（南阳医学高等专科学校 河南 南阳 473061）
【摘要】目的：构建NR4A2真核细胞瞬时表达载体。方法：设计带有酶切位点的NR4A2引物，采用PCR法从NR4A2基因载体中扩增目的基因，经限制性酶切后与目的载体连接，转化感受态细胞。挑取阳性克隆，分别采用PCR法和测序法进行验证。结果：成功构建具有NR4A2表达序列的慢病毒质粒。
【关键词】NR4A2；过表达；慢病毒质粒
【中图分类号】R329.26 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2017）28-0138-02
炎症反应与疾病相关，在动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)的进展过程中似乎起主要作用，人们已认识到致AS的主要危险因素包括吸烟、高血压、致AS脂蛋白和高血糖等均是通过激发血管的炎症反应，促进AS的形成，目前普遍认为AS以是以血管内皮细胞（VEC）受损、功能障碍为起始的慢性炎症反应过程[1,2]。
核受体家族是一组能在生物体内调控发育、代谢、炎症和免疫等多种生物作用的转录因子，NR4A2是孤儿核受体中的一员，作为立早基因产物，与NOR1、Nur77组成Nur-7孤儿核受体超家族，孤儿核受体超家族在基因结构编排如内含子和外显子数量和种族方面有高度的同源性和保守性[3,4]。到目前为止，孤儿核受体尚未发现明确的配体，能以单体形式与相应DNA序列或与视黄醛X受体结合为异二聚体激活DNA的转录。近年发现，3种NR4A孤儿受体在动脉粥样硬化病变中均有表达，并被认为是在血管疾病中调节基因表达的关键转录因子之一。
本研究本通过对NR4A2基因进行改造，构建真核细胞瞬时表达载体，为深入了解该基因在动脉粥样硬化中的调控机理打下基础。
1.材料方法
1.1 材料
NR4A2基因载体购自上海恒大生物科技有限公司，载体pHBLV-CMV-IRES-ZsGreen购自Hanbio，大肠杆菌菌株DH5α购自Invitrogen，限制性内切酶和DNA ladder 购自Fermentas，One Step Cloning Kit购自南京诺唯赞生物科技有限公司，质粒DNA小、大量抽提试剂盒购自康为世纪，凝胶回收试剂盒购自Axygen，琼脂糖，琼脂粉等购自上海生工。
1.2 慢病毒表达载体
目的片断插入pHBLV-CMV-IRES-ZsGreen载体MCS区，由CMVIE启动子调控表达，CMVIE启动子启动IRES和ZsGreen的共表达。
1.3 引物设计与合成
根据NCBI human NR4A2基因序列，分别设计上、下游引物：h-NR4A2-Xho-Xba-F：ATTTCCGGTGAATTCCTCGAGGCCACCATGCCTTGTGTTCAGGCG；h-NR4A2-Xho-Xba-R：GGATCCGCGGCCGCTTCTAGAGAAAGGTAAAGTGTCCA，引物由上海生工合成。
1.4 重组表达载体的构建与鉴定
pHBLV-CMV-IRES-ZsGreen载体用XhoI、XbaI酶切，反应体系为40ul，37度2小时左右，载体酶切完成后胶回收。PCR扩增NR4A2序列，采用50ul反应体系，PCR反应条件为：95℃ 5min，94℃ 20sec，55℃ 20sec，72℃ 1.5min，循环25次，72℃ 10min。扩增产物用XhoI、XbaI酶切后胶回收。处理好的目的片段与载体在重组酶反应体系，于37℃温育30min进行连接。反应产物转化感受态细胞DH5a，Amp抗性37℃培养过夜。转化后的NR4A2平板挑菌，37℃ 250转/分钟摇菌14小时，用菌液进行PCR鉴定，将阳性克隆菌液送测序公司测序。
2.实验与分析
2.1 NR4A2基因扩增
NR4A2基因载体经PCR扩增，琼脂糖电泳分析发现，在1500和2000bp bp间可检测到清晰的目的条带，与预期结果一致。
2.2 NR4A2单克隆PCR结果
阳性克隆菌液，经PCR扩增，琼脂糖电泳分析发现，在2000～2500bp间左右可检测到清晰的目的条带，与预期结果一致。PCR引物为载体上设计的通用引物，PCR产物比目的基因大300bp左右。
2.3 NR4A2克隆载体测序结果
NR4A2克隆载体的测序结果
与NR4A2原始序列进行比对（灰色区域为与目的序列匹配部分，方框部分为3×Flag序列），结果表明无碱基突变，编码的氨基酸一致，证明目的基因已成功插入且位置正确，重组表达载体构建成功（见图1）。
图1 NR4A2阳性克隆测序结果比对
3.讨论
质粒pHBLV-CMV-IRES-ZsGreen属于慢病毒系统载体，慢病毒是在宿主体内能够引起慢性病的一种逆转录病毒，其感染细胞具有感染效率高、整合度高的特点。使用慢病毒感染载体可使目的基因在真核细胞内持续稳定表达，并有效抑制基因沉默。本试验选择pHBLV-CMV-IRES-ZsGreen质粒作为NR4A2基因转染真核细胞的载体，以CMV启动子调控基因转录，绿色荧光蛋白为标记基因，在NR4A2基因两侧插入XhoI和XbaI酶切位点，通过基因克隆及测序鉴定，获得正确的NR4A2重组真核细胞瞬时过表达质粒，为后续研究NR4A2参与动脉粥样硬化的机制打下基础。
【参考文献】
[1] Glass CK,Witztum JL.Atherosclerosis:the road ahead. Cell,2001;104(4):503-516.
[2] Libby P.Inflammation in atherosclerosis.Nature, 2002;420(6917):868-874.
[3] Chen YH,Lin SJ,Ku HH et al.Salvianolie acid B attenuates VCAM-1 and ICAM-1 expression in TNF-alpha-treated human aortic endothelial cells[J].Cell Blochem,2001;82:512-521.
[4] Chawla A,Repa JJ,Evans RM,et al.Nuclear receptors and lipid physiology:opening the X-files.Science, 2001;294(5548):1866-1870.
论文作者:张东献,陶俊良,张伟,满永宏
论文发表刊物:《医药前沿》2017年10月第28期
论文发表时间:2017/10/24
标签：基因论文; 载体论文; 目的论文; 质粒论文; 受体论文; 引物论文; 序列论文; 《医药前沿》2017年10月第28期论文;