闫文生[1]2000年在《p38MAPK在LPS诱导血管内皮细胞ICAM-1表达中的作用》文中研究指明细胞间粘附分子-1（ICAM-1）是存在于血管内皮细胞表面的一种重要粘附分子，在脂多糖（LPS）诱导的休克和炎症中可促进循环白细胞粘附于内皮细胞，导致微循环的淤滞和休克的恶化。尽管已有文献报道p38丝裂原激活蛋白激酶（MAPK）可能参与LPS诱导内皮细胞ICAM-1蛋白的表达，但仍不清楚p38MAPK作用的位点是在ICAM-1蛋白翻译水平或是在基因转录水平。为揭示p38MAPK信号转导通路在LPS诱导血管内皮细胞表达ICAM-1中的作用及其机制，本研究采用细胞免疫荧光染色和激光共聚焦显微镜、反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）、免疫沉淀和放射自显影激酶活性测定等技术，探讨LPS和p38 MAPK特异性抑制剂SB203580处理的人脐静脉内皮细胞（HUVEC）ICAM-1蛋白和mRNA表达的动态变化；以及LPS对HUVEC中p38 MAPK活性的影响。结果表明：在LPS刺激前，内皮细胞表面ICAM-1基础表达很弱；LPS刺激后，细胞表面ICAM-1分子在第2-4h开始增加，第8-24h增加显著，第36h有较明显的下降，LPS刺激和ICAM-1表达之间并表现出一定的剂量反应关系。胞浆中mRNA在第2h即有显著增加，第4-36 h进一步增加，并维持在较高水平。SB203580可显著抑制LPS诱导的内皮细胞ICAM-1蛋白和mRNA的表达。LPS刺激HUVEC后，p38 MAPK活性在第15min即有升高，在第30-60min达高峰，之后逐渐降低；离体条件下SB203580可显著抑制p38MAPK活性。 本研究得出以下结论：LPS对内皮细胞ICAM-1表达的调节发生在基因的转录水平，并由p38 MAPK信号转导通路所介导的。LPS刺激和内皮细胞表面ICAM-1的表达具有一定的时间和剂量依赖性，内皮细胞ICAM-1的表达对LPS长期刺激可产生耐受性。
闫文生, 阚文宏, 黄巧冰, 姜勇, 赵克森[2]2002年在《脂多糖诱导小鼠肠组织ICAM-1表达的变化及p38MAPK在其中的作用》文中研究指明目的 :研究脂多糖 (LPS)诱导小鼠肠组织细胞间粘附分子 - 1(ICAM - 1)表达的变化及p38丝裂原活化蛋白激酶 (p38MAPK)在其中的调控作用。方法 :用不同剂量的LPS或LPS加p38MAPK特异性抑制剂SB2 0 35 80对小鼠进行不同时间的处理后 ,分别采用Westernblot和RT -PCR检测ICAM - 1蛋白和mRNA表达情况。结果 :小鼠肠组织中ICAM - 1蛋白和mRNA的表达在LPS剌激后显著高于对照组 ,LPS剌激后 12 - 36h ,ICAM - 1表达增加最为显著。LPS剂量在 2 0 .0mg/kg时 ,对ICAM - 1的表达具有最大的剌激作用。SB2 0 35 80预处理小鼠 30min ,可显著抑制LPS诱导的ICAM - 1蛋白和mRNA的表达。结论 :LPS可诱导小鼠肠组织中ICAM - 1蛋白和mRNA的表达增加 ,并具有时间和剂量依赖性 ,p38MAPK信号转导通路可能在内毒素休克小鼠肠组织ICAM - 1表达中起重要调节作用 ,提示抑制p38MAPK通路可能对内毒素休克时肠损伤的防治有重要的意义。
王晶晶[3]2017年在《法舒地尔对小鼠急性肺损伤的保护作用及其机制研究》文中认为急性肺损伤(Acute Lung Injury,ALI)/急性呼吸窘迫综合征(Acute Respiratory Distress Syndrome,ARDS)是各种致病因素导致的肺组织液体生成增多或重吸收障碍以及肺组织大量炎症细胞浸润和炎症介质释放,使气血交换不足,氧合下降,最终出现的呼吸衰竭综合征。ALI/ARDS致病因素复杂,包括各种肺内外致病因素,如重症肺炎、胃内容物误吸、败血症、重度烧伤和创伤等。在美国,每年约有200,000重症ARDS患者,其死亡率为40%。ARDS发病率逐年升高,病情凶险,严重威胁患者生命健康状况。近30年来,尽管大量基础研究和临床试验显示某些药物或干细胞治疗可改善ALI/ARDS患者或动物模型肺损伤指标,但是,目前临床上除机械通气等对症支持治疗和加强护理外,美国食品与药品监督局(Food and Drug Administration,FDA)暂未批准治疗ARDS的有效药物。因此,探索与ALI/ARDS发生发展相关的分子靶点,发现可能预防和治疗ALI/ARDS的药物具有重要意义。Rho激酶(Rho Kinase,ROCK)是一种小分子GTP结合蛋白Rho的效应器。研究表明,Rho/ROCK信号在各种细胞功能中发挥重要作用,例如平滑肌细胞收缩、肌动蛋白细胞骨架重构、细胞粘附、细胞运动、炎症细胞迁移、细胞分裂和基因表达等。ROCK信号参与多种疾病的发生,例如中风、血管痉挛、动脉硬化、高血压、心力衰竭和缺血再灌注损伤等。研究表明,在呼吸系统疾病中,ROCK抑制剂能有效缓解肺动脉高压、支气管哮喘、肺纤维化等疾病;此外,动物实验研究显示抑制ROCK活性可减轻气道炎症,改善肺损伤,但ROCK抑制剂预防肺损伤的机制尚不明确。由于肺微血管内皮细胞是呼吸膜的组成成分之一,在肺损伤所致的肺水肿和肺部炎症中发挥重要作用,而ROCK在肺血管内皮细胞表达含量较高,且与炎症反应密切相关。因此,本文第一部分工作通过构建小鼠ALI模型,观察ROCK抑制剂法舒地尔对LPS诱导的肺组织病理损伤、肺部炎症、肺组织通透性以及肺内皮细胞凋亡是否有保护作用;第二部分工作通过建立中性粒细胞-内皮细胞共培养体系,运用LPS体外诱导人肺微血管内皮细胞(pulmonary microvascular endothelial cell,HPMEC)炎症反应、内皮屏障损伤和细胞凋亡,深入探讨法舒地尔对ALI发挥保护作用的细胞和分子生物学机制。第一部分法舒地尔对小鼠急性肺损伤的保护作用目的:观察法舒地尔对ALI小鼠肺组织ROCK活性、病理损伤、中性粒细胞渗出、炎症介质释放、肺组织通透性、肺水转运以及肺内皮细胞凋亡的影响。方法:运用脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS,5mg/kg)气道滴注构建小鼠急性肺损伤模型,fasudil组和LPS + fasudil组小鼠在造模前1小时予以腹腔注射法舒地尔(10mg/kg)。造模24小时后,处死小鼠,分别收集动物外周血、肺组织、支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolarlavagefluid,BALF)标本。运用苏木素-伊红(hematoxylin-and-eosin,HE)染色观察各组小鼠肺组织病理损伤变化;酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测小鼠肺组织和外周血细胞因子IL-6、TNF-α水平;免疫组织化学(immunohistochemistry,IHC)观察肺组织中性粒细胞浸润情况;酶标仪法测定BALF中髓过氧化物酶(Myeloperoxidase,MPO)活性和肺组织中伊文斯蓝(evans blue dye,EB)渗出含量;BCA法测定BALF中蛋白浓度;蛋白质免疫印迹法(western blotting)检测肺组织ROCK活性和水通道蛋白5(aquaporin5,AQP5)的表达水平;免疫荧光染色双标法观察肺组织内皮细胞凋亡情况。结果:首先,气道滴注LPS导致的肺组织ROCK活性升高能被法舒地尔抑制;法舒地尔显著减轻LPS诱导的肺组织病理损伤、抑制中性粒细胞浸润、逆转BALF中MPO活性和中性粒细胞水平;LPS导致肺组织和外周血细胞因子IL-6和TNF-α水平升高,该作用能被法舒地尔抑制;其次,法舒地尔显著抑制LPS诱导的肺泡灌洗液蛋白和EB渗出,减轻LPS诱导的肺血管内皮细胞凋亡.,最后,法舒地尔可逆转LPS诱导的AQP5下调。结论:整体实验研究结果显示,ROCK抑制剂法舒地尔能显著改善LPS诱导的小鼠ALI,主要表现为法舒地尔能减轻LPS诱导的肺组织病理损伤、抑制中性粒细胞浸润和炎症介质释放,降低肺组织通透性,减少肺血管内皮细胞凋亡和促进肺泡腔液体转运。第二部分法舒地尔对急性肺损伤保护作用的机制研究目的:运用LPS体外诱导HPMECs炎症反应、内皮屏障损伤和细胞凋亡,探讨法舒地尔对ALI发挥保护作用的细胞和分子生物学机制。方法:将HPMECs(4-6代)予以不同处理:Con组,1%ECM孵育;fasudil组,1%ECM+1μg/mlfasudil 孵育;LPS 组,1%ECM+1 μg/ml LPS 孵育;LPS+fasudil 组,1%ECM++1μg/mlLPS+1μg/ml(或 0.04μg/ml,0.2μg/ml,1μg/ml)fasudil孵育,法舒地尔在LPS刺激HPMECs前半小时加入;运用慢病毒转染的方法使 HPMECs 中骨形态蛋白受 Ⅱ(Bone Morphogenic Protein Receptor Ⅱ,BMPRII)表达上调或下调,予以法舒地尔和LPS处理。根据不同实验方法及目的,于特定时间点收集细胞和细胞上清进行相关检测。运用内皮细胞-中性粒细胞共培养的方法检测HPMECs对中性粒细胞的趋化和粘附作用;实时定量PCR(quantitative real time PCR,qRT-PCR)检测趋化因子 CXCL1,CXCL2 和 CXCL8的表达;ELISA测定细胞上清中CXCL8的含量。运用western blotting检测细胞间粘附分子(intercellular adhesion molecule[ICAM]-1)、BMPRⅡ 的表达,ROCK、NF-κB和MAPK信号活化情况,细胞间连接蛋白包括血管内皮钙黏蛋白(vascular endothelial cadherin,VE-cadherin)、闭锁小带蛋白-1(zonula occludens[ZO]-1)和凋亡相关蛋白表达水平。荧光酶标仪检测PMECs对低分子右旋糖酐的通透性;免疫荧光染色观察NF-κB p65核转位情况以及VE-cadherin、ZO-1在PMECs中的表达分布;Hoechest 33342染色观察细胞凋亡。结果:首先,法舒地尔浓度依赖性地下调LPS诱导的趋化因子CXCL1,CXCL2和CXCL8的转录以及CXCL8的分泌,抑制中性粒细胞向活化的内皮细胞趋化。其次,法舒地尔通过上调PMECs中BMPRII水平,抑制ICAM-1的表达,减少中性粒细胞与活化的HPMECs粘附。LPS导致的HPMECs中ROCK、NF-κBP65和p38MAPK活化能被法舒地尔阻断。最后,法舒地尔显著上调LPS诱导的VE-cadherin,ZO-1表达下降,降低HPMECs的通透性;此外,法舒地尔抑制LPS诱导的凋亡蛋白pro-caspase3的剪切和HPMECs凋亡。结论:法舒地尔通过抑制肺微血管内皮细胞功能紊乱,减轻LPS诱导的小鼠ALI。法舒地尔抑制肺微管内皮细胞功能障碍具体表现为以下三个方面:第一,法舒地尔下调LPS诱导的内皮细胞释放趋化因子,抑制中性粒细胞向HPMECs趋化;第二,法舒地尔下调LPS诱导的内皮细胞粘附分子的表达,抑制中性粒细胞向PMECs粘附。第三,法舒地尔通过上调HPMECs粘附连接蛋白VE-cadherin和紧密连接蛋白ZO-1的表达,降低PMECs通透性;此外,法舒地尔抑制LPS诱导的PMECs凋亡。
闫文生, 姜勇, 黄巧冰, 王静珍, 赵克森[4]2001年在《p38 MAPK在LPS诱导内皮细胞表达ICAM-1中的作用》文中指出目的 研究p38丝裂原激活蛋白激酶（MAPK）信号转导通路在脂多糖（LPS）诱导人脐静脉内皮细胞（HUVEC）表达细胞间粘附分子-1（ICAM-1）中的作用。 方法 脐静脉内皮细胞培养后分为两组：（1）刺激组，设不同时相点分别用LPS刺激内皮细胞；（2）预处理组，在LPS刺激前2 h，用SB203580预处理内皮细胞。观察ICAM-1蛋白和mRNA表达的变化，检测内皮细胞p38 MAPK活性变化。 结果 LPS剌激后，内皮细胞表面ICAM-1分子在8～36 h显著增加，胞浆中mRNA在2 h即有显著增加；LPS刺激HUVEC后15 min，p38 MAPK 活性即有升高，30～60 min达高峰。p38抑制剂SB203580可显著抑制LPS的诱导作用。 结论 LPS 可能通过激活p38 MAPK信号转导通路，调节HUVEC的ICAM-1基因和蛋白表达。
潘礼龙[5]2011年在《硫化氢及炔丙基半胱氨酸抗心血管炎症反应研究》文中提出[目的]炎症反应在心血管系统疾病如心肌缺血(myocardial ischemia)、动脉粥样硬化(atherosclerosis)等发病过程中起重要作用。信号分子硫化氢(hydrogen sulfide, H2S)在心血管疾病中发挥重要的作用。本研究旨在观察外源性H2S对肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)诱导的人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVEC)的炎症反应,同时观察外源性H2S对心肌梗死大鼠心肌炎症反应、重构以及血管新生的影响及可能机制,以及内源性H2S调节剂炔丙基半胱氨酸(S-propargyl-cysteine, SPRC),对脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)诱导的H9c2心肌细胞的炎症反应以及对TNF-α诱导的HUVEC的炎症反应的影响,并分别探索SPRC抗炎的可能机制,旨在阐明H2S在心血管炎症反应中的作用并开发出有效的治疗心血管炎症的药物。[方法]1.采用TNF-a诱导HUVEC功能紊乱,以地塞米松(dexamethasone,Dex)和乙酰半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine, NAC)为阳性对照；采用细胞黏附试验观察NaHS对U937单核细胞与TNF-α激活的HUVEC(?)(?)附的影响；实时逆转录聚合酶联反应(realtime reverse transcription-polymerase chain reaction, realtimeRT-PCR)观察NaHS对TNF-α诱导的黏附分子,如细胞间黏附分子(intercellular adhesion molecule-1, ICAM-1)、血管细胞黏附分子(ascular cell adhesion molecule-1, VCAM-1)、P-选择素(P-selectin)和-选择素(E-selectin)的mRNA表达;Western blot法检测NaHHS对TNF-α诱导的ICAM-1、VCAM-1、血红素加氧酶-1(heme oxygenase-1, HO-1)的蛋白表达、丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases, MAPK)的磷酸化、ⅠκBα的降解以及核因子-κB(nuclear factor-κB, NF-κB)p65磷酸化和转位的影响；免疫荧光检测TNF-α诱导的NaHS对NF-KB p65转位和细胞内氧自由基(reactive oxygen species, ROS)的影响；2.冠状动脉前降支永久性结扎制备大鼠心肌梗死模型,给予NaHHS或DL-炔丙基甘氨酸(DL-propargylglycine, PAG)及溶媒对照,分别于心肌梗死后3、14、42天取材。Realtime RT-PCR观察NaHS对ⅠCAM-1、VCAM-1、TNF-α、诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)的mRNA表达；采用Western blot法检测NaHS对iNOSs、toll样受体2(toll like receptor2, TLR2)、内皮依赖性一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase, eNOS)、Ⅰ和Ⅲ型胶原(collagen)、HO-1、胱硫醚-γ-裂解酶(cystathionase-γ-lyasis, CSE)、金属基质蛋白酶(1natrix metalloproteinases, MMPs)、内皮细胞生长因子(vascularendothelial growth factor, VEGF)、MAPK的磷酸化、Akt的激活；免疫组织化学法观察NaHS对iNOS、ICAM-1、VEGF、CD34、I和Ⅲ型胶原表达以及CD68+的炎症细胞浸润；Masson染色观察NaHS对心肌纤维化的的影响；超声心电图观察NaHS(?)(?)心功能的影响；体外培养原代心肌成纤维细胞,采用血管紧张素Ⅱ(Angiotensin Ⅱ, Ang Ⅱ)刺激,Western blot观察NaHS对心肌重构相关蛋白(Ⅰ型胶原、MMPs)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase4, Nox4)表达及信号通路(p38MAPK)激活的影响；免疫荧光观察NaHS对Ang Ⅱ诱导的Ⅰ型胶原表达的影响；3.采用TNF-a诱导HUVEC功能紊乱,同时以Dex和NAC为阳性对照；采用细胞黏附试验观察SPRC(?)寸U937单核细胞与TNF-α激活的HUVEC黏附的影响；Western blot检测SPRC对TNF-α诱导的ICAM-1、VCAM-1、CSE的蛋白表达、MAPK的磷酸化、IκBα的降解以及NF-κB p65磷酸化的影响；免疫荧光检测TNF-α诱导的SPRC对NF-κB p65转位和细胞内ROS的影响;4.采用LPS诱导H9c2心肌细胞炎症反应,采用RT-PCR观察SPRC对LPS诱导的炎症介质,TNF-α、iNOS(?)(?)ICAM-1mRNA表达的影响；酶联免疫吸收法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)检测(?)SPRC对LPS诱导的TNF-a释放的影响;Western blot检测(?)SPRC对Akt磷酸化的影响以及SPRC对LPS诱导的ERK1/2的磷酸化、IkBα的降解以及NF-κBP65磷酸化的影响；免疫荧光检测(?)SPRC对LPS诱导的细胞内ROS的影响；[结果]1NaHS剂量依赖性的抑制TNF-a诱导的ICAM-1和VCAM-1蛋白和mRNA表达、P-selectin和E-selectin mRNA表达以及U937单核细胞与HUVEC的黏附；NaHS剂量依赖性诱导HO-1表达,同时NaHS还能够在TNF-α刺激的HUVEC中剂量依赖性诱导HO-1表达；NaHS剂量依赖性的抑制TNF-α诱导的ROS产生NF-kB激活(通过IκBα的降解以及NF-κB p65磷酸化和核转位评价)；2NaHS明显抑制心肌梗死后3、14天的ICAM-K VCAM-K TNF-a和iNOS的mRNA的表达以及心肌梗死后3天的CD68+炎症细胞浸润、NF-κB的激活、TLR2、ICAM-1(?)口iNOS表达,而PAG则部分的加重心肌梗死后炎症反应；NaHS明显改善心功能、缓解心肌重构及纤维化并促进新生血管,PAG则加重心肌重构及纤维化并抑制血管新生；NaHS明显促进心肌梗死后HO-K CSE以及VEGF表达；并可激活存活通路Akt,并抑制p38通路的激活；在体外培养的原代心肌成纤维细胞中,NaHS可抑制(?)Ang Ⅱ诱导的MMP-2、MMP-9、Ⅰ型胶原和Nox4表达,同时NaHS还能够抑制p38通路的激活；3SPRC剂量依赖性的抑制TNF-a诱导的ICAM-1和VCAM-1蛋白表达和U937单核细胞与HUVEC的黏附；同时SPRC可明显诱导TNF-α刺激的HUVEC细胞中CSE表达；SPRC有效抑制TNF-a诱导的细胞内ROS产生、JNK1/2激活、IκBcα的降解以及NF-κB p65磷酸化和核转位；4SPRC剂量依赖性抑制LPS诱导的iNOS诱导的CAM-1mRNA和Ⅰ(?)NF-α mRNA表达和蛋白；SPRC剂量依赖性的激活磷酸肌醇-3-激酶(phosphoinositide3-kinase, PI3K)/Akt通路；SPRC有效抑制LPS诱导的ERK1/2激活、IκBα的降解以及NF-κB p65磷酸化、细胞内ROS产生。[结论]1.外源性H2S能有效的抑制TNF-a诱导的血管内皮细胞炎症反应,其机制与上调HO-1表达、抑制NF-κB激活相关；2.外源性H2S可抑制急性心肌梗死引起的炎症反应,其机制至少与抑制NF-κB信号通路而抑制炎症反应相关；外源性H2S可明显改善心肌功能,其作用与H2S抑制心肌重构、纤维化、促进血管新生相关；3.SPRC(?)(?)通过抑制TNF-α诱导的黏附分子(ICAM-1、VCAM-1)表达而抑制U937单核细胞与内皮细胞的黏附,其机制与调节CSE表达、抑制NF-κB信号通路相关；4. SPRC能通过抑制LPS诱导的H9c2心肌细胞炎症反应,其机制与调节CSE/H2S系统、激活P13K/Akt通路、抑制NF-κB信号通路相关。
成龙[6]2015年在《水蛭酶解提取物抑制脂多糖诱导的大鼠血管平滑肌细胞ICAM-1、VCAM-1及MCP-1的表达》文中研究指明动脉粥样硬化(AS)是一种发生在大动脉血管壁上由慢性炎症演变而来的脂代谢异常疾病。血管平滑肌细胞(VSMCs)是动脉血管壁的主要组成细胞之一,其参与了AS病变的形成,正常情况下VSMCs只存在于血管中膜,当受到致AS因子刺激后,便会脱离血管中膜迁移至血管内膜,并在内膜下大量增殖。单核细胞参与了AS斑块形成过程中炎症反应的发生,不仅内皮细胞(ECs)与单核细胞间存在相互作用,而且VSMCs亦通过分泌诸如细胞间粘附分子-1(ICAM-1)、血管细胞粘附分子-1 (VCAM-1)及单核细胞趋化细胞因子-1(MCP-1)等细胞因子促进单核细胞的招募与粘附。本实验室前期研究表明,水蛭酶解提取物(HEE)作用于ApoE-/-小鼠后可以通过抑制NF-κ B的核转位减弱AS斑块的形成,本实验采用脂多糖(LPS)炎症细胞模型验证HEE对VSMCs粘附分子ICAM-1、VCAM-1和趋化因子MCP-1表达的影响。实验采用Ⅱ型胶原酶酶解法,从大鼠胸部主动脉获得原代VSMCs,伤口愈合实验与Boyden小室结合荧光染料DiI实验评价HEE对VSMCs迁移作用与粘附作用的影响。HEE对NF-κB核转位的影响用免疫荧光染色法测定,炎症因子、粘附分子及趋化因子的表达同时用RT-PCR和Western-bloting测定。信号通路关键分子磷酸化与非磷酸化水平的检测亦采用Western-bloting 法。Transwell小室实验结果表明200μg/ml的HEE抑制VSMCs迁移的能力与阳性药物辛伐他汀(SIM)10μM的抑制能力相当,抑制率均≥50%,Boyden小室研究结果表明200 y g/mL的HEE也能抑制LPS诱导的VSMCs对THP-1及RAW264.7的趋化作用,抑制率分别为60%、80%,辛伐他汀的抗迁移能力介于HEE 200μg/mL与400μg/mL之间。细胞粘附数目荧光计数实验结果表明,水蛭酶解提取物可显著抑制THP-1、RAW264.7与VSMCs的粘附。NF-κB p65荧光免疫染色实验表明,在VSMCs中100μg/mL至400μg/mL的HEE可抑制LPS诱导的NF-κB核转位,且抑制效果随HEE作用浓度的增加而逐步增强。RT-PCR和Western-bloting检测结果显示,在VSMCs中HEE不但能够通过抑制p38MAPK的磷酸化在蛋白质水平上降低LPS诱导的炎症因子、趋化因子、粘附分子的表达,而且能够浓度依赖性的抑制上述三类分子mRNA的表达。综上研究所述,本实验室自主制备的水蛭酶解提取物可以显著抑制血管平滑肌细胞的粘附与迁移,并兼有抗炎功效,为研究中药水蛭治疗动脉粥样硬化提供新的证据支持。
倪志宇[7]2005年在《CCK-8对炎症反应中促炎及抗炎性细胞因子表达的调控机制研究》文中研究说明全身性炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome, SIRS)和代偿性抗炎反应综合征(compensatory anti-inflammatory response syndrome, CARS)是感染性及创伤性疾病并发多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome, MODS)的重要病理过程。MODS不仅有炎症介质过度释放,而且还伴有内源性抗炎介质的不足或过度释放,两者均可导致炎症反应失控,最终导致多系统器官衰竭(multiple systemic organ failure, MSOF)以至死亡。在炎症反应失控而发展成MODS的病理过程中,肺脏是公认的较早发生功能障碍的器官,急性肺损伤(acute lung injury, ALI)或急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome, ARDS)即是MODS 在肺部的表现。作为一种重要的炎症介质,细胞因子在炎症的发生发展过程中发挥着重要作用,其失控性释放是构成ARDS 和MODS 的主要病理学基础。根据细胞因子在宿主防御反应中的功能不同,可将其分为两类:促炎细胞因子和抗炎细胞因子。在炎症反应发展的过程中,机体在释放TNF-α、IL-1β、IL-6 等促炎细胞因子的同时,亦可分泌IL-10、IL-4 等抗炎性细胞因子以对抗炎症反应、维持机体内环境的稳定。活化的单核-巨噬细胞是炎症反应中细胞因子的重要来源, G-菌菌壁的主要活性成分脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)是诱导巨噬细胞产生和释放炎症介质最强烈、最有效的激活物,在G-菌感染和内毒素休克发病中发挥重要作用。胆囊收缩素(cholecystokinin, CCK)是一种典型的脑肠肽,它不但具有胃肠激素的功能,还以神经递质和神经调质的形式发挥着重要的作用。近年的研究表明,八肽胆囊收缩素(CCK-8)具有一定的抗炎作用,用CCK-8 预处理可使内毒素休克(endotoxin shock, ES)大鼠平均动脉压回升而肺动脉压降低,并明显减轻LPS 引起的大鼠心肌组织、肺脏、脾脏和肾脏白细胞浸润、毛细血管血液淤积等征象,抑制体内TNF-α、IL-1β、IL-6 等促炎因子的升高。ES 大鼠脾、肺、心脏组织及肺间质巨噬细胞
王兴友[8]2005年在《糖皮质激素保护血管内皮炎性损伤的受体前调节机制》文中进行了进一步梳理血管内皮细胞(vascular endothelial cell,VEC)是机体一类重要的细胞群体,在血管通透性屏障、免疫防御及炎症反应中起着极其重要的作用[1,2]。能够合成并分泌多种活性因子,其中IL-6、ICAM-1 较有代表性,而IL-6 则被认为是内皮炎症反应的最佳标志分子[2]。越来越多的研究表明,内皮细胞作为LPS 作用的靶细胞,在LPS 引起的脓毒症、脓毒性休克、多器官功能衰竭等病理过程中起着关键的作用,目前认为血管内皮功能障碍及凋亡不仅是心脑血管疾病发生的共同环节,而且是败血症、休克、创伤等应激情况下发生MODS 和ARDS 的重要原因。在ARDS 发生过程中,血管内皮细胞既是靶细胞也是效应细胞,它的损伤与激活是机体发生失控性炎症反应及高通透性肺水肿的根本环节[1]。糖皮质激素(glucocorticoid,GC)对ARDS 的抗炎作用必然会以血管内皮细胞作为一个主要靶点,但长期以来有关糖皮质激素治疗ARDS 的研究多以临床观察为主,而一些涉及到血管内皮的基础研究则主要探讨白细胞与血管内皮的粘附及对内皮的损伤,而涉及到糖皮质激素作用机制的研究则主要在受体水平进行。有关糖皮质激素治疗ARDS 时对血管内皮保护的机制,特别是受体前调节机制的研究目前尚未见报道。本实验以内毒素脂多糖LPS(lipopolysaccharide,LPS)致伤体外培养的人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVEC) , 然后观察糖皮质激素(Dexamethasone,Dex)对HUVEC 受伤前后不同时点表达IL-6、ICAM-1 等细胞因子的影响,及HUVEC 发生凋亡的情况,以确定其对血管内皮的炎性损伤是否具有保护作用。然后用RT-PCR 等方法观察人脐静脉内皮细胞糖皮质激素受体(glucocorticoid receptor,GR)、盐皮质激素受体(mineralocorticoid receptor,MR)及糖皮质激素受体前调节的关键酶11β-羟基类固醇脱氢酶(11-βhydroxysteroid dehydrogenase, 11β-HSD)基因的表达变化,并观察11β-HSD 的经典抑制剂甘草次酸(glycyrrhizic acid,GA)在其中的作用。力图阐明糖皮质激素保护血管内皮炎性损伤的受体前调节机制,探讨其在ARDS 治疗中的意义。主要研究结果和结论如下:一、不同浓度LPS 刺激人脐静脉内皮细胞,在刺激3h 开始时即可使HUVEC
张炜[9]2016年在《Tec非受体型激酶在LPS诱导小鼠脓毒症急性肾损伤中的影响及可能机制》文中提出一、研究背景脓毒症(sepsis)的发病机制是机体一种失控的全身性炎症反应,是一种复杂的临床综合征,表现为各种炎症介质的过度释放,引起广泛的细胞和组织损伤,进一步可导致脓毒性休克、严重脓毒症甚至多器官功能障碍综合征。而肾脏是脓毒症发生和发展过程中最易受到损伤的器官,急性肾损伤(Acute kidney injury,AKI)是最常见的并发症之一,是死亡的独立危险因素。近年来的研究进一步认识了脓毒症AKI的发生机制包括:肾微循环障碍导致肾脏灌注不足,肾小球周的毛细血管网循环失调,炎症标志物与氧化应激增加对肾小管的毒性作用,级联反应的激活和器官高代谢反应至致细胞死亡等。在这些发病机制中,级联放大的炎症反应在脓毒症AKI中起着举足轻重的作用。Tec(Tyrosine kinase expressed in hepatocelluar carcinoma)是最早研究肝癌时发现的一种酪氨酸蛋白激酶基因表达产物,Tec家族和其他两个主要的酪氨酸蛋白激酶家族(Src、Syk激酶家族)被证实与炎症反应相关。Tec激酶家族的Tec、Src被证实在炎症反应中的早期即有激活并磷酸化,其活化亦可能与TLR早期活化相关,对Tec激酶家族的干预试验已被用于一些自身炎症性疾病如类风湿性关节炎等。Tec激酶在脓毒症所致的全身炎症反应中所发挥的机制目前研究甚少,一些研究认为Tec非受体型激酶参与了感染导致脓毒症的过程,并且认为干预Tec激酶的治疗可能是改善感染所致脓毒症的新的靶点。在脓毒症AKI的发生和发展过程中,Tec激酶的表达情况以及Tec激酶是否参与脓毒症AKI的发生及其可能的机制,目前罕有文献报道。本研究部分旨在制造脓毒症急性肾损伤模型,并且了解Tec激酶的肾内表达情况,初步探讨Tec激酶是否参与脓毒症AKI的过程及其可能机制。二、研究目的1.在体内实验中,通过LPS诱导脓毒症AKI模型的建立,研究Tec激酶在AKI肾组织中的表达变化,采用Tec激酶抑制剂进一步研究对AKI肾功能的影响以验证其与AKI发生发展的相关性。同时了解不同组别之间肾组织TLR4、MYD88的表达、NF-κB通路活化情况及肾间质巨噬细胞浸润来探讨Tec激酶在AKI的可能作用机制。2.体外实验中观察Tec激酶在LPS刺激诱导RAW264.7巨噬细胞释放炎症因子的影响;并通过使用Tec激酶抑制剂和其si RNA后了解其对炎症介质的分泌和MAPK和NF-κB通路活化的影响,期望通过上述研究进一步认识Tec激酶在脓毒症AKI的发生发展中的可能机制,为AKI的治疗提供新的靶点。三、研究内容第一部分脓毒症小鼠AKI中Tec激酶蛋白的表达变化健康雄性清洁级成年C57BL/6小鼠32只,分2组,每组16只,LPS组给予LPS腹腔注射20mg/kg,正常对照组给予等量溶媒,分别于1h、6h、24h、48h每组4只小鼠,麻醉后心脏取血查血清IL-1β、TNF-ɑ及肾功能(肌酐、尿素氮、胱抑素C)并分离肾脏组织,病理学HE染色观察组织结构,免疫组化观察Tec激酶表达,Western blot观察Tec激酶、TLR4、NFκB-p65、p-NFκB-p65蛋白表达变化。第二部分Tec激酶蛋白抑制剂LFM-A13对脓毒症小鼠AKI的保护作用健康雄性清洁级成年C57BL/6小鼠36只,分6组,每组6只,LPS组给予LPS腹腔注射20mg/kg,正常对照组给予等量溶媒,LPS+LFM-A13(40mg/kg)、LPS+LFM-A13(60mg/kg)、LPS+LFM-A13(80mg/kg)组分别在给予LPS20mg/kg腹腔注射后立即并分次给予LFM-A13(40mg/kg、60mg/kg、80mg/kg)腹腔给药,LFM-A13组仅给予LFM-A13(60mg/kg)腹腔给药,并补足小鼠腹腔灌注液体体积为1ml/20g,造模后24小时,小鼠麻醉后心脏取血查血清IL-1β、TNF-ɑ及肾功能(肌酐、尿素氮、胱抑素C)并分离肾脏组织,病理学HE染色观察组织结构,免疫组化观察Tec激酶表达,巨噬细胞浸润,Western blot观察Tec激酶、myd88、TLR4、NFκB-p65、p-NFκB-p65蛋白表达变化。培养大鼠肾小管上皮细胞系NRK-52E,分别以不同浓度的LPS(0ug/ml、0.01ug/ml、0.1ug/ml、1ug/ml、10ug/ml)刺激,再以0.1ug/ml LPS刺激NRK-52E细胞不同时间(0min、15m、30min、60min、120min),提取细胞蛋白,Western blot检测Tec激酶表达状况。再观察抑制剂的体外效果,LPS(0.1ug/ml)并加用不同浓度LFM-A13(50u M、75u M、100u M)预处理1h,提取细胞蛋白,Western blot检测Tec激酶表达状况。第三部分抑制Tec激酶蛋白表达对LPS诱导RAW264.7巨噬细胞促炎性细胞因子产生的影响及机制培养巨噬细胞RAW264.7,加用抑制剂LFM-A13(25u M、75u M)预处理RAW264.7细胞1h,并0.1ug/ml LPS刺激1h,流式细胞术、q RT-PCR的方法检测RAW264.7细胞上ICAM-1的表达水平,提取细胞蛋白,western blot检测IκBα、NFκB-p65的蛋白表达及磷酸化水平及TAK-1的磷酸化水平,激光共聚焦检测RAW264.7细胞中NFκB-p65核转移状况。Tec激酶si RNA干扰RAW264.7细胞特异性沉默Tec激酶基因表达,并在瞬时转染后给予LPS0.1mg/ml刺激RAW264.7细胞1h,提取细胞蛋白,western blot检测TAK1、p-p38/p38和p-p65蛋白表达。四、研究结果第一部分建立小鼠LPS腹腔注射致脓毒症AKI模型,LPS20mg/kg腹腔内注射后1h即可见肾脏组织的轻度损伤及Cys C升高,6h可见血尿素氮升高,24h肾功能指标均有明显升高,并可见明显的肾脏组织学损害。48h上述肾功能及肾脏组织损伤明显改善。造模后1h即可见血清炎症因子IL-1β和TNF-ɑ明显升高,其中IL-1β在6h时升高最为明显,TNF-ɑ在1h时升高最为明显。造模后1h即可见肾内Tec激酶及TLR4蛋白表达升高,持续致6h后开始下降,与正常对照组相比持续至48h均有升高。造模后6h可见NFκB-p65及其磷酸化水平明显升高。肾组织免疫组化证实在LPS致脓毒症建模后1h即可见肾小管上皮细胞内Tec激酶表达升高。第二部分小鼠腹腔注射LPS 24h后肾功能(肌酐、尿素氮、胱抑素C)明显升高,肾组织损伤明显,抑制剂LFM-A13给药后各个剂量组均能明显改善小鼠肾功能变化,同时明显改善肾脏组织病理损伤。血清ELISA检测提示LFM-A13明显降低脓毒症模型组IL-1β及TNF-ɑ水平。western blot结果提示LFM-A13明显减少脓毒症小鼠肾脏组织Tec激酶、MYD88、TLR4、NFκB-p65、p-NFκB-p65蛋白表达水平。免疫组化染色提示LFM-A13明显减少肾小管上皮细胞内Tec激酶的表达,并明显减少脓毒症小鼠肾内巨噬细胞浸润。体外实验示浓度梯度LPS刺激大鼠肾小管上皮细胞系NRK-52E,0.1mg/ml即可见Tec激酶蛋白表达升高。时间效应观察0.1ug/ml LPS刺激大鼠肾小管上皮细胞后30min即可见Tec激酶表达的升高,持续升高致120min,抑制剂LFM-A13(50u M、75u M、100u M)可以明显减少Tec激酶的表达。第三部分流式细胞术、q RT-PCR显示LFM-A13减少LPS刺激后RAW264.7细胞ICAM-1的产生。Western blot示LFM-A13(25u M、75u M)下调LPS刺激RAW264.7细胞后NFκB-p65及TAK1的活化;LPS刺激促进了RAW264.7细胞胞浆内IκBα蛋白的磷酸化降解和NFκB-p65的核转移,进而激活NFκB信号转导通路的活化,而Tec激酶抑制剂LFM-A13预处理则明显能抑制NFκB信号通路的活化,并明显减少NFκB-p65的核转移。Tec si RNA(Tec mus-790 RNAi)选择性沉默Tec激酶m RNA表达后可明显下调LPS刺激RAW264.7细胞内p-p38/p38、p-p65、p-TAK1/TAK1蛋白的表达水平。五、研究结论1.采用LPS(20mg/kg)腹腔内注射后1h即可检测出炎症指标的明显升高,并出现早期肾功能损伤,以24小时最为明显,其后呈现修复趋势。脓毒症AKI小鼠肾脏组织极早期便可检测出Tec激酶的高表达,并伴随TLR4通路蛋白及下游细胞因子NFκB-p65的表达及活化水平的升高,提示Tec激酶参与了脓毒症AKI的早期启动过程,并可能通过参与脓毒症致炎症损伤机制而发挥作用。2.LPS刺激的小鼠脓毒症模型其肾脏组织中存在Tec激酶蛋白的过高表达,并在肾小管上皮细胞中存在过高表达。LFM-A13在体内及体外均能够抑制肾小管上皮细胞中Tec激酶蛋白过高表达,并可能通过抑制TLR4/MYD88信号通路,抑制NFκB-p65的活化,减少炎症因子产生及巨噬细胞浸润等机制发挥防治AKI的作用,改善肾功能损伤及肾脏组织病理损伤。3.LFM-A13预处理RAW264.7细胞以及si RNA沉默Tec激酶基因表达后,可抑制LPS刺激的Tec激酶过高表达,并可能通过抑制TAK1通路干扰NFκB信号通路的活化并减少炎症因子的释放,从而发挥其在巨噬细胞中的抗炎作用。
单佑安, 苏踊跃, 罗向东, 杨宗城[10]2002年在《内毒素诱导内皮细胞粘附分子表达的意义》文中提出目的 研究内毒素 (LPS)刺激下内皮细胞粘附分子 (ICAM 1)表达的规律及信号调节机制。 方法 (1)在不同剂量和时间 ,用LPS刺激培养的人脐静脉血管内皮细胞株ECV 30 4 ,从mRNA水平观察ICMA 1的诱导表达规律 ;(2 )以信号通路阻断剂预处理细胞 30min后再行LPS刺激 ,从mRNA及蛋白水平观察不同信号通路对ICAM 1诱导表达的调节作用。 结果 (1) 10 0 pg/mlLPS刺激细胞 6h就可以诱导ICAM 1mRNA的表达 ,随刺激浓度增加 ,ICAM 1mRNA表达增强 ,10 0～ 10 0 0ng/mlLPS具有最大的诱导效应。 6～ 8h是mRNA表达高峰 ,12h以后表达仍处于较高水平。 (2 )核因子 κB(NF κB)抑制剂PSI能显著抑制ICAM 1mRNA及蛋白表达 ;细胞外信号调节激酶 1/ 2 (ERK1/ 2 )丝裂原活化蛋白激酶 (MAPK)抑制剂PD980 5 9及p38MAPK抑制剂SB2 0 35 80 ,均能在mRNA及蛋白水平部分抑制ICAM 1的表达。 结论 LPS以剂量 时间依赖方式诱导内皮细胞ICAM 1mRNA表达 ,NF κB是调节ICAM 1表达的主要信号通路 ,p38、ERK1/ 2是调节ICAM 1表达的次要信号通路
参考文献：
[1]. p38MAPK在LPS诱导血管内皮细胞ICAM-1表达中的作用[D]. 闫文生. 第一军医大学. 2000
[2]. 脂多糖诱导小鼠肠组织ICAM-1表达的变化及p38MAPK在其中的作用[J]. 闫文生, 阚文宏, 黄巧冰, 姜勇, 赵克森. 中国病理生理杂志. 2002
[3]. 法舒地尔对小鼠急性肺损伤的保护作用及其机制研究[D]. 王晶晶. 南京医科大学. 2017
[4]. p38 MAPK在LPS诱导内皮细胞表达ICAM-1中的作用[J]. 闫文生, 姜勇, 黄巧冰, 王静珍, 赵克森. 中华烧伤杂志. 2001
[5]. 硫化氢及炔丙基半胱氨酸抗心血管炎症反应研究[D]. 潘礼龙. 复旦大学. 2011
[6]. 水蛭酶解提取物抑制脂多糖诱导的大鼠血管平滑肌细胞ICAM-1、VCAM-1及MCP-1的表达[D]. 成龙. 山东大学. 2015
[7]. CCK-8对炎症反应中促炎及抗炎性细胞因子表达的调控机制研究[D]. 倪志宇. 河北医科大学. 2005
[8]. 糖皮质激素保护血管内皮炎性损伤的受体前调节机制[D]. 王兴友. 第三军医大学. 2005
[9]. Tec非受体型激酶在LPS诱导小鼠脓毒症急性肾损伤中的影响及可能机制[D]. 张炜. 安徽医科大学. 2016
[10]. 内毒素诱导内皮细胞粘附分子表达的意义[J]. 单佑安, 苏踊跃, 罗向东, 杨宗城. 中华烧伤杂志. 2002