解,使叶片中的可溶性蛋白含量降低。由此可以看出,不同盐浓度胁迫处理下第一叶片中可溶性蛋白质含量以及内肽酶比活力的变化与上述根系中可溶性蛋白质含量以及内肽酶比活力的变化情况存在相似之处。这进一步表明,小麦H6756确实具有良好的耐盐特性,小麦H6756能够通过加速小麦体内的蛋白质周转速度以抵御或适应植株外界变化了的环境。研究还发现,在叶片自然(无盐处理)生长过程中,Rubisco全酶和Rubisco大亚基(LSU)的含量也持续下降,并且能检测到相对分子量为51kDa的LSU体内降解产物。然而,在不同盐浓度处理下的0-6天中,叶片LSU51kDa降解产物的蛋白量均呈现不断增加的趋势,至第6天达到其最大值,6天后开始明显变少；其中,150和300mmol·L-1NaCl处理下的第6天后,叶片中LSU以及51kDa的LSU体内降解产物含量明显低于对照与其他浓度盐处理的,尤其300mmol·L-1NaCl处理下第8天叶片中的51kDa的LSU体内降解产物已几乎检测不到；而25和75mmol·L-1NaC1处理下叶片中Rubisco含量及LSU的降解情况则与无NaCl处理的对照基本相似。以上结果表明,相比其它处理,较高浓度(150、300mmol·L-1) NaCl胁迫下小麦叶片中的内肽酶的活力明显升高,从而使叶片中Rubisco全酶、LSU及LSU体内降解产物降解的速度加快；而53kDa的Rubisco大亚基一旦被降解成51kDa产物,51kDa产物的进一步降解的速度会大大地加快,由止匕推测,Rubisco大亚基N-末端的分子量大约2kDa的一段多肽链对于稳定Rubisco的结构可能具有重要的作用。以上研究结果有助于更加全面地了解植物根系和叶片内的内肽酶(同工酶)变化和蛋白质降解的情况,为进一步深入阐明植物内肽酶与蛋白质降解的机制及其与植物耐盐性的关系提供了一定的科学依据。
王任先[5]2009年在《一种与小麦叶片衰老相关的丝氨酸型蛋白酶的纯化及其生化特性鉴定》文中研究说明以离体暗诱导衰老48h的扬麦158(Triticum aestivum L. cv.Yangmai158)叶片为实验材料,通过盐析、层析和电泳等方法分离纯化得到了一种与叶片衰老相关的丝氨酸型蛋白酶(内肽酶),然后对其生化特性和一级结构进行了鉴定。其主要研究结果简述如下：1.蛋白酶的分离纯化与质谱鉴定暗诱导衰老的小麦叶片冰浴中研磨成匀浆后离心取上清液(即粗酶液),粗酶液于50℃,pH5.5的条件下温浴处理0.5h,粗酶液中热不稳定性杂蛋白(尤其是1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶,Rubisco)的含量明显减少；温浴处理后的粗酶液经过硫酸铵分级沉淀(饱和度为50%-70%)和Sephadex G-25层析脱盐后,再通过Q-sepharose fast flow强阴离子交换层析(0到0.6mol-L-1NaCl梯度洗脱)分离,收集有目的蛋白酶活性的洗脱液再超滤脱盐；上述具有蛋白酶活性的洗脱液分别经过5%-20%的含明胶的梯度凝胶活性电泳(gelatin-gradient-PAGE)和5%-20%的天然梯度凝胶电泳(natural gradient-PAGE)分离后,从活性电泳凝胶上的蛋白酶活性带对应的天然梯度凝胶上切下相应位置附近的四条蛋白条带(从上到下分别标注为：1、2、3和4号),再分别加细胞提取液研磨成匀浆离心后回收,作为蛋白酶电泳样品。上述样品再分别通过gelatin-gradient-PAGE和native gradient-PAGE分析,结果显示,从native胶上分别切下的4条蛋白带银染后显示为四种蛋白,蛋白酶的活性电泳结果显示仅2号蛋白带具有蛋白酶活性。同时,四条蛋白带送北京军事医学科学院蛋白质组研究中心进行质谱鉴定,所得数据在NCBI上进行比对,结果显示,2号蛋白是属于枯草杆菌类蛋白酶类(subtilisin-like)的一种蛋白酶。2.蛋白酶的生化特性分析鉴定对纯化得到的蛋白酶进行相关生化特性分析鉴定,结果显示：丝氨酸蛋白酶抑制剂AEBSF和PMSF几乎能完全抑制该枯草杆菌类蛋白酶的活性,且金属离子蛋白酶抑制剂EGTA也可以抑制该酶的大部分活性(活性下降为原来的30%左右),表明该蛋白酶是一种依赖金属离子的丝氨酸型蛋白酶。其他类型的蛋白酶抑制剂酸性蛋白酶抑制剂,如pepstatin.金属离子型蛋白酶抑制剂EDTA和1,10-phenanthroline、半胱氨酸蛋白酶抑制剂E-64、丝氨酸蛋白酶抑制剂TPCK、半胱氨酸/丝氨酸蛋白酶抑制剂leupeptin对该酶抑制效果均不明显；该酶的最适pH在7左右,最适温度为50℃左右；在70℃时处理1h下仍有20%左右的活性；为了进一步研究该枯草杆菌类蛋白酶的特性,我们又选用了九种有机试剂对蛋白酶进行处理,结果显示该酶对1%SDS、25%Ethanol、25%DMSO、0.2%Tween80和0.2%TritonX-100都不敏感1M Urea可以使该蛋白酶活性降低30%左右,25%Isopropanol可以使该酶活性下降50%左右,而80mM DTT和25%methanol几乎可以使该酶活性完全丧失。以上研究结果表明,该蛋白酶是小麦衰老叶片内新发现的一种具有较强稳定性的依赖某种金属离子的丝氨酸型枯草杆菌类(subtilisin-like)蛋白酶。
张鹏, 王飞, 张列峰, 徐朗莱[6]2007年在《黄瓜叶片生长期间内肽酶活性和同工酶变化及其生化特性》文中认为研究了黄瓜自然生长期间叶片可溶性蛋白质降解、内肽酶活性及其同工酶的变化,并对叶片衰老后期粗提液内肽酶的基本生化特性进行了研究。结果表明,黄瓜叶片内肽酶活性在叶片伸出5 d时较低,叶片衰老后期(叶片伸出35d)显着升高,Rub isco蛋白发生明显降解;叶片全展以后叶片蛋白质含量与内肽酶活性显着负相关。黄瓜叶片粗提液总内肽酶的最适pH为7.0,最适温度为40℃,内肽酶活性可被Ca2+、Zn2+、半胱氨酸等激活。内肽酶抑制剂试验显示,丝氨酸类型的内肽酶活性占内肽酶总活性的57%左右。采用以明胶为底物的内肽酶梯度凝胶电泳活性染色方法,检测到叶片中至少有4种内肽酶同工酶,各同工酶在叶片生长过程中出现的时间和活性大小不同,丝氨酸型内肽酶同工酶活性随叶片生长明显增强,暗示该类内肽酶在黄瓜叶片衰老过程中可能具有重要作用。
钟军华, 张颖, 卢之颖, 芮琪, 徐朗莱[7]2009年在《盐胁迫下不结球白菜幼苗叶片内肽酶同工酶变化及生化特性研究》文中认为研究了不同盐浓度胁迫下不结球白菜暑绿幼苗叶片中可溶性蛋白质含量、内肽酶同工酶及其活性的变化和内肽酶同工酶生化特性。结果表明,暑绿叶片中存在5种内肽酶同工酶(EP1~EP5),其中,EP3和EP5为半胱氨酸型内肽酶,EP1和EP2为丝氨酸型内肽酶,而EP4几乎不被所试的各种内肽酶抑制剂所抑制;内肽酶的最适pH为6.0,最适温度为50℃;EP3、EP4和EP5的热稳定性较好,在60℃下保温1 h后还保留较高活性。100 mmol.L-1NaC l处理暑绿4 d后,EP4活性增强,其他4种同工酶活性变化不明显;200 mmol.L-1NaC l处理相同时间,叶片1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(Rub isco)等蛋白发生明显降解,EP2、EP4、EP5活性随着时间推进不断升高,而EP1、EP3活性明显降低,显示EP2、EP4、EP5可能在盐胁迫诱导的暑绿叶片衰老中起主要作用。
陈晓[8]2011年在《小麦叶片中与Rubisco大亚基降解相关的蛋白酶的生化特性、合成定位及分离纯化研究》文中进行了进一步梳理本实验室研究发现,小麦叶片中存在着能够降解1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(Rubisco)大亚基(LSU)为51KDa的相关蛋白酶,而且该蛋白酶在其分离纯化过程中与Rubisco紧密结合。本文以小麦3E158(Triticum aestivum L.cv.3E158)和扬麦158(Triticum aestivum L. cv. Yangmai158)叶片为实验材料,通过天然梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳(GPAGE)后切胶回收得到的Rubisco,应用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离Rubisco蛋白亚基及蛋白酶,分别采用SDS-PAGE、加明胶的活性SDS-PAGE鉴定蛋白质和检测蛋白酶的方式,研究了该蛋白酶的生化特性和合成的细胞定位,并对与Rubisco紧密结合的蛋白酶的分离纯化进行了进一步尝试。其主要研究结果简述如下：1、与Rubisco大亚基降解相关的蛋白酶的生化特性小麦粗酶提取液经过非变性梯度(5%-10%)聚丙烯酰胺凝胶电泳后,通过切胶方法回收含有Rubisco的凝胶,我们得到了纯度很高的Rubisco全酶。将这种Rubisco全酶在不同的温度下进行处理2h,发现降解LSU的蛋白酶的最适温度为40～50℃。研究不同浓度的ATP对Rubisco大亚基的降解影响,结果表明,在添加1mmol·L-1ATP下能加速LSU降解,并降解成很多小的片段；添加的ATP浓度过高或过低,LSU降解程度相对较弱。选取小麦初生叶(平均叶长2cm)为材料,切胶回收得到纯度很高的Rubisco全酶。将这种Rubisco全酶在40℃下保温处理6h后,通过SDS-PAGE检测,发现能够清晰的得到Rubisco大亚基被降解为51KDa的条带；同时,对上述样品煮沸5min,再进行适宜温度下保温反应6h,发现此时LSU不再发生降解。因此,我们认为,降解Rubisco大亚基为51KDa的相关蛋白酶在小麦叶片的生长初期即已存在。2、与Rubisco大亚基降解相关的蛋白酶合成的细胞定位选用两种蛋白质合成抑制剂—放线菌酮(核基因编码蛋白质合成抑制剂)和林可霉素(叶绿体基因编码蛋白质合成抑制剂),分别浸泡处理暗处的小麦叶片。不同浓度(0.01、0.1和lmg/ml)的上述抑制剂作用叶片后,提取叶片粗酶液,通过SDS-PAGE检测LSU的降解情况,结果显示,林可霉素抑制LSU降解作用更明显。此外,1mg/ml林可霉素的抑制作用更好。1mg/ml的两种抑制剂,单独及其混合溶液暗处浸泡处理叶片1d,然后在pH7.5的Tis-HCl缓冲体系和pH5.5的柠檬酸缓冲体系下,通过聚丙烯酰胺电泳及切胶回收得到相应缓冲体系下的Rubisco全酶,SDS-PAGE检测Rubisco降解为51KDa的情况。实验结果显示,在两种pH条件下,林可霉素均能较强地抑制蛋白酶对Rubisco大亚基的降解。此外,1mg/ml抑制剂暗处浸泡处理叶片不同的时间,结果发现,随着处理时间增加,林可霉素处理的Rubisco大亚基发生降解的情况越少。由此,我们可以确定,叶片暗诱导衰老过程中合成产生的特异性降解LSU的该蛋白酶可能主要是由叶绿体基因编码的。3、分离纯化结合Rubisco并降解大亚基的蛋白酶切胶回收得到的Rubisco样品,过mono-Q强阴离子交换柱,收集Rubisco峰进行脱盐,浓缩后SDS-PAGE检测。结果表明,Rubisco仍会降解,即Rubisco样品通过强阴离子交换柱分离依然没有将该蛋白酶和Rubisco分开。切胶回收得到的浓度很高的Rubisco酶液进行非完全变性(样液不进行加热煮沸)的SDS-PAGE,电泳后用TritionX-100脱去SDS。然后,分别切胶回收整块凝胶中Rubisco大亚基、小亚基所在处及分离胶中除大、小亚基位置之外的成分,最后分别将大亚基之外的其他各成分加入大亚基成分中,SDS凝胶电泳检测发现,Rubisco全酶经过SDS凝胶电泳后,降解Rubisco大亚基的蛋白酶能够与Rubisco大、小亚基分开,而这种蛋白酶可能不止一种,其中占主导地位的蛋白酶分子量可能比大亚基大。通过对切胶回收的Rubisco全酶进行添加明胶的SDS-PAGE活性电泳检测,也发现Rubisco切胶回收酶液中存在着一种分子量可能高于大亚基的蛋白酶。
王晓媛[9]2007年在《暗诱导衰老小麦叶片内一种耐热蛋白水解酶的分离纯化及其生化特性鉴定》文中研究说明植物体内的蛋白水解酶在植物的生长发育、衰老及在外界环境胁迫下的生理适应活动过程中都发挥着重要的作用，尤其在植物叶片的衰老过程中，叶片中蛋白水解酶同工酶的合成量及其活性都会有显着的提高。本实验室多年来一直致力于植物叶片衰老过程中蛋白水解酶同工酶变化的研究，在以小麦为材料的研究中发现小麦衰老期间叶片内存在多种与衰老相关的蛋白水解酶同工酶，并在对这些蛋白水解酶的生化特性进一步研究中，还发现了其中有一种性质很特殊的蛋白水解酶同工酶，它在小麦生长幼苗期和衰老期间都有活性，但在衰老期间其活性会显着上升，尤其是该蛋白水解酶具有良好的热稳定性。为了更深入的研究这种蛋白水解酶同工酶，本实验以暗诱导衰老的小麦叶片为材料，通过生物化学的研究方法和手段，对这种蛋白水解酶进行了分离纯化和生化特性的研究，其主要的研究内容及结果叙述如下：1、暗诱导衰老小麦叶片内一种耐热蛋白水解酶的初步分离纯化及其生化特性鉴定本研究以暗诱导衰老48h的小麦(Triticum aestivum L. cv. Yangmai 158)叶片为材料，采用30％-50％饱和度的硫酸铵沉淀，凝胶层析脱盐后进行聚丙烯酰胺凝胶蛋白水解酶同工酶活性电泳，再直接切胶用回收槽电洗脱回收方法，初步分离鉴定出了这种耐热的蛋白水解酶同工酶。用蛋白水解酶活性电泳法检测上述回收槽电洗脱回收的样品，结果显示只有一条明显的蛋白水解酶同工酶条带，但普通梯度凝胶电泳的结果显示该回收样品中还存在少许杂蛋白。另外，我们对该酶的一些基本的生化特性也进行了研究，结果显示该酶具有良好的热稳定性，分离纯化后的酶液在0到60℃温度下处理1 h后进行蛋白酶活性电泳，其活性无明显变化，在70℃温浴下处理1 h后仍有部分活性。且该酶还表现出相当宽的pH稳定范围，电泳后的凝胶在pH 3.0或pH 10.0和80℃条件下处理2 h，该酶还存在一定的活性。研究结果显示该酶的最适温度为50℃，最适pH约为8.0．酸性蛋白酶抑制剂pepstatin、金属蛋白酶抑制剂EDTA和1’10-Phenanthroline以及半胱氨酸蛋白酶抑制剂E-64都不能抑制这种蛋白水解酶同工酶的活性，但丝氨酸蛋白酶抑制剂AEBSF能部分抑制该酶的活性。上述的纯化方案操作比较简单，且相对于常规的纯化比较经济，但纯化后的酶液内还具有少量的杂蛋白。因此，我们在上面实验的基础上，对有关纯化方法和过程进行了进一步的优化。具体的方法和步骤如下：以暗诱导衰老48h的小麦叶片为材料，匀浆后离心取上清液(即粗酶液)，粗酶液于33℃，pH5.5的条件下温浴1h，电泳后的染色结果显示：上述温浴处理后的粗酶液中杂蛋白(尤其是1，5-二磷酸核酮糖羧化酶／加氧酶)的含量明显减少；处理后的酶液先进行硫酸铵分级沉淀(饱和度为30％-50％)，凝胶层析脱盐后进行DEAE阴离子交换柱层析分离；收集酶活性组分透析后通过Q-sepharose fast flow柱进行层析分离；收集蛋白水解酶活性组分经聚丙烯酰胺凝胶蛋白水解酶活性电泳分离后，再采用直接切胶用回收槽电洗脱回收方法，最后分离纯化出了该种耐热的蛋白水解酶，蛋白水解酶活性电泳和梯度凝胶蛋白质电泳结果显示都为一条带。对纯化得到的该酶进行生物化学特性鉴定，结果发现该酶的最适温度为55℃左右，在75℃时处理1h后仍有37％左右的活性；该酶的最适pH约为8.0；10 mmol·L~(-1)丝氨酸蛋白酶抑制剂AEBSF处理大约能抑制该酶活性的60％，而酸性蛋白酶抑制剂pepstaliIl、金属蛋白酶抑制剂EDTA和EGTA、半胱氨酸蛋白酶抑制剂E-64处理同样也显示都不能抑制这种蛋白水解酶的活性。对该纯酶样品进行质谱鉴定分析，其结果显示该蛋白酶与谷胱甘肽还原酶有较好的同源性关系。另外，我们的研究还发现在其他植物(油菜，白菜，烟草，土豆，番茄)叶片中都有耐热蛋白水解酶的存在，且它们的分子量和小麦的相比也很相近。本课题研究和其结果为今后这种蛋白水解酶的抗体制备奠定了坚实的基础，更为能够深入地去研究了解这种耐热的蛋白水解酶在小麦叶片中的细胞定位、生理生化功能和在其它植物叶片中的普遍性及在衰老叶片内蛋白质彻底降解的机制等都奠定了一个良好而扎实的基础。
张志刚[10]2000年在《小麦叶片老化期间内肽酶与H_2O_2的关系以及小麦幼苗叶绿体间质内肽酶》文中认为本研究的主要目的在于通过对小麦叶片老化期间内肽酶与H_2O_2的关系以及小麦幼苗叶绿体间质内肽酶的研究，为进一步研究“H_2O_2在小麦叶片Rubisco降解中的作用”奠定基础。首先，建立了一种适用于植物材料的内肽酶同工酶检测方法—梯度凝胶电泳法，该方法灵敏度高，能检测到纳克级的蛋白水解酶；还可以利用该方法研究蛋白酶的类型，分子量及其活力大小；如果结合细胞器的提取，能够用于内肽酶的细胞定位研究。与目前国际上广泛使用的SDS-PAGE电泳相比，它的操作更加简单、方便，样品不需SDS处理，电泳后不需要复性蛋白水解酶，而且它的适用范围更广，尤其适用于我们所研究的植物材料。利用这种方法，研究了小麦叶片老化期间内肽酶与H_2O_2的关系。结果表明，小麦叶片老化期间，H_2O_2含量高的叶片中内肽酶活力也高；老化后期，内源H_2O_2迅速累积，内肽酶活力迅速上升。通过内肽酶同工酶电泳检测到新增一种内肽酶，其活力较强。外源H_2O_2处理全展旗叶的内肽酶粗液，随着H_2O_2浓度的升高，内肽酶活力先上升后下降。 为了进一步深入了解Rubisco在叶绿体中的降解情况，我们又对叶绿体蛋白水解酶进行了研究。通过内肽酶同工酶电泳确定了小麦幼苗叶绿体间质中存在两种内肽酶，分子量分别为66KD和54KD，其活力占内肽酶总活力的9.1％。放线菌酮、氯霉素处理结果表明，它们是由核基因编码的；抑制剂、激活剂的结果表明，它们是丝氨酸型蛋白酶。叶绿体粗提液中内肽酶的最适pH为7.5，最适温度为42℃，1mmol/L的ATP，DTT对其有明显的激活作用。
参考文献：
[1]. 小麦叶片衰老过程中内肽酶同工酶变化和特性及Rubisco降解的研究[D]. 芮琪. 南京农业大学. 2004
[2]. 黄瓜叶片衰老过程中内肽酶变化及其生化特性的研究[D]. 张鹏. 南京农业大学. 2006
[3]. 盐胁迫下不结球白菜幼苗叶片内肽酶同工酶变化及其生化特性研究[D]. 钟军华. 南京农业大学. 2008
[4]. 盐胁迫下小麦根系内肽酶同工酶的变化及生化特性和叶片Rubisco大亚基的降解[D]. 张颖. 南京农业大学. 2010
[5]. 一种与小麦叶片衰老相关的丝氨酸型蛋白酶的纯化及其生化特性鉴定[D]. 王任先. 南京农业大学. 2009
[6]. 黄瓜叶片生长期间内肽酶活性和同工酶变化及其生化特性[J]. 张鹏, 王飞, 张列峰, 徐朗莱. 南京农业大学学报. 2007
[7]. 盐胁迫下不结球白菜幼苗叶片内肽酶同工酶变化及生化特性研究[J]. 钟军华, 张颖, 卢之颖, 芮琪, 徐朗莱. 南京农业大学学报. 2009
[8]. 小麦叶片中与Rubisco大亚基降解相关的蛋白酶的生化特性、合成定位及分离纯化研究[D]. 陈晓. 南京农业大学. 2011
[9]. 暗诱导衰老小麦叶片内一种耐热蛋白水解酶的分离纯化及其生化特性鉴定[D]. 王晓媛. 南京农业大学. 2007
[10]. 小麦叶片老化期间内肽酶与H_2O_2的关系以及小麦幼苗叶绿体间质内肽酶[D]. 张志刚. 南京农业大学. 2000