李丁洋[1]2016年在《缺血预处理和远端缺血期处理对肝移植缺血再灌注损伤的保护作用》文中认为第一部分小鼠原位肝移植模型的建立和评价目的:建立成熟稳定的非动脉化的小鼠原位肝移植模型,并对肝移植模型进行评价,为后续相关实验奠定基础,亦为欲建立小鼠原位肝移植模型的研究者提供经验支持和技术参考,以快速、平稳、安全地渡过学习瓶颈期。方法:单人操作,采用双袖套法和支架法行非动脉化的小鼠同种异体原位肝移植术,详细记录供受体手术时间、无肝期、肝上下腔静脉吻合时间、存活时间等指标,并探查死亡原因。手术方法定型后选用80对B6小鼠进行模型评价,前6组(每组10例)分别于术后第1天、3天、5天、7天、1个月、2个月行组织病理学检查和肝功检测,第7组(共20例)进行远期存活率监测。结果:建立模型过程中共行小鼠原位肝移植手术1074例,其中前541例主要用于锻炼操作技能和积累围手术期管理经验,之后453例主要为熟练定型阶段。学习曲线表现为随着练习次数的增加,供受体手术时间、无肝期、肝上下腔静脉吻合时间均呈递减趋势,手术成功率和存活时间亦相应得到改善,但整体变化非常平缓。建模初期小鼠死亡原因多为无肝期过长、供体灌注不良、肝上下腔静脉和肝下下腔静脉吻合口出血,后期死亡原因主要为胆道并发症。模型评价阶段,无肝期为17.4±2.3min,SHVC吻合时间为11.0±1.3min,手术成功率为96.3%(77/80),术后第1天、第3天、第5天、第7天、1个月、2个月和3个月的存活率分别为95%(19/20),95%(19/20),90%(18/20),85%(17/20),75%(15/20),60%(12/20)和35%(7/20)。ALT和AST在术后第叁天达到峰值,肝脏病理学改变最为明显。结论:在大量的练习和不断的摸索、尝试后成功建立了小鼠原位肝移植模型,熟练的显微外科操作技术是首要条件,手术的难度在于操作的复杂性和手术步骤的严格时限,手术的关键在于麻醉、供肝的灌注和保存、套管技术和无肝期的精准把控。术后肝脏组织病理学和肝功变化规律为下一步研究缺血预处理和远端缺血期处理对小鼠原位肝移植后缺血再灌注损伤的保护作用提供了实验依据。第二部分缺血预处理和远端缺血期处理对小鼠肝移植缺血再灌注损伤的保护作用及其机制目的:观察远端缺血期处理对小鼠肝移植缺血再灌注损伤是否具有保护作用,比较缺血预处理和远端缺血期处理对小鼠肝移植缺血再灌注损伤保护作用的强度,并探究二者联合应用是否能产生迭加的保护作用及可能存在的作用机制。方法:160只健康成年雄性B6小鼠随机分成4组:假处理组(sham组,n=40):仅行小鼠原位肝移植术,无任何特殊处理;2缺血预处理组(IPC组,n=40):供体开腹后游离肝脏,用显微血管夹夹闭小鼠肝动脉和门静脉10分钟,开放15分钟后,进行供肝的获取;3远端缺血期处理组(RIPer组,n=40):受体麻醉后,在肝脏再灌注前用显微血管夹对小鼠两侧股血管束反复进行5分钟夹闭、5分钟开放,共3个循环;4联合应用缺血预处理和远端缺血期处理组(IPC+RIPer组,n=40):供体行缺血预处理,受体行远端缺血期处理。各组小鼠分别于再灌注后2小时、24小时和72小时切取肝脏行组织病理学检查、TUNEL染色、F4/80免疫组化染色、MDA水平检测、GSH-Px水平检测、ICAM-1 m RNA、Bcl-2 m RNA及Bax m RNA水平检测、NF-κB p65蛋白表达水平检测,并从下腔静脉取血检测血清ALT、AST、TNF-α、NOx水平,流式分析外周血白细胞表面抗原CD11b、CD16/32和F4/80的表达情况。结果:虽然各组间小鼠术后存活率无统计学差异,但是与sham组相比,叁个处理组小鼠术后的ALT、AST、MDA、TNF-α、ICAM-1 m RNA、NF-κB p65蛋白水平、Suzuki评分、凋亡指数、肝脏组织中F4/80阳性细胞比例、CD11b+和F4/80+细胞在白细胞中的比例、CD11b+CD16/32+细胞和CD11b+CD16/32high细胞在CD11b+细胞中的比例上升幅度均较小,而GSH-Px、NOx以及Bcl-2 m RNA/Bax m RNA比值则有所提升(P<0.05)。在移植术后早期(2h),IPC组和RIPer组在ALT、TNF-α、GSH-Px、NOx和肝脏组织F4/80阳性细胞比例等方面有统计学差异。除Suzuki评分、Bcl-2 m RNA/Bax m RNA比值、F4/80+细胞在白细胞中的比例外,其他指标均在不同的时间点显示IPC组和RIPer组均与IPC+RIPer组有显着性差异(P<0.05)。结论:本实验采用的远端缺血期处理策略可以对小鼠原位肝移植缺血再灌注损伤发挥有效的保护作用。在移植术后早期(2h),远端缺血期处理对小鼠原位肝移植IRI的保护作用弱于IPC,然而后期两者的保护效力无明显区别。提示远端缺血期处理同缺血预处理一样,亦有两个保护时间窗,而在第一保护时间窗内抑制库弗细胞活化、调整微循环障碍及抗氧化作用较弱导致其保护效力较弱。联合应用缺血预处理和远端缺血期处理可以在抗氧化应激、抗凋亡、调整微循环障碍、抑制固有免疫反应方面产生迭加作用,从而进一步加强对小鼠原位肝移植缺血再灌注损伤的保护作用。
吕国庆, 单庆顺, 刘秉义, 舒振波[2]1999年在《缺血预处理对大鼠肝脏缺血再灌注损伤的保护作用》文中指出目的：探讨缺血预处理（ＩＰＣ）对肝脏缺血再灌注损伤的保护作用及其机理。方法：采用大鼠部分肝脏原位缺血再灌注损伤模型，随机分成：①正常对照组，不作肝门阻断；②再灌注对照组：进行４５ ｍ ｉｎ 的肝门阻断及６０ ｍ ｉｎ 的再灌注；③预处理组：４５ ｍ ｉｎ 的肝门阻断前先进行５ ｍ ｉｎ 肝脏缺血及５ ｍ ｉｎ再灌注。②、③组均在６０ ｍ ｉｎ 再灌注完成后取血及肝组织标本检测肝功、ＮＯ、超氧化物歧化酶（ＳＯＤ）、丙二醛（ＭＤＡ）及肝组织病理改变。结果：预处理组与再灌注对照组比较，肝功能明显改善，ＳＯＤ、ＮＯ 含量升高，ＭＤＡ 明显降低，两组比较差异显着。结论：缺血预处理对肝脏缺血再灌注损伤有明显保护作用，可能与提高内源性ＮＯ水平、清除氧自由基抑制脂质过氧化反应有关
孙勇[3]2009年在《肠缺血预处理对大鼠肝脏缺血再灌注损伤的保护作用》文中指出目的:肝脏缺血再灌注损伤常见且发生机制复杂。大鼠肝门阻断(Pringle’s法),带来了严重的肠道淤血和粘膜屏障破坏,加重了肝脏缺血再灌注损伤;近期发现,通过对下肢、肠等缺血预处理可以减轻心肌的缺血再灌注损伤。本实验拟建立稳定的大鼠缺血再灌注模型(Pringle’s法),对肠进行缺血预处理,研究大鼠的肠缺血预处理是否对肝脏的缺血再灌注损伤(HIRI)有远端保护作用及其可能的作用机制。方法:30只清洁级雄性SD(Sprague-Dawley)大鼠随机分为叁组,假手术组(Sham组)剖腹后仅做肝门分离;缺血再灌注组(IR组)采用肝门阻断法(Pringle’s法)使肝脏缺血30min,然后再灌注120min,建立大鼠的肝脏缺血再灌注模型;远端预处理组(RIPC组)剖腹后阻断大鼠肠系膜上动脉10min,再灌注10min,然后步骤同IR组。再灌注120min后各组分别取大鼠门静脉血,离心得血清检测丙氨酸氨基转移酶和天门冬氨酸氨基转移酶(ALT、AST);取大鼠门静脉血清用显色基质鲎试剂(试管法)检测血清内毒素含量;取肝、肠组织分别甲醛固定后行光镜下病理学检查;取肝、肠组织匀浆作MPO活性测定;取肝组织作免疫组化TNF-α和ICAM-1测定。结果:①缺血再灌注组(IR组)较假手术组(Sham组)血清ALT、AST、内毒素升高(P<0.05);②缺血再灌注组(IR组)肝和肠组织病理学上的损伤评分均较假手术组(Sham组)升高,同时MPO活性也较高(P<0.05) ;③缺血再灌注组(IR组)的肝组织内TNF-α和ICAM-1表达明显增加;④远端预处理组(RIPC组)较缺血再灌注组(IR组)血清ALT、AST、内毒素减少(P<0.05);⑤远端预处理组(RIPC组)肝和肠组织病理学上的损伤评分均较缺血再灌注组(IR组)降低,同时MPO活性也较低(P<0.05) ;⑥RIPC组的肝组织内TNF-α和ICAM-1表达明显减少。结论:通过阻断大鼠肠系膜上动脉对肠进行缺血预处理可以发挥远端预处理作用,减轻肝脏的缺血再灌注损伤;其可能的作用机制为:远端预处理激活了内源性保护机制,减少了肝脏的前炎性因子表达,使中性粒细胞的粘附聚集减少,从而减轻了组织损伤。
虞朝辉[4]2008年在《基于蛋白质组学技术和miRNA表达谱技术的缺血预处理对肝脏缺血再灌注损伤作用机理研究》文中提出缺血预处理(ischemic preconditioning,IPC)可以启动某些内源性的保护机制,减轻肝脏缺血再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)损伤,但IPC具体的保护机制目前尚未完全明确。本研究将筛选合适的对C57BL/6小鼠肝脏I/R损伤运用有保护作用的IPC方案,运用蛋白质组学的研究方法,旨在分析IPC对肝脏I/R损伤后蛋白表达的影响并进一步寻找其可能的机制,以及运用miRNA表达谱技术,大规模检测肝脏I/R损伤过程和IPC处理措施对肝脏miRNA表达的变化,探讨其变化规律,揭示其内在联系,为深入认识IPC的保护机制提供理论依据。第一部分不同缺血预处理方案对小鼠肝脏缺血再灌注损伤的影响方法将56只雄性C57BL/6小鼠随机分为假手术组、I/R组和缺血2 min/再灌注10 min(IPC2/10组)、缺血5 min/再灌注10 min(IPC5/10组)、缺血10 min/再灌注10 min(IPC10/10组)、缺血15 min/再灌注10 min(IPC15/10组)、缺血20 min/再灌注10 min(IPC20/10组)和缺血30 min/再灌注10 min(IPC30/10组)等6种不同IPC方案每组7只;比较各组小鼠肝脏I/R后血清丙氨酸氨基转移酶、天门冬氨酸氨基转移酶及肝脏病理学变化,以判断肝脏损伤情况并由此比较不同方案的IPC对肝脏I/R损伤的影响。结果I/R组血清丙氨酸氨基转移酶、天门冬氨酸氨基转移酶明显高于假手术组(分别为2547.1 U/L±307.1 U/L比97.9 U/L±9.4 U/L,2814.3 U/L±187.6 U/L比481.6 U/L±36.8 U/L,均有P＜0.01);肝脏病理学改变也明显重于假手术组,主要表现为严重的肝窦淤血、肝小叶结构紊乱等。与I/R组相比,方案为缺血10min/再灌注10min的IPC10/10组的血清丙氨酸氨基转移酶(1174.3 U/L±217.8 U/L)和天门冬氨酸氨基转移酶(1714.3 U/L±197.9 U/L)明显降低(均有P＜0.01),肝脏病理学改变也明显改善;其余方案的IPC无明显的保护作用。结论不同方案的IPC对小鼠肝脏I/R损伤的影响存在差别,其中方案为缺血10min/再灌注10min的IPC可以明显减轻肝脏I/R损伤。第二部分缺血预处理对肝脏缺血再灌注损伤后蛋白表达影响的研究方法1、雄性SPF级C57BL/6小鼠、体重21-25g,购白海斯莱克实验动物有限责任有限公司[实验动物许可证号:SCXK(沪)2003-0003]。于浙江省医学科学院实验动物中心屏障系统实验室饲养[实验动物许可证号:SYXK(浙)2003-0001]。实验前适应性饲养1周,术前12小时开始禁食但不禁水。2、将所有小鼠按体重随机分为假手术组(n=6)、缺血再灌注组(n=6)、缺血预处理组(n=6)。相应处理如下:假手术组:麻醉、开腹、局部组织游离、关腹,但不阻断肝脏血流。缺血再灌注组:予以肝左叶和中叶缺血75分钟/再灌注120分钟。缺血预处理组:在肝左叶和中叶缺血75分钟之前,预先给予缺血10分钟/再灌注10分钟的缺血预处理,而后操作同缺血再灌注组。3、观察各组术后血清ALT、AST,肝组织于10%中性福尔马林固定后、常规脱水、石蜡包埋、切片、HE染色、光镜观察肝脏病理学改变。并按Saidi等提出的肝脏病理评分标准,对肝脏损伤程度进行病理评分,具体标准如下:0度(正常肝脏),即几乎没有肝脏损伤的迹象;1度(轻度),包括胞浆空泡化、局灶性核固缩等;2度(中、重度),包括弥漫性核固缩、肝细胞边界模糊、肝窦淤血明显等;3度(极重度),包括严重的肝细胞坏死、肝索结构模糊、严重的肝窦淤血、中性粒细胞聚集等。4、分别将假手术组、I/R组、IPC组的肝组织置于液氮中,用液氮预冷的研钵研磨至粉末状,0.1g/管分装,充分裂解30min,40 000g 15℃离心1h去除不溶物质。小心吸取上清液,用Bradford法进行蛋白定量。从管中取出435μl复水液,加入蛋白样品15μl(约150μg)混匀,进行等电聚焦电泳,设置等电聚焦程序:30V~*6h,60V~*7h,200V~*1h,500V~*1h,1 000V~*1h,8 000V~*1.5 h,8 000V(60 000 V h),500V~*3h维持,聚焦结束的胶条,立即进行平衡;行SDS-PAGE电泳,设置电泳程序:S1:15mA/gel~*1h,S2:30mA/gel。将电泳后的凝胶置于固定液(10%乙醇,7%乙酸)中2h,蒸馏水洗3次,将胶置于胶体蓝染液(0.12%考马斯亮蓝G250,10%硫酸胺,10%磷酸,20%甲醇)中2h,用蒸馏水脱色至点清晰。5、染色后的凝胶经imageScanner(GE healthcare)扫描,生成的图像文件在PDQuest软件中分析。每张胶图经自动点检测和手工校对后,以其中一张胶为master胶进行胶图之间的匹配。用student's t-test筛选2倍以上有统计学意义的差异点。6、用解剖刀将差异蛋白点从胶上切下来,并切成1-2 mm~2大小的胶片放入1.5ml离心管中;蛋白酶切和提取后,进行质谱鉴定。7、ATP5B蛋白和BHMT蛋白表达通过Western blot进行检测。8、采用反相离子对高效液相色谱法检测肝脏ATP含量。结果I/R组血清ALT、AST均明显高于假手术组(均有P＜0.01);肝脏病理学改变也明显重于假手术组,主要表现为肝窦严重淤血、肝细胞肿胀等。与I/R组相比,IPC组血清ALT、AST明显降低(均有P＜0.01),肝脏病理学改变也明显改善。缺血再灌注组的肝脏蛋白与假手术组比较,具有统计学差异的蛋白差异点,上调的蛋白有3个,下调的蛋白有20个;参与代谢的有13个,氧应激的有5个,信号通路的2个,及其它3个蛋白(详见表3)。IPC组的肝脏蛋白与缺血再灌注组的表较,上调的蛋白有8个,下调的蛋白有8个。参与代谢的有10个,氧应激的有1个,信号通路的3个,及其它2个蛋白(详见表4)。其中在2个过程中均有明显变化的是ATP合成酶亚单位B(ATP5B)、Betaine-homocysteine S-methyltransferase(BHMT)、Transthyretin(TTR)、Majorurinary protein 6(MUP6)等4个蛋白,其中I/R过程中ATP5B、BHMT和MUP6减少,TTR增加;反之,IPC组ATP5B、BHMT和MUP6增加,TTR减少。Western blot结果显示,与2-DE结果一致,I/R组肝脏ATP5B表达与内对照GAPDH的比值较假手术组明显下降(0.643±0.068 vs 1.525±0.063,P＜0.01),而IPC组ATP5B表达(1.063±0.058)较缺血再灌注组明显上升(P＜0.01)。I/R组肝脏BHMT表达与内对照GAPDH的比值较假手术组下降(0.993±0.156vs1.636±0.381,P=0.167),而IPC组ATP5B表达(1.382±0.285)较I/R组上升(P=0.247)。肝脏ATP含量变化趋势与ATP5B表达水平变化趋势一致,I/R组的肝脏ATP含量为17.04 ng/mg±0.85 ng/mg,与假手术组(23.39 ng/mg±1.16ng/mg)相比,差异具有非常显着性(P＜0.01);与I/R组相比,IPC组肝脏ATP含量为22.59 ng/mg±2.02 ng/mg,差异具有显着性(P＜0.05)。结论1、肝脏I/R过程,上调的蛋白有3个,下调的蛋白有20个;IPC组的肝脏蛋白与I/R组的表较,上调的蛋白有8个,下调的蛋白有8个。2、IPC与I/R两个过程中均有明显变化的是ATP5B、BHMT、TTR和MUP6等4个蛋白,其中I/R过程中ATP5B、BHMT和MUP6减少,TTR增加;反之,IPC组ATP5B、BHMT和MUP6增加,TTR减少。3、IPC可能通过增加ATP5B的表达,使肝组织ATP的含量增加,从而发挥其肝脏保护作用。4、BHMT及其催化的甲基代谢可能在IPC对I/R损伤的保护机制中发挥着重要作用。5、TTR可能在I/R损伤和IPC中发挥重要作用。第叁部分缺血预处理对肝脏缺血再灌注损伤后miRNA表达谱影响的研究方法1、肝脏标本的制备具体过程详见第二部分的缺血再灌注损伤和缺血预处理保护作用的肝脏制备,每组随机选择3个样本进行miRNA表达检测。2、分别将假手术组、I/R组、IPC组的肝组织置于液氮中,取出黄豆大的肝脏组织样品,加入1ml的TRIZOL试剂,进行匀浆,将混匀后溶液移至一新Eppendorf管中,加入200μl氯仿,振荡混匀;将离心后上清液移至一新Eppendorf管中,加入500μl异丙醇,轻轻混匀,室温静置15min;离心后倒掉上清液,加入1ml 75%乙醇,振荡混匀;再次离心后倒掉上清液,并在超净台中将乙醇挥发干净;加入40～60μl DEPC H2O,65℃5min助溶;紫外吸收法测定RNA浓度和纯度,1.5%甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量;样品于-70℃冷冻保存。3、用miRCURYTM Array Labelling kit标记miRNA,并采用RNeasy MiniKit浓缩标记样品。用miRCURYTM Array microarray kit进行miRNA芯片杂交,使用Genepix 4000B进行图像扫描,使用635nm激发。图像存成TIF文件,使用Genepix Pro 6.0分析数据,分析结果导出,最终用EXCEL文件表示。4、由Axon microarray scanner扫描并由genepix Pro软件读值获得各个点的原始信号值和减掉背景的修正值。在每张芯片上,修正值都＞=50,且非control的探针做标准化,求这部分探针中值作为标准化因子对整张芯片的点做标准化处理获得各个点的标准值,应用标准值进行相互比较获得差异表达探针。去除可能不可信的属于不准确数值结果即修正值＜50的探针。用student's t-test筛选有统计学意义差异的信号标准值。5、分别将有统计学意义的差异表达miRNA,用miRanda对其进行靶基因的预测,把预测的靶标合并,提交GOTermfinder(http://go.princeton.edu/)进行GO显着性分析。用TargetScan和PicTar等预测软件预测靶基因,并在网络上比对搜索有明确生物学意义调控的靶基因,并行聚类分析,建立基于基因功能的模块。结果1、与假手术组比较,I/R组的肝脏miRNA表达上升的有47个,下降的有58个;而IPC组的肝脏miRNA与I/R组相比,下调的有10个。2、功能分析提示,这些miRNA参与了生物调节、细胞进程、发育过程、定位的建立、代谢过程等病理生理过程。3、mmu-miR-346_MM1、miRPlus_17905、mmu-miR-370、mmu-miR-326和mmu-miR-23a等5个miRNA在肝脏I/R损伤和IPC时发生了相反的变化(在I/R损伤后表达上调,经IPC处理后又下调),主要的靶基因涉及DNA依赖的转录调控和转录两大块,其中以miR-370的变化最为显着。4、生物信息学分析提示,在差异表达的miRNA调控的基因中,差异表达的蛋白有TTR、HMGCS2、ALDH6a1、PNP1、ALDH1b1、ATP5B和Mat1a。其中调控ATP5B可能有mmu-miR-103、mmu-miR-23a和mmu-miR-503等至少40个miRNA,调控TTR可能有mmu-miR-210、mmu-let-7c mmu-let-7e等至少30个miRNA,调控HMGCS2可能有mmu-miR-140等至少6个miRNA,调控ALDH6a1可能有mmu-miR-711等至少11个miRNA,调控PNP1的miRNA可能是mmu-miR-503,调控ALDH1b1可能有mmu-miR-382和mmu-miR-326等至少21个miRNA。结论1肝脏I/R损伤和IPC均涉及到众多miRNA表达的变化,这些miRNA参与了生物调节、细胞进程、发育过程、定位的建立、代谢过程等病理生理过程。2 miRPlus_17905、mmu-miR-346_MM1、mmu-miR-370、mmu-miR-326和mmu-miR-23a在肝脏I/R损伤和IPC时发生了相反的变化(在I/R损伤后表达上调,经IPC处理后又下调),主要的靶基因涉及DNA依赖的转录调控和转录两大块。3 miR-370可能通过影响潜在靶标基因MAPKK3和MAPKK7的表达,并进一步调节MAPK信号转导通路的信号分子,由此在肝脏I/R损伤和IPC中发挥调节作用。4 ATP5B在肝脏I/R损伤和IPC过程中的表达可能受到mmu-miR-23amiRNA的调控。5在肝脏I/R损伤过程中,HMGCS2可能受到mmu-miR-140~*的调控;ALDH6a1的表达可能受到mmu-miR-711的调控;PNP1的表达可能受mmu-miR-503的调控。6 ALDH1b1在肝脏IPC过程中的表达改变可能受到mmu-miR-326的调控。7 TTR在肝脏I/R损伤和IPC过程中miRNA的调控机制相对复杂,可能涉及一些miRNA网络调控的综合效应,或者未受到相应的miRNA的影响。
袁贵秀[5]2008年在《肢体缺血预处理对兔肝脏延迟性保护作用及其机制的研究》文中进行了进一步梳理研究目的(1)研究肢体缺血预处理是否对兔肝脏具有延迟保护作用;(2)用Western blot免疫印迹法研究丝裂原活化蛋白激酶家族P44/P42MAPK、SAPK/JNK、P38蛋白激酶途径是否参与肢体缺血预处的延迟性肝脏保护作用;(3)用蛋白质组学方法研究肢体缺血预处理24h后肝脏组织蛋白质表达谱的变化,寻找可能参与肢体缺血预处理延迟性肝脏保护作用的蛋白质。研究方法实验分叁部分:(1)分为3组:IR组、假预处理对照组(S组)、肢体缺血预处理组(LIP组)。IR组不给任何预处理;S组术前24h分离新西兰大白兔双后肢股动静脉但不阻断;LIP组,术前24h分离双后肢股动静脉,阻断5min后再开放10min,重复3次。24h后叁组新西兰白兔阻断肝十二指肠韧带25min,再灌注3h,观察血流动力学变化,抽动脉血测ALT及TNF-α变化,用光学显微镜和电子显微镜观察肝脏组织与细胞的结构变化,并测定再灌注3h肝脏组织MDA、SOD含量及肝脏组织干湿比重(Wet/Dry,W/D),以确定肢体缺血预处理是否对兔肝脏具有延迟性保护作用。(2)运用western-blot免疫印迹法测第一部分中S组、LIP组兔缺血再灌注后30min肝组织P44/P42MAPK、SAPK/JNK、P38蛋白激酶磷酸化水平变化并与正常C组兔肝组织对照以确定其与肢体缺血预处理对肝脏保护作用的关系,并观察P38阻断剂SB203580预处理对肝脏缺血再灌注损伤的作用。(3)用双向凝胶电泳法分离肢体缺血预处理(LIP组)、假预处理对照(S组)24h后兔肝脏组织蛋白质,图像分析后找出差异蛋白质,并用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)鉴定部分差异蛋白质。研究结果(1)LIP组血流动力学较IR组、S组显着稳定,LIP组兔血浆AST、TNF-a及肝组织MDA含量明显低于IR组、S组,而肝脏组织SOD含量、肝组织干湿比重明显高于IR组、S组,光镜与电镜观察结果显示LIP组肝组织损伤亦较其它两组明显减轻。(2)缺血再灌注30min各组兔肝组织磷酸化P44/P42MAPK、JNK、P38蛋白激酶假手术C组明显升高,LIP组JNK、P38蛋白激酶磷酸化水平明显低于对照S组。P38蛋白激酶的抑制剂SB203580能模拟LIP对缺血再灌注肝组织产生肝脏保护效应(3)双向凝胶电泳分析发现,S组的蛋白质点数平均为739±18%,LIP组的蛋白点数平均为748±23%。其中差异明显的点有37个,选取12个差异蛋白质进行质谱分析,初步鉴定出7个蛋白质,其中6个在LIP组上调,另有一个蛋白质即ADP-核糖基化因子15在LIP组新出现。这些蛋白质包括应激蛋白(热休克蛋白27、NADPH依赖性羰基还原酶)、信号转导蛋白(G蛋白β亚单位2、ADP-核糖基化因子15、钙结合蛋白)、代谢相关蛋白(丙酮酸脱氢酶、醛脱氢酶)。研究结论(1)肢体缺血预处理对兔肝脏具有延迟性保护作用。(2)MAPKs信号传导通路介导了肢体缺血预处理的延迟性肝脏保护作用,其中JNK、P38蛋白激酶信号传导通路具有重要作用。(3)肢体缺血预处理24h后肝脏组织的蛋白表达谱发生改变;初步鉴定出的7个差异蛋白质,提示肢体缺血预处理的延迟性肝脏保护作用可能与这些蛋白质清除代谢毒物、改善能量代谢,稳定细胞内钙离子浓度等有关。其中热休克蛋白27是目前已知与预处理延迟性保护作用有关的效应蛋白质之一,首次发现其与肢体缺血预处理延迟相有关,丙酮酸脱氢酶、NADPH依赖性羰基还原酶、G蛋白β亚单位2、ADP-核糖基化因子15、钙结合蛋白、丙酮酸脱氢酶、醛脱氢酶是首次发现可能与肢体缺血预处理作用有关。这为全面揭示肢体缺血预处理的延迟性肝脏保护作用的分子机制提供了重要信息。
蒋高霞[6]2013年在《肢体缺血预处理对肝硬化兔肝脏缺血再灌注损伤的影响》文中认为[目的]肝脏缺血再灌注损伤(HIRI)是造成肝脏术后肝衰竭或肝脏移植术后移植肝脏无功能的主要原因之一。如何预防肝脏缺血再灌注损伤成为了目前研究的热点与难点,而临床肝癌切除术或者肝脏移植术患者一般都伴有肝硬化,如何预防伴有肝硬化肝脏缺血再灌注损伤更具有现实意义。本研究拟探讨术前无创的肢体缺血预处理(LIPC)对肝硬化兔肝脏缺血再灌注损伤(HIRI)的影响。[方法]1.造模及分组选取新西兰兔32只,采用500mL/L的CCl4-橄榄油溶液0.3mL/kg颈背部皮下注射法制造兔肝硬化模型。造模阶段中,因CCl4急性中毒死亡2只。造模12周后,从剩下的30只肝硬化兔中随机选2只,在全麻下开腹,并切取小块肝组织,制作病理切片,观察肝硬化病理改变,明确肝硬化兔模型成功建立。2.干预◎假手术组(sham group,S组)：开腹仅分离肝蒂、但是控制开腹时间为2.5h。(无缺血再灌注损伤处理也无保护性干预)◎缺血再灌注损伤组(ischemia/reperfusion group, I/R组)：开腹分离肝蒂,阻断入肝血流30min、开放2h。◎肝脏缺血预处理组(ischemic preconditioning group, IPC组)：开腹分离肝蒂,阻断入肝血流10min、开放10min后再次阻断入肝血流30min、开放2h。◎肢体缺血预处理组(limb ischemic preconditioning group, LIPC组)：手术前24h采用压脉；带捆扎兔单侧后肢(后肢皮肤呈紫色、股动脉搏动消失)5min、开放5min,重复3次。开腹分离肝蒂,阻断入肝血流30mmin、开放2h。3.指标检测比较各组肝硬化兔干预后血清ALT、AST改变以及肝组织中ALT、AST、MDA ET-1改变水平。比较各组实验后肝硬化兔TNF-α改变水平。[结果]1.从大体来看,IR组、IPC组、LIPC组的肝脏病理损伤程度较S组重,IPC组及LIPC组的病理改变较相似,但是与I/R组相比较,损伤均较轻。2.相对于S组,IR组、IPC组、LIPC组的兔肝脏都出现了不同程度的损伤,ALT、AST、 MDA、SOD、TNF-α、ET-1等指标都出现了不同程度的改变,IPC组、LIPC组与IR组相比损伤减轻,各项指标均存在明显差异(P<0.05),IPC组与LIPC组两组之间差别并不显着(P>0.05),两者损伤程度相似。[结论]本研究证实了肢体缺血预处理能够缓解肝硬化兔肝脏缺血再灌注损伤。目前,肢体缺血预处理的保护作用机制仍不太明确,本研究显示其机制可能与增强SOD活力、清除氧自由基、减少ET-1释放,改善肝脏的微循环、减少TNF-α释放有关。
王时来[7]2008年在《地氟醚预处理对肝脏缺血再灌注损伤的保护作用及其机理研究》文中指出目的:通过地氟醚预处理对肝脏缺血再灌注损伤影响作用的观察,明确地氟醚预处理在肝脏缺血再灌注损伤中的保护作用,研究地氟醚预处理对多种炎症因子,肝脏氧自由基产生,组织炎症细胞浸润的影响,并探讨其产生肝脏保护作用的可能机制。方法:选择限期于硬膜外阻滞复合全麻下行肝部分切除的患者60例,ASAⅠ-Ⅱ级,年龄25—60岁,性别不限,随机分为两组:地氟醚预处理组(干预组)和无地氟醚预处理组(对照组)各30例。干预组予静脉顺序诱导后气管插管,外科切皮前开始吸入地氟醚1.0MAC,持续30分钟后予洗脱10分钟,其后以异丙酚静脉维持麻醉镇静。对照组予予静脉顺序诱导后气管插管整个手术过程仅由异丙酚静脉维持麻醉镇静。两组患者均在进行外科切除时进行肝门阻断,阻断时间约15—20分钟,然后开放再灌注。肝脏再灌注后1小时获取对侧肝脏组织,观察肝组织形态学变化并检测肝组织氧自由基(reactive oxygen species,ROS)水平。分别于诱导后切皮前、阻断肝门10min、恢复肝血流后20min、恢复肝血流后1h及术后第一、叁、五天抽取患者静脉血检测ALT、AST、TB、CB、白蛋白、球蛋白、γ-GT变化。结果:两组患者ALT、AST、TB、CB及γ-GT均较术前呈上升趋势。术中再灌注后20min及术后第一、叁、五天两组ALT指标有显着差异,干预组ALT均低于对照组(P＜0.05);术后第五天两组AST指标有显着芹异,干预组低于对照组(P＜0.05);其余时间点两组AST、ALT无统计学差异。自诱导后至术后第五天两组总胆红素(TB)、结合胆红素(CB)均有显着差异,干预组均低于对照组。(P＜0.05)自诱导后至术后第五天两组γ-GT相比有显着差异,干预组低于对照组。(P＜0.05)术后第一天白蛋白及球蛋白两组相比有显着差异,干预组高于对照组,(P＜0.05)其他时间点两组白蛋白及球蛋白水平相比没有统计学差异。肝组织MDA检测结果显示干预组(7.86±2.04nmol/ml)与对照组(15.38±2.49nmol/ml)相比有显着性差异。(P=8.98×10-10,P＜0.01)经光镜观察到,对照组肝小叶结构紊乱,肝窦内有淤积的红细胞和血栓形成,并可见部分细胞水肿、空泡变性、胞核消失,胞体崩解及少量局灶状坏死,汇管区有大量炎性细胞浸润;而干预组则未出现明显的细胞胀亡或坏死等病理改变,汇管区内也只有少量炎性细胞浸润,与正常肝组织形态相近。结论:地氟醚预处理可以减轻肝切除手术病人肝功能的损害及炎性细胞对肝组织的浸润,并能减少肝氧自由基的生成,对肝脏的缺血再灌注具有一定的保护作用。
李雄雄[8]2016年在《杜仲提取物对大鼠肝缺血再灌注损伤的保护作用及其机制初探》文中提出目的:本研究旨在观察杜仲提取物对肝脏缺血再灌注损伤是否具有保护作用及可能的作用机制。方法:雄性SD大鼠42只,随机分为6组:假手术组(SHAM组):仅解剖肝十二指肠韧带而不阻断肝血流;缺血再灌注组(IR组):阻断中叶及左肝叶血流,造成70%肝脏缺血,热缺血时间控制在60min;乌司他丁组:术前30min腹腔注射乌司他丁(30000U/kg),杜仲-1组、杜仲-2组、杜仲-3组:术前10日每日灌胃给药,剂量分别为(40g生药/kg、80g生药/kg、160g生药/kg)。各组于缺血1h再灌注4h时取肝组织和血液标本,检测血清ALT、AST水平,ELISA法测TNF-α、IL-1含量,黄嘌呤氧化酶法测SOD活性,丙二醛法测MDA含量,并进行HE染色行病理学检查。结果:(1)肝组织病理学:光镜下IR组可见肝细胞水肿明显,肝血窦变窄,部分肝细胞坏死,大量炎性细胞浸润,肝板结构紊乱;杜仲提取物预处理各组肝细胞坏死及炎细胞浸润程度明显减轻,且随着杜仲提取物剂量增加,病理损害减轻越明显。(2)血清肝功能:经杜仲提取物预处理各组ALT和AST水平均低于IR组(P<0.05);其中,与杜仲-1、杜仲-2、杜仲-3比较,乌司他丁组ALT与AST水平下降明显(P<0.05);杜仲-2与杜仲-3组ALT、AST水平明显低于杜仲-1组(P<0.05)。(3)肝匀浆SOD:经杜仲提取物预处理各组SOD活力明显高于IR组高(P<0.05);杜仲-1组SOD活力水平低于杜仲-2组、杜仲-3组(P<0.05);乌司他丁组SOD活性强于杜仲-1、杜仲-2、杜仲-3组(P<0.05)。(4)肝匀浆MDA:经杜仲提取物预处理各组MDA含量明显低于IR组(P<0.05);杜仲-1组MDA含量高于杜仲-2组、杜仲-3组(P<0.05);乌司他丁组MDA含量较杜仲-1、杜仲-2、杜仲-3组更低(P<0.05)。(5)肝匀浆炎性因子:经杜仲提取物预处理各组肝匀浆TNF-α和IL-1含量明显低于IR组(P<0.05);杜仲-2组、杜仲-3组肝匀浆TNF-α和IL-1含量低于杜仲-1组(P<0.05);乌司他丁组TNF-α和IL-1含量较杜仲-1、杜仲-2、杜仲-3组下降幅度更明显(P<0.05)。(6)血清HMGB1水平:杜仲提取物预处理组血清HMGB1较IR组明显降低,以杜仲-2、杜仲-3组效果更为显着,差异有统计学意义(P<0.05);乌司他丁组HMGB1水平较杜仲提-1、杜仲-2、杜仲-3组降低幅度更明显(P<0.05)。结论:(1)杜仲提取物可明显减轻HIRI模型动物的病理损伤及降低ALT、AST水平,表明其对HIRI具保护效应。(2)杜仲提取物可通过抗氧化及抗炎效应对大鼠HIRI发挥保护作用,其作用机制可能与抑制HMGB1的表达而减少炎症反应有关。(3)高、中剂量杜仲提取物(160g生药/kg、80g生药/kg)预处理对大鼠HIRI的保护作用效果优于低剂量组(40g生药/Kg),但未能达到乌司他丁组同等保护效应。
李胜伟[9]2013年在《大鼠肝门阻断过程中扪摸对肝脏热缺血再灌注损伤的影响及机制研究》文中指出目的探讨在肝脏外科手术过程当中,手术操作本身即扪摸对大鼠在体肝脏热缺血再灌注损伤的影响及意义；探讨扪摸影响肝脏热缺血再灌注损伤可能的机制。方法1.模型制作：将30只清洁级(SPF)雄性SD大鼠(Sprague-Dawley rat)随机分成叁组：假手术组(Sham组)、肝脏缺血再灌注组(IR组)、扪摸组(MN组),每组10只。Sham组仅行剖腹、肝镰状韧带游离、肝十二指肠韧带暴露,不行任何其他手法操作；IR组开腹后充分暴露肝门,解剖并分离供应肝中叶和右叶的动脉、静脉和胆管,并使用无创动脉夹阻断15min,再灌注2h；MN组操作同IR组,且在肝门阻断过程中对大鼠肝脏右叶进行轻柔挤压及摩擦2min×5次,每次手法操作间隔lmin,操作力度相同、适中,避免对肝叶造成机械性损伤。2.观测指标：血清转氨酶水平改变：各组大白鼠在再灌注2h后分别取门静脉血进行血清转氨酶ALT及AST定量检测(u/1)。肝组织病理学检查：取肝组织行H-E染色观察肝组织损伤情况并行损伤分级评分,评分标准：0分：静脉血管及肝小叶内无炎性细胞浸润及肝细胞变性、坏死；1分：汇管区少量炎细胞浸润,肝细胞少量变性及坏死；2分：肝小叶内散在肝细胞变性及灶状坏死,肝组织内较多炎性细胞浸润,肝小叶结构尚完整；3分：肝窦、肝中央静脉内淤血,广泛肝细胞变性、坏死,肝组织大量炎性细胞浸润,部分肝小叶破坏。每个标本随机取5个视野损伤评分平均值作为每个标本评分值。肝组织肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α, TNF-α)和P-选择素(P-selectin)表达水平测定：使用免疫组化法(Sp法)测量肝组织TNF-α和P-选择素表达水平,结果用平均阳性灰度值表达。所有定量资料以均数±标准差(x±s)表示,统计学分析采用单因素方差分析LSD法。SPSS17.0统计软件进行统计处理,P<0.05为有统计学意义。结果1.血清肝脏转氨酶水平测定结果：IR组血清ALT水平(251.87±50.80U/L)和MN组血清ALT水平(366.75±89.45U/L)较Sham组(57.25±16.05U/L)明显升高(P=0.000<0.05,F=54.19),其中MN组较IR组ALT水平明显增高(P=0.000<0.05)；IR组血清AST水平(226.75±19.12U/L)和MN组血清AST水平(792.25±87.71U/L)较Sham组(76.50±12.38U/L)明显升高(P=0.000<0.05,F=416.21)；上述测量指标MN组较IR组均明显增高(P=0.000<0.05)。2.光镜下肝组织病理改变及损伤评分结果：Sham组肝组织光镜下观察可见肝小叶、肝窦及肝细胞索结构均正常,未见有明显的肝细胞变性及坏死,汇管区内未见有明显炎症细胞浸润；IR组肝组织光镜下可见汇管区及肝窦内有少量炎症细胞浸润,部分肝细胞索结构破坏,肝小叶内散在肝细胞变性及坏死,肝小叶结构尚正常；MN组观察见肝组织内肝窦及汇管区严重瘀血,同时有大量的炎性细胞浸润,肝细胞索结构紊乱,肝小叶内可见大量肝细胞变性及肝细胞坏死。评分结果：IR组肝组织病理评分(0.93±0.13)和MN组肝组织病例评分(2.10±0.15)分别比Sham组(0.15±0.12)高(P=0.001<0.05),而MN组较IR组肝组织病理评分明显增高(P=0.000<0.05)。3.肝组织TNF-α和P-选择素表达情况：TNF-α和P-选择素在叁组中的表达有明显的统计学差异(P<0.05)：其中R组肝组织TNF-a表达的平均阳性灰度值水平(132.08±4.84)和MN组TNF-α平均阳性灰度值(150.50±12.11)较Sham组(85.52±6.31)明显升高(P=0.000<0.05,F=128.19);IR组肝组织P-选择素表达的平均阳性灰度值水平(142.14±3.60)和MN组P-选择素平均阳性灰度值(151.91±2.36)较Sham组(91.05±2.66)明显升高(P=0.000<0.05,F=1000.39),上述两指标在MN组中表达水平较IR组均明显增高,差异有统计学意义(p=0.000<0.05)。结论1.扪摸可加重大鼠在体肝脏热缺血再灌注损伤,因此在肝脏外科手术操作过程当中应尽量减少对其进行扪摸。2.扪摸加重肝脏热缺血再灌注损伤的机制可能由于扪摸引起肝组织中TNF-α和P-选择素表达的上调所致。
关养时, 吕新生[10]1999年在《缺血预处理对肝脏缺血再灌注损伤的保护作用》文中提出目的探讨缺血预处理对大鼠肝脏缺血再灌注损伤的保护作用。方法在大鼠肝脏持续６０ｍｉｎ缺血及３０ｍｉｎ再灌注之前，先进行５，１０，１５ｍｉｎ的缺血及等长时间的再灌注。于再灌注３０ｍｉｎ完成时取标本测定肝功能、抗氧化酶、脂质过氧化物及形态学研究。结果持续６０ｍｉｎ缺血及３０ｍｉｎ再灌注后，肝功能明显受损，抗氧化酶活力显着下降，肝组织大片坏死；５ｍｉｎ的缺血预处理能明显改善肝功能、提高抗氧化酶活力，减少肝细胞坏死；１０ｍｉｎ效果次之；１５ｍｉｎ反而加重肝脏损害。结论５ｍｉｎ的缺血预处理对肝脏缺血再灌注损伤具有明显的保护作用，它可能为肝脏缺血再灌注损伤的防治提供一种简单有效的新方法
参考文献：
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[2]. 缺血预处理对大鼠肝脏缺血再灌注损伤的保护作用[J]. 吕国庆, 单庆顺, 刘秉义, 舒振波. 白求恩医科大学学报. 1999
[3]. 肠缺血预处理对大鼠肝脏缺血再灌注损伤的保护作用[D]. 孙勇. 南京医科大学. 2009
[4]. 基于蛋白质组学技术和miRNA表达谱技术的缺血预处理对肝脏缺血再灌注损伤作用机理研究[D]. 虞朝辉. 浙江大学. 2008
[5]. 肢体缺血预处理对兔肝脏延迟性保护作用及其机制的研究[D]. 袁贵秀. 中南大学. 2008
[6]. 肢体缺血预处理对肝硬化兔肝脏缺血再灌注损伤的影响[D]. 蒋高霞. 南京中医药大学. 2013
[7]. 地氟醚预处理对肝脏缺血再灌注损伤的保护作用及其机理研究[D]. 王时来. 复旦大学. 2008
[8]. 杜仲提取物对大鼠肝缺血再灌注损伤的保护作用及其机制初探[D]. 李雄雄. 遵义医学院. 2016
[9]. 大鼠肝门阻断过程中扪摸对肝脏热缺血再灌注损伤的影响及机制研究[D]. 李胜伟. 郑州大学. 2013
[10]. 缺血预处理对肝脏缺血再灌注损伤的保护作用[J]. 关养时, 吕新生. 福建医科大学学报. 1999