昝云红[1]1998年在《水蛭素基因的合成及在酵母中表达与产物纯化的研究》文中指出水蛭素是从医蛭唾液腺中分离提纯的一种小分子蛋白，天然水蛭素有多个变异体，由65-66个氨基酸残基组成，含有3个二硫健，其中63位为一个硫酸化的酪氨酸，整个分子是无糖基化的单链多肽，具有较好的稳定性。水蛭素是特异性极强的凝血酶抑制剂，有较强的抗血液凝固作用，无明显毒副作用，是一种预防和治疗心脑血管栓塞非常有效、很有前途的多肽药物。天然提取水蛭素原料有限，产量很低，成本高，限制了其临床应用，利用基因工程技术开发重组水蛭素产品，克服了天然水蛭素的不足。在该项研究中将水蛭素基因转入酵母系统中进行表达，以评价人工合成基因在真核系统中表达的效率和探讨影响表达水平的因素。根据水蛭素变异体I(HV1)的氨基酸序列，选择酿酒酵母偏爱的密码子，设计了HV1基因。HV1基因分12个寡核苷酸片断人工合成，纯化后连接成一个完整的水蛭素基因。以此为模版进行PCR扩增，获得的HV1全基因连到克隆载体pBS-SK(+)上进行了DNA序列分析。结果显示与所设计的HV1基因完全一致。序列正确的HV1基因与酵母α因子信号肽基因相连，一起插入酵母表达载体pYC-DE-2。用正确的重组表达质粒转入酿酒酵母BJ1990细胞进行了初步表达实验，在筛选出的阳性克隆的培养上清中检测出的水蛭素活性为30ATU／ml，表达量达4mg／L。该表达量高于HV2在酵母中和HV1在原核系统的表达水平。表达产物通过硫酸铵沉淀，sephadex G50凝胶过滤，Q sepharose HP阴离子交换层析纯化，HPLC阳离子交换层析脱色，获得重组水蛭素纯品。纯品产量2mg／L，蛋白比活性8000ATU／mg。经N端氨基酸序列分析证实，与天然水蛭素氨基酸序列相符。本研究所采用的方法、选择的表达系统及初步表达纯化的结果表明，通过人工合成HV1基因和DNA重组技术，构建具有较强启动子的分泌型表达载体在酵母中进行表达是制备rHir的较好途径，此项工作也为重组水蛭素的规模化生产奠定了理论基础和实现途径。
马精彩[2]2010年在《多拷贝水蛭素基因在毕赤酵母中的分泌型表达》文中进行了进一步梳理天然水蛭素是从医用水蛭的唾液腺分泌的一种小分子活性多肽,是目前己知的自然界中最强的抗凝血因子,可有效防治血栓性疾病。由于天然水蛭素原料有限,产量低,成本高,限制了其临床应用,从而采用基因工程技术开发重组水蛭素,可克服以上不足。随着基因工程在医药领域的深入应用,重组水蛭素在细菌和酵母中的表达得到迅速发展。毕赤酵母表达系统是用于表达外源蛋白的最理想的表达系统之一,目前已有400多种外源蛋白在该表达系统中得以成功表达。本文旨在构建多拷贝分泌表达载体及水蛭素高表达酵母菌株,并获得具有抗凝血酶活性的表达产物,为水蛭素的研究及临床应用奠定基础。我们利用全基因化学合成法合成欧洲医蛭(Hirudo medicinalis)的水蛭素序列,克隆入毕赤酵母表达载体pA0815载体。毕赤酵母表达载体pA0815是Invitrogen公司开发的多拷贝胞内表达载体,可以通过提高整合入酵母细胞的外源基因拷贝数来提高外源蛋白的表达产量,但由于该载体缺乏分泌信号,其表达产物存在于酵母细胞内,因而容易被降解,降低了表达产量的同时也不利于表达产物的分离和纯化。为获得一个表达量更高、产物更易于分离纯化的表达系统,我们对pA0815和外源基因进行了巧妙的改造和构建。实验中我们用到两个载体pPIC9K和pA0815,这是目前应用非常广泛的酵母表达质粒,前者属分泌型质粒,其多克隆位点上游含有酵母α因子信号肽编码序列,表达产物可以分泌至胞外,极大简化了蛋白纯化方式；后者是胞内表达型质粒,提供构建多拷贝质粒的条件,使得表达载体在构建时即为多拷贝,大大提高了整合时产生多拷贝的几率,从而提高表达物的产量。我们首先合成水蛭素序列,克隆入毕赤酵母表达载体pPIC9K中构建pPIC9K-Hirudin重组质粒,然后从pPIC9K-Hirudin中扩增α-facor-Hirudin片段插入到载体pA0815中,使重组表达载体pAO815-α-facor-Hirudin具备分泌信号从而由胞内表达变成分泌表达。最后通过酶切连接等方法体外构建pAO815-(α-factor-Hirudin)n多拷贝重组质粒,从而得到了多拷贝分泌型表达载体。构建的多拷贝重组质粒线性化后转化毕赤酵母GS115,PCR筛选多拷贝表达菌株,经过甲醇诱导表达并优化表达条件,在30℃甲醇诱导120h的培养基中重组水蛭素的表达达到高峰。含尿素的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳显示培养基中含有单一的分子量为15kDa的蛋白条带,虽与计算的重组水蛭素7kDa的分子量不相符,但经分析和活性测定结果我们认为该条带为水蛭素的活性形式。活性测定表明表达的水蛭素有良好的抗凝血酶活性,抗凝活性达到1600ATU/ml。通过构建多拷贝分泌表达载体及水蛭素高表达酵母菌株,我们得到了分泌型的水蛭素高表达酵母菌株,并获得了具有抗凝血酶活性的表达产物,为水蛭素的研究及临床应用奠定了基础。
毕群, 黄仪秀, 朱圣庚[3]1997年在《水蛭素基因的递归PCR合成和在大肠杆菌中的表达与分泌》文中进行了进一步梳理水蛭素是凝血酶最强的特异抑制剂，可望成为预防和治疗各种血栓疾病的有效药物。根据医用水蛭（Ｈｉｒｕｄｏｍｅｄｉｃｉｎａｌｉｓ）头部水蛭素（ＨＶ－２）的氨基酸序列，通过递归ＰＣＲ，合成水蛭素基因，并重组到本实验室改建的大肠杆菌分泌型表达载体ｐＩＮ－ｏｍｐＡ－ＨＩ中，使水蛭素基因的编码序列直接位于大肠杆菌外膜蛋白Ａ信号肽序列的下游。转化大肠杆菌ＤＨ５α，筛选出重组体，经ＰＣＲ，限制酶切图谱和序列分析，结果表明所合成的水蛭素基因与设计完全一致。水蛭素基因在大肠杆菌中得到表达，重组水蛭素（ｒＨＶ－２）被分泌到细胞周质及培养基中，表达量占菌体蛋白的１９．８％，并且有明显抗凝血酶生物活性。经分离纯化，产物在质谱分析中显示基本为单一成分，分子量为６８９３．１Ｄａ，证明重组水蛭素在分泌过程得到正确加工。
参考文献：
[1]. 水蛭素基因的合成及在酵母中表达与产物纯化的研究[D]. 昝云红. 中国协和医科大学. 1998
[2]. 多拷贝水蛭素基因在毕赤酵母中的分泌型表达[D]. 马精彩. 天津医科大学. 2010
[3]. 水蛭素基因的递归PCR合成和在大肠杆菌中的表达与分泌[J]. 毕群, 黄仪秀, 朱圣庚. 北京大学学报(自然科学版). 1997