1.山西医科大学；2.山西医科大学第二附属医院；3.山西省妇幼保健院；4.太原市中心医院；
5.山西省华信瑞安生物科技有限公司
摘要：目的 建立操作简便、快速、成本低、结果准确的鉴定PAH基因外显子突变的基因诊断方法。方法 应用高分辨熔解曲线（High Resolution Melting，HRM）技术，对山西省已经临床确诊的85例PKU患儿进行外显子突变进行检测，并将检测结果进行测序验证。结果 在受检的山西省患儿中，PAH基因外显子突变位点HRM技术检测结果和测序结果完全相符。结论 高分辨熔解曲线技术操作简便，快速，使用成本低，结果准确，可作为PAH基因外显子突变的快速灵敏检测方法。
关键词：苯丙酮尿症；外显子；高分辨熔解曲线（HRM）技术；突变热点；基因诊断
【Abstract】Objective Establish a simple，rapid，inexpensive and sensitive method for detection of the hot mutation region in exon of the gene for PAH.Method HRM technology was used to detect mutation in exon in 85 classical type PKU patients and the mutations in all samples were validated by direct sequencing.Results The results detected by HRM is in good agreement with the result obtained by direct sequencing.Conclusion The HRM analysis is a simple，rapid，inexpensive and sensitive method for detection of the hot mutation region in exon of the gene for PAH.
【Key words】phenylketonuria；exon；HRM；Mutational hotspot；Gene Diagnosis
苯丙酮尿症（phenylketonuria，PKU）是一种氨基酸代谢异常的常染色体隐性遗传病。由于苯丙氨酸羟化酶（phenylalaninehydroxylase，PAH）缺陷或活性降低，导致苯丙氨酸不能正常转化为酪氨酸，苯丙氨酸在体内异常蓄积并打破大脑氨基酸的平衡而引起中枢神经系统的损伤[1]。PAH缺陷引起了患儿神经系统损害，尤其是智力发育障碍和语言发育迟缓等更为严重。绝大多数PAH缺陷或活性降低的主要原因是基因的点突变，而非基因部分的缺失[2]。PAH是一种四聚体形式的单加氧酶，其任何一个亚基的改变都会引起PAH活性的改变，从而影响苯丙氨酸的代谢。由于PKU是可治性的遗传病之一，患PKU的新生儿临床表现无特异性，医生及家长忽略其诊断筛查，延误诊断及治疗最佳时期，所以早期诊断、早期治疗是其预后的关键，而分子诊断是实现早期诊断的有效手段。因此，我们应用HRM直接检测突变基因。
高分辨溶解曲线分析（High Resolution Melting，HRM）通过结合荧光染料与实时荧光PCR仪，先对样本进行PCR反应后再通过高分辨溶解曲线进行基因分型，实时监测升温过程中的荧光信号，随着温度的升高，荧光信号下降，从而绘制出相应的熔解曲线，根据荧光强度与时间曲线的变化来确定是否存在SNP，使基因中单个碱基的变异也得以区分，从而检测PCR产物未知及已知变异，如果样本中存在变异，纯合突变可由于熔解温度（Tm）的不同而与野生型相鉴别；杂合突变则由于错配的异源双链在升温过程中先解开，从而导致熔解曲线形状的改变而鉴别这种方法不受突变碱基位点与类型的局限，无需序列特异性标记探针，此方法特异性好，灵敏度高，快速，简单，成本低，高通量，PCR扩增产物污染少。本实验利用HRM技术检测了85例患儿的PAH基因的5个外显子及外显子-内含子交界区突变情况，之后一代测序验证。
DNA 测序是检测基因突变的金标准，其最大的优势是可以直接明确突变的位置和性质。但该方法成本高，不适于 PAH 基因突变的常规检测，目前多用于局部地区 PAH 基因谱的研究或是经突变筛查后异常样本的检测和验证[3]，所以本实验用此来验证上述技术的检测结果。
1材料与方法
1.1.1研究对象
85例患儿均为山西省妇幼保健院新生儿筛查中心、大同市妇幼保健院、长治市妇幼保健院和运城市妇幼保健院门诊经过筛查后确诊的苯丙酮尿症患儿。年龄在15 天至 7 岁之间，其中男性48例，女性37例。初诊血苯丙氨酸浓度测定在251-2621μmol/L，所有患儿均进行了血二氢喋啶还原测定、尿喋呤分析和四氢生物喋呤缺乏症负荷试验，排除了四氢生物喋呤缺乏症。所有检查均获得了患儿家长或监护人的知情同意。患儿的生化代谢表型参照文献[4]分为经典型PKU（Phe>1200μmol/L）、中度PKU（Phe 600-1200 μmol/L）、轻度PKU（Phe 400-600 μmol/L）和轻度高苯丙氨酸血症（Phe<400 μmol/L）。
1.2.3 HRM（高分辨熔解曲线）技术
（1）PCR- HRM引物的设计与合成
引物设计：从UCSC数据库（http：//genome.ucsc.edu）获得PAH基因的DNA序列。应用Light Scanner Primer Design软件共设计5对引物分别扩增PAH基因的5个外显子及外显子-内含子交界区。引物序列详见下表1。
引物由上海生物工程技术服务有限公司合成。
（2）PCR-HRM扩增
扩增体系：
总体系为25μL，其中2×Rotor-Gene SYBR Green PCR Master Mix 12.5μL，DNA模板1μL，上、下游引物各1μL（10μM），RNase-free water 9.5μL。
PCR扩增条件：
采用96孔板进行PCR扩增。94℃预变性3min；94℃30s，退火30s，退火温度56℃，72℃30s，40个循环后，72℃延伸5min；最后，94℃30s，25℃30s形成异源双链。扩增产物直接进行HRM曲线分析，条件为：94℃3min预处理，熔解温度70~95℃，熔解温度每升高0.02℃采集1次数据，获得HRM曲线图。每个样本均做2个重复。
（3）DNA测序验证
所有先证者重新扩增进行测序分析（外送上海生物工程技术服务有限公司），以验证HRM分析结果，并确定突变性质。5个外显子的引物参考文献[5]。
PCR反应体系为：总体积50 μL，其中包含10×PCR缓冲液、Mg2+ 4.5 mmol/L、dNTP 0.4 mmol/L，上下游引物各1.0 μmol/L，Taq酶2 U，模板2 μL。
反应条件：94 ℃预变性3 min；94 ℃ 30 s，退火30 s（退火温度参考文献4），72 ℃ 30 s，35个循环；72 ℃延伸7 min，PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳检测。
（4）结果分析
参考国际PAH基因突变数据库（http：//www.pahdb.mcgil1.ca）确认和命名各类突变。
三、结果
1.PCR-HRM结果
部分外显子高分辨熔解曲线代表图见下图：
灰色曲线代表正常对照及无突变样本，红色曲线代表患者 第 11 外显子Y356X异常熔解曲线，homo=纯合突变。
图1-4 PAH基因第12外显子HRM分析结果
灰色曲线代表正常对照及无突变样本，红色曲线代表患者第 12 外显子A434D异常熔解曲线。
通过PCR-HRM分析，位于第5号外显子前的内含子IVS4-1G>A位点1例纯合，7例杂合；第6外显子F233L位点2例杂合；第7外显子R243Q位点 3个纯合，21例杂合；第11外显子Y356X位点9例杂合，第12外显子A434D位点3例杂合。野生型39例，纯合型4例，杂合型42例，总计46例患者发生上述相关的基因位点突变。
2.DNA 测序结果
PHA基因部分测序图：
图 2-3 Exon11 上Y356X（c.1068C>A）发生了 C→A 的转换
经 过 测 序 验 证，在 85 例 患 者 中 IVS4-1G>A、F233、R243Q、Y356X 和A434D 5个位点突变DNA 测序结果与 HRM分析结果完全相吻合。因此，在本研究中 HRM 突变筛查的敏感性和特异性均为 100%。
4 讨论
PKU是一种代谢性遗传性疾病，是我国较为常见的遗传病，发病率较高。突出的特点是苯丙酮尿症患儿在出生后前几个月表现都可以是正常的。如果不加治疗，3到6个月时他们就开始对周围的环境不感兴趣，到1岁时，他们的发育就明显迟缓。那些未经治疗、中枢神经已经受损的苯丙酮尿症患儿常常易怒、焦躁不安并具有破坏性，是一种严重致残的疾病。本病也是少数治疗效果比较好的遗传性疾病，只要能早期诊断、及时治疗可以收到良好的效果，甚至完全治愈，因此对新生儿进行PKU的基因诊断是非常需要的。
HRM是2002年由犹他大学和爱德华科技公司合作开发的一项新技术，也是近年来国际上兴起的一种最新的SNP及突变研究工具。这种检测方法不受突变碱基位点与类型局限，在进行针对已知位点的基因分型工作时，无需序列特异性探针，只需要合成低成本的非标记探针或者直接使用小片段扩增的方案，在 PCR 结束后直接就可以直接进行熔解曲线分析，实现了真正的闭管操作。已有研究证实其敏感性和特异性至少与其它突变检测技术一样优良，并且，一次可同时检测96个样本。以上充分体现了HRM分析技术简单、快速、低成本、准确、高通量的技术优势。高伟华等[6]采用 HRM 对PAH基因第7外显子c.728G > A 进行了检测，该技术实验结果与测序结果完全相符，表明用此方法可为PKU筛查与治疗检测提供快速而准确的检测依据，其具有灵敏度高，特异性好，快速高通量，重复性好的特点，为开展PAH基因的研究提供了简便、快速、准确的基因分析方法，也是一种适合临床PKU筛查和治疗检测的好方法。
本研究采用 HRM 对PAH基因第5、6、7、11和12外显子进行了检测，该技术实验结果与测序结果完全相符，表明用此方法可为PKU筛查与治疗检测提供快速而准确的检测依据，其具有灵敏度高，特异性好，快速高通量，重复性好的特点，为开展PAH基因的研究提供了简便、快速、准确的基因分析方法，也是一种适合临床PKU筛查和治疗检测的好方法。
参考文献：
[1]Dilella AG，et al.Molecular structure and polymorphic map of the human phenylalanine hydroxylase gene.Biochemistry，1986，25：743-746.
[2]顾学范.中国580万新生儿苯丙酮尿症和先天性甲状腺功能减低症的筛查.中华预防医学杂志，2004，38（2）：99-102.
[3]毛丹丹，傅咏南，王校等，苯丙酮尿症基因诊断研究方法.中国优生育，2013，1（8）：648-652.
[4]Guldberg P，Rey F，Zschoeke J，et a1.A European muhicenter study of phenylalanine hydroxylase deficiency：classification of 105 mutations and a general system for genotype-based prediction of metabolic phenotype.Am J Hum Genet，1998，63：71 79.
[5]王红，金煜炜，等.PCR限制性内切酶法苯丙酮尿症突变基因诊断中的应用.中华检验医学杂志，2008，31（2）：186-187.
[6].高伟华，周永安等.山西省经典型苯丙酮尿症患者苯丙氨酸羟化酶基因突变研究.中华医学遗传学杂志，2011，28：393-396.
基金项目：太原市科技局社会发展科技计划资助项目（11016209）
论文作者:任丽萍1,周永安2,张改秀3,郝子琪4,李鹏丽4,
论文发表刊物:《健康世界》2015年11期供稿
论文发表时间:2016/1/22
标签：突变论文; 基因论文; 曲线论文; 引物论文; 丙酮论文; 苯丙氨酸论文; 患儿论文; 《健康世界》2015年11期供稿论文;