新疆医科大学第一附属医院心脏外一科（830054）
基金项目：新疆维吾尔自治区自然科学基金重点项目，编号：2014211C060。
3、作者简介：艾斯卡尔·沙比提（1973—），男，新疆人，硕士，心脏外一科主任医师，副教授，硕士生导师。
通讯作者：哈木拉提·吾甫尔，新疆医科大学校长，博士后，博士生导师，主任医师，教授。
摘要：目的 异常黑胆质成熟疗法能否影响“退行性”硬化性主动脉瓣膜病的发展。方法 健康新西兰纯种雄性白兔100只,适应性喂养1周后,实验开始前处理20只，剩余80只随机分为4组，即正常对照组(N组)、高脂饮食组(HC组)、阿托伐他汀干预组(AI组)、异常黑胆质成熟剂干预组（MI组）。于0和8周末两点采血行血脂分析。在0,2,4,6,8周时间段，取出主动脉瓣膜标本，AFM下观察内皮细胞纳米结构。结果 HC组与N组相比，TG，TC，LDL，HDL测量结果均有明显差异，（P＜0.01）。MI组HC组相比，TG，TC，LDL，HDL的测量结果均有显著差异（P＜0.05）。AFM50um×50um扫描下HC组与MI组内皮细胞长径6周、8周均有明显差异（P＜0.01）。与HC组相比，MI组内皮细胞长径有明显差异（P＜0.01）。AFM500nm×500nm扫描下HC组内皮细胞表面隆起直径8周有明显差异（P＜0.01），高度6周，8周有明显差异（P＜0.01）。与HC组相比，MI组内皮细胞表面隆起直径8周有明显差异（P＜0.01），高度8周有差异（P＜0.05）。结论 随之时间的延长，高脂饮食组主动脉内皮细胞受到明显破坏而异常黑胆质成熟剂对内皮细胞起到保护作用。
关键词：退行性钙化性主动脉瓣膜病(DCAVD)；异常黑胆质成熟剂；原子力显微镜（AFM）；
主动脉瓣膜钙化可引起主动脉瓣狭窄、关闭不全等疾病，导致老年退行性瓣膜病的重要病理改变。西方国家整体人群中发病率达2.5%，严重危害患者生命安全，造成沉重的社会负担。由于除手术外缺乏有效的治疗手段，因此该探讨主动脉瓣瓣膜钙化的机制，研究阻断其病理过程进展的可能性已经成为近年来心脏外科医师关注的热点之一[1]。
AFM以其能够以高分辨率和简单制样方法观察生物样品的表面精细结构的特征,而在生物医学领域的应用逐渐广泛[2-4]。AFM是通过检测样品表面和针尖相互作用力的变化来获得样品表面信息的,便可获得样品表面起伏的结构图像[5]。
根据维吾尔医学体液论大量研究结果及研究发现异常黑胆质成熟剂具有抗氧化、抗钙盐沉积、抗炎、免疫调节、抗血小板聚集、改善血液流变学和抗血栓形成的功效[6]。故本研究组认为同过异常黑胆质的调整血粘度，抗钙盐沉积，抗炎，抗氧化等作用，利用AFM证实，成熟剂疗法能否影响“退行性”硬化性主动脉瓣膜病的发展，从而达到延缓疾病的发展。
材料与方法
1、药品与试剂 阿托伐他汀（辉瑞制药有限公司，国药准字H20051408，产品批号L27840）。异常黑胆质成熟剂 异常黑胆质成熟剂是由破布木果、牛舌草、铁线蕨、刺糖、蜜蜂花、熏衣草、地锦草等药物组成[7]。根据异常黑胆质的成熟剂和清除剂及其制备方法及质控标准严格按照专利号C082130082．8。
高脂饮食 按文献报道方法，家兔86.5%标准饲料配方中添加1%胆固醇，7.5%蛋黄粉，5%猪油，按动物体重5%给予。
Anti-CD68单克隆抗体、CD3单克隆抗体、CD31单克隆抗体、骨桥蛋白(Osteopontin，OPN)单克隆抗体等由新疆乌鲁木齐欧易生物医学科技有限公司提供。
2、技术服务与主要仪器 血脂分析由新疆医科大学第一附属于医院检验科提供。原子力显微镜上海复旦大学纳米研究所提供，型号：Bruker Dimension Icon。
3、动物来源 由新疆维吾尔自治区医学实验动物中心提供，并经自治区医学实验动物中心委员会认证和批准。
4、分组及给药 健康新西兰纯种雄性白兔100只,体重1.8一2.4千克,适应性喂养1周后,实验开始前处理20只，剩余80只随机分为4组，即正常对照组(N组):20只,喂饲普通颗粒兔饲料;高脂饮食组(HC组):20只,予高脂饮食喂养;高脂饮食加阿托伐他汀干预组(AI组):20只,高脂饮食喂养同时予阿托伐他汀(4mg/kg.d)灌胃；高脂饮食加异常黑胆质成熟剂组（MI组）：20只，高脂饮食喂养同时予异常黑胆质成熟剂5.069/kg(5.0g成熟剂溶于1ml蒸馏水中,生药量17.16g/kg) 灌胃；药物用蒸馏水配成溶液后以灌胃方式,每日给药一次。所有动物均自由饮水。并分别于实验开始及第2、4、6、8周末5个时间点,各测兔体重一次,以观察其生长情况并调整饲料及药物剂量。
5、实验方法 1）0周与8周采动物血清行血脂分析。2）分别在0,2,4，6,8周取出主动脉瓣膜，按照原子力显微镜生物标本制备方法制作标本，分别在50μm×50μm和500nm×500nm扫描范围下观察主动脉瓣膜[8]。
6、观察指标 1)采用酶法用全自动生化分析仪检测血浆中胆固醇(TG)，甘油三脂(TC)，低密度脂蛋白(LDL)，高密度脂蛋白(HDL)浓度。2）分别在AFM50μm×50μm和500nm×500nm扫描范围下，观察及测量主动脉内皮细胞长径，短径，高度，细胞表面隆起直径及高度。
6、统计方法 利用SPSS统计软件(19.0版本),各组数据以均数±标准差（）表示,组间比较采用单因素方差分析，当P<0.05时,差异具有显著性的统计学意义。
结果
生长发育情况
各组兔体重随实验进展都有所增加,但各组之间无明显差别,各组兔生长发育情况基本相同,说明饲高脂饮食和阿托伐他汀干预及异常黑胆质成熟剂干预对兔生长发育未明显影响。
血脂各项指标的变化
N组血脂在实验前后无明显变化,HC组血脂水平8周末时,较实验前均明显升高;同期AI组与MI组各项血脂水平均明显低于HC组(p<0.05)（表1）。
原子力显微镜
1.HC组,AI组及MI组主动脉瓣膜基底部内皮细胞表面结构影响的AFM观察
1.1 AFM扫描范围为50μmX50μm时,主动脉瓣膜基底部内皮细胞形态的观察
随着高脂饮食时间延长,当AFM在瓣膜基底部的扫描范围为50μmX50μm时,与N组相比,HC组内皮细胞从栅栏状排列逐渐改变为无序排列过渡,并结构完全消失,形状多呈短梭形,有些呈团块状融合(图4,Ba,Bb,Bc,Bd)。AI组(图4,Ca,Cb,Cc,Cd)与MI组(图4,Da,Db,Dc,Dd)内皮细胞排列在第2，4,6，8周后,排列轻度的紊乱，但基本保持栅栏状形状。各组内皮细胞形态比较见表2。
1.2 AFM扫描范围为50μm×50μm时,主动脉瓣膜基底部内皮细胞表面结构的测量
HC组内皮细胞的长径均较相应时段N组明显变短(P<0.05),并随高脂饮食时间延长而逐渐缩短。在第6，8周末,AI组与MI组内皮细胞长径均较相应时段HC组明显变长(P<0.01)。各组内皮细胞长径测量值表3。
各组内皮细胞短径及高度在不同时段变化均无差异，表4、表5。
1.3 AFM扫描范围为500nmX500nm时,主动脉瓣膜基底部内皮细胞表面结构的观察
当AFM在扫描范围为500nmx5O0nm时,随着高脂饮食时间延长,与N组相比,HC组内皮细胞表面密集的球形隆起结构逐渐融合，疏松，结构紊乱。时间越长，变化越明显，8周后,HC组内皮细胞表面球形隆起结构基本消失,仅残余几个较N组明显增宽,且相互融合的不规则球形隆起结构(图5一Ba,Bb,Bc,Bd)。与相应时段HC组相比，Al组(图5一Ca,Cb,Cc,Cd)与MI组(图5一Da,Db,Dc,Dd)内皮细胞表面球形隆起结构明显恢复，但与N相比相互融合明显，排列疏松，隆起之间空隙较多。各组形态比较见表6。
1.4 AFM扫描范围为50Onmx500nm时,主动脉瓣膜基底部内皮细胞表面结构的测量
HC组内皮细胞表面球形隆起直径在8周后,才较相应时段N组显著增宽(P<0.01)。AI组内皮细胞表面球形隆起直径8周后,较HC组明显减小(P<0.01),而与对照组无显著性差异。与HC组相比，AI组与MI组内皮细胞表面的球形隆起直径8周后有明显差异（P<0.01）而与对照组无显著性差异。各组内皮细胞表面的球形隆起直径测量值表7。
HC组内皮细胞表面球形隆起高度4周开始相应时段N组明显降低(P<0.01),AI组与MI组内皮细胞表面球形隆起高度在第8周时,较相应时段HC组显著升高(P<0.05)。各组内皮细胞表面球形隆起高度测量值见表8。
讨论
临床流行病学研究发现DCAVD与动脉粥样硬化之间存在相似的危险因素并以高血压和冠心病患者中检出率最高。因此,可以推断两者之间可能在发病机制上具有相似性,并且DCAVD可能与动脉粥样硬化一样,能够通过早期药物干预得到治疗[8]。现在研究逐步明确该过程是一种脂质代谢紊乱导致瓣膜结构改变的过程。可能是在一系列同样与动脉粥样硬化有关潜在的危险因素作用下,瓣膜内皮细胞损伤，细胞形态及结构的改变，暴漏主动脉瓣内皮下间质部，起到主动脉瓣膜进一步损伤。所以通过本研究观察主动脉内皮细胞结构改变探讨DCAVD发生和发展过程的起始点。
维吾尔医学认为体液是人体中各种营养物在肝脏中形成的，能被机体所转化，为生命活动赋予力量，并适于人类本性的复杂液体的总称。根据维吾尔医学体液论，异常体液中异常黑胆质体液是导致体液物理性质的改变（分量变重、温度下降、粘性变稠等）从而引起体液流速变慢，易在血管壁产生沉淀，血管壁增厚及弹性减弱，血管腔狭窄。血管壁产生的沉淀物还可作为新的刺激源继续刺激血管壁，加重血管壁组织、细胞功能的受阻，继而导致动脉粥样硬化、高血压、冠心病等心血管疾病[9-10]。
AFM以其能够以高分辨率和简单制样方法观察生物样品的表面精细结构的特征,而在生物医学领域的应用逐渐广泛。因此本研究拟通过AFM,对主动脉瓣膜内皮细胞及其表面纳米超微结构的影响,寻找高脂血症致主动脉瓣膜内皮细胞改变,可能参与DCAVD早期病变的形态结构基础。
本实验发现高脂饮食组血脂TG，TC，LDL，HDL显著升高，阿托伐他汀干预组及异常黑胆质成熟剂干预组血脂相对高脂饮食组血脂各项指标明显降低。
AFM扫描下同一主动脉瓣膜不同解剖部位内皮细胞排列和表面超微结构有差异,本实验主动脉瓣膜基底部，中间部，尖部等不同部位的观察可知有明显的差异，结果同以往相同实验结果[11]，所以本实验观察主动脉瓣膜基底部内皮细胞表面结构的影响,将为推测提供证据。
用AFM不同扫描范围下观察，发现正常组主动脉基底部细胞排列更为紧密规则。基底部内皮细胞表面隆起大小相对均匀。高脂饮食组主动脉内皮细胞长度随时时间的延长，逐渐缩短，相互融合，甚至部分缺损。内皮细胞表面隆起数量逐渐减少，直径变大，高度降低，隆起间隙互相融合成片状。阿托伐他汀及异常黑胆质干预组与高脂饮食组相比，主动脉内皮细胞长度明显长，主动脉瓣膜内皮细胞表面隆起数量明显增多，直径及高度基本接近正常组，隆起间隙未见融合成片状。通过AFM形态学观察及增量值的比较，我们可推断，阿托伐他汀及异常黑胆质成熟剂能够保持主动脉内皮细胞的基本正常结构。
通过各项指标相比，异常黑胆质成熟剂能够降低血脂水平，主动脉瓣内皮细胞结构基本接近正常，内皮细胞表面隆起结构完整。综上所述，本研究组认为随之时间延长，高脂饮食组主动脉内皮细胞受到明显破坏而异常黑胆质成熟对内皮细胞起到保护作用。
参考文献
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论文作者:作者：第一作者：艾斯卡尔·沙比提，第二：艾力·艾比不拉，第三
论文发表刊物:《中华急诊医学杂志》2016年6月
论文发表时间:2016/12/9
标签：内皮论文; 主动脉论文; 细胞论文; 瓣膜论文; 表面论文; 结构论文; 异常论文; 《中华急诊医学杂志》2016年6月论文;