中南大学湘雅医院：1.胸外科；2.医学实验中心；湖南长沙 410008
摘要：目的 探讨SH2B1对肺腺癌细胞株LTEP-a-2细胞增殖及运动能力的影响。方法 采用RNA干扰技术建立稳定剔除SH2B1的肺腺癌细胞株LTEP-a-2，同时扩增同等滴度的空载病毒（GV-CMV）作对照。并用RT-PCR和Western Blot方法检测转染效率，在此基础上采用细胞形态及核型分析、MTT法绘制细胞生长曲线、平板集落形成试验分析比较实验转染组、载体对照组细胞生长、凋亡的改变，对细胞的增殖能力进行鉴定；细胞划痕实验分析SH2B1对肺腺癌细胞株LTEP-a-2细胞爬行迁移运动的影响，用Trans-well实验分析SH2B1对肺腺癌细胞株LTEP-a-2细胞侵袭运动的影响。结果 RNA干扰技术建立稳定剔除SH2B1的肺腺癌细胞株LTEP-a-2细胞SH2B1表达量明显下降。剔除SH2B1的肺腺癌细胞株LTEP-a-2细胞增殖显著下降（P<0.05）。划痕实验结果显示，实验转染组和载体对照组迁移细胞数目倒置显微镜下10个视野分别为349±121和867±187，实验转染组爬行细胞数目显著低于空载体组，P<0.05；Trans-well实验结果表明，实验转染组和载体对照组细胞透过滤膜的数目分别是129±88和278±107，实验转染组细胞穿过数目显著低于载体对照组，P<0.05。结论 SH2B1促进肺腺癌细胞株LTEP-a-2细胞增殖和迁移运动能力。
关键词：SH2B1；肺腺癌；细胞增殖；转移；侵袭
肺癌为最常见的恶性肿瘤之一，其发病率及死亡率居恶性肿瘤之首[1]。肺癌按组织学分为鳞癌、腺癌、大细胞癌和小细胞癌，其中腺癌约占全部肺癌的30%[2]。近年来许多国家肺腺癌已经成为最常见的肺癌组织类型，我国肺腺癌发病率也呈逐年上升的趋势[3]。由于肺腺癌一般发病隐匿且早期症状不明显而易被忽视，多数患者首诊时已发生癌细胞的侵袭或转移，即使手术后多数患者也可能会死于肺腺癌复发或远处转移，所以肺癌的侵袭转移已成为了影响肺腺癌患者预后的重要因素[4]。因此，探讨肺癌细胞的浸润和转移过程，寻找预测侵润及转移的生物标记物或干预治疗的靶分子，可能提高肿瘤患者诊断、治疗及预后水平。肺腺癌的浸润及转移过程，为一系列的复杂的分子事件联合作用的生物学过程。在这个复杂的过程中，酪氨酸激酶受体通路是细胞信号转导通路中最重要的转导通路之一，调节细胞一系列病理、生理过程[5]。在许多癌基因活化所导致的酪氨酸激酶活性增强从而引发肿瘤的病理过程中均可见到SH2蛋白家族的参与。接头蛋白SH2B1作为SH2蛋白家族的一员，主要介导含有酪氨酸磷酸化的信号转导途径。有研究表明SH2B1在包括结肠癌[6]、食管癌[7]、非小细胞肺癌[8]、卵巢浆液性癌[9]中表达较正常组织增加，可能系SH2B1促进了癌症的发生发展。本文以肺腺癌细胞株LTEP-a-2细胞为研究对象，探索SH2B1在癌细胞增殖和迁移运动中的作用，为肺腺癌发病机制探索提供可能的实验依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 细胞株 肺腺癌细胞株LTEP-a-2细胞（购自中国科学院上海细胞库）均来源于人肺癌上皮组织，体外培养建立细胞系，生长特性均为贴壁粘附性生长，生长周期为24~48h。
1.1.2 干扰慢病毒 从赛默飞世尔科技公司（Thermo Fisher Scientific）购买SH2B1干扰慢病毒（GIPZ Lentiviral Human SH2B1 shRNA）及相应载体对照。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养 上述细胞均用含10%胎牛血清的完全DMEM培基于37℃，5%CO2培养箱内单层传代培养。
1.2.2 采用RNA干扰技术建立稳定剔除SH2B1的肺腺癌细胞株LTEP-a-2合成SH2B1基因的小分子干扰RNA（siRNA）编码片段，构建编码SH2B1基因siRNA的选择性增殖慢病毒载体（重组慢病毒中有绿色荧光蛋白真核表达框），重组慢病毒载体（GIPZ Lentiviral Human SH2B1 shRNA）在293 T细胞内扩增，回收病毒滴度为10^8~10^9 pfu/mL，同时扩增同等滴 度的空载病毒作对照。用转染复数（multiplicities of infection，MOI）为100 的重组慢病毒载体感染90% 左右融合度的肺腺癌细胞株LTEP-a-2（同时用MOI为100 的空载病毒感染LTEP-a-2作对照）。然后采用倒置荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达，并用RT-PCR和Western Blot方法检测转染效率，建立稳定剔除SH2B1的肺腺癌细胞株LTEP-a-2。
1.2.3 Western Blot方法检测肺腺癌细胞株LTEP-a-2细胞SH2B1蛋白表达 将剔除SH2B1的肺腺癌细胞株LTEP-a-2细胞（1×10^6），培养后收集细胞，PBS缓冲液冲洗后加入300μL裂解液RIPA+PMSF，冰上振摇裂解30min。12000rpm离心10nin，吸取上清，测定蛋白浓度。蛋白内加入1/4体积的5×上样缓冲液，水中煮沸5min，12%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，湿转移方法转PVDF膜，10%脱脂奶粉封闭1h后加入1∶500稀释的一抗（兔抗人SH2B1抗体），用微量振荡器轻轻摇动1h，缓冲液漂洗3次后加入1∶1 000稀释的二抗（辣根过氧化物酶标记的鼠抗兔抗体）轻轻摇动30min，缓冲液漂洗3次后加入化学发光试剂ECL，X光片曝光，显影，定影后进行分析。
1.2.4 RT-qPCR检测干涉基因mRNA量的变化 当培养瓶细胞株长满时，用PBS洗涤2~3次后加入TRIzol试剂，按照说明书操作步骤提取RNA，使用分光光度计检测RNA质量和浓度，要求A260nm/A280nm比值为1.9~2.0，进行纯化和鉴定。按照试剂说明书操作，取总RNA用反转录酶将其转化为cDNA。4℃保存用于扩增，然后以cDNA为模板，利用各基因的检测引物进行qPCR。反应条件为：95℃变性10s，60℃退火30 s，72℃延伸30s；共40个循环。
1.2.5 MTT法检测SH2B1对肺腺癌细胞株LTEP-a-2细胞的增殖影响 取对数生长期肺腺癌细胞株LTEP-a-2细胞，调整细胞浓度为2.0×10^4个/mL，接种于96孔板中，每孔200μL，同时设置对照孔（无细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液），每组设置9个平行孔，于37℃，5%CO2条件下培养24，48，72h收获细胞，收获细胞之前4h每孔加入5mg/mL MTT液20μL，培养结束时弃去上清液，每孔加入DMSO 150μL，微量震荡器震荡10min，使沉淀结晶物完全溶解，测取490nm波长的吸光值。
1.2.6 划痕实验检测SH2B1对肺腺癌细胞株LTEP-a-2细胞迁移运动的影响 取对数生长期肺腺癌细胞株LTEP-a-2细胞，设置空载体对照组和实验转染组。按2×10^5个细胞/孔，将细胞加入6孔板，加入RPMI1640完全培养基，置于37℃ 5%CO2培养箱内孵育24 h后，用无菌200μL tip头垂直划出一无细胞的细痕，制作培养细胞伤口模型。相差显微镜下测微器测量伤口宽度，此时作为划痕后零时，以后分别继续培养24和48 h后测定1次、拍照。每组设3个复孔，重复3次独立实验。
1.2.7 Trans-well检测 肺腺癌细胞株LTEP-a-2细胞运动侵袭能力按Borden-body说明书略加改进。加无血清RP-MI1640培养液冲洗小室，加Matrigel胶，摇匀使其铺满上室底部，制备人工基底膜。上室加肺腺癌细胞株LTEP-a-2细胞2×10^4个，下室加入含血清培养液，37℃培养50 h，取出Borden小室。显微镜下计数基底膜下室面细胞数。重复3次，取平均数作为实验结果并拍照。
1.3 统计学处理
资料采用SPSS20.0统计软件对数据进行统计学分析，数值用（）表示，两组均数比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 免疫荧光技术检测剔除SH2B1的肺腺癌细胞株LTEP-a-2细胞转染效率
实验转染组及载体对照组表现转染效率高，有荧光。（图1）。
图1 实验转染组和对照组绿色荧光显示
2.2 Western Blot方法检测肺腺癌细胞株LTEP-a-2细胞SH2B1蛋白表达
Western Blot分析SH2B1的表达。结果显示，在实验转染组细胞中表达效率较低（图2），而载体对照组细胞表达明显高于前者。因此在细胞增殖中采用该浓度分析SH2B1对肺腺癌细胞株LTEP-a-2细胞增殖的影响。
图2 实验转染组和载体对照组SH2B1蛋白表达情况
2.3 SH2B1基因促进肺腺癌细胞株LTEP-a-2细胞增殖
用MTT法分别测定转染24，48，72，96h后实验转染组和载体对照组细胞增殖情况。结果显示，实验转染组肺腺癌细胞株LTEP-a-2细胞的平均光密度值变化较小；载体对照组组肺腺癌细胞株LTEP-a-2细胞的平均光密度则随培养时间的延长而明显增加（OD24h<OD48h<OD72h<OD96h）（图3）。载体对照组的肺腺癌细胞株LTEP-a-2细胞在培养过程中呈连续增长趋势，转染48h和72h后肺腺癌细胞株LTEP-a-2细胞增殖明显低于空载体对照组（P<0.05）（表1）（图3），提示SH2B1基因对结肠癌细胞增殖有明显的促进作用。
图3 SH2B1基因促进肺腺癌细胞株LTEP-a-2细胞增殖
2.4 划痕实验的结果
为探讨SH2B1对肺腺癌细胞株LTEP-a-2细胞转移的影响，本研究观察其对肺腺癌细胞株LTEP-a-2细胞运动能力的影响。结果表明，实验转染组细胞爬行运动能力明显弱于空载体组，载体对照组肺腺癌细胞株LTEP-a-2细胞爬满划痕的间隙，细胞生长良好，呈索形及多角形，细胞极性明显，透亮。实验转染组划痕间隙明显，间隙中只有少数细胞生长，细胞呈短索形，多角形细胞少见，极性不明显（图4）。细胞计数结果，显微镜10个视野分别为实验转染组349±121，空载体组867±187。统计学分析，实验转染组细胞迁移能力低于空载体组（见图4），P<0.01，提示SH2B1增强结肠癌细胞爬行能力。
图4 SH2B1对肺腺癌细胞株LTEP-a-2细胞迁移运动的影响
2.5 Trans-well检测SH2B1对肺腺癌细胞株LTEP-a-2细胞运动侵袭能力的影响
进一步观察SH2B1对肺腺癌细胞株LTEP-a-2细胞穿透能力的影响。结果显示，实验转染组48 h内透过人工基底膜的细胞数明显少于载体对照组。试验对照组细胞密、数量相对少，染色浅；载体对照组细胞数量明显多，染色深。通过计数实验转染组和载体对照组穿过人工基底膜的细胞数进行比较，实验对照组细胞的运动侵袭能力显著减弱（图5）。细胞计数结果，实验对照组129±88和载体对照组278±107，统计学分析差异有统计学意义。表明SH2B1显著增强肺腺癌细胞株LTEP-a-2细胞侵袭运动。
图8 SH2B1对肺腺癌细胞株LTEP-a-2细胞侵袭转移的影响
3 讨 论
胞浆接头蛋白SH2B1 是由Osborne 等利用酵母三杂交系统研究磷酸化IgE 受体（FceR I）γ链胞浆酪氨酸激酶的相互作用蛋白时而被发现的[10]。它是酪氨酸激酶受体A（TrkA）与细胞膜相连的结合蛋白，主要介导含有酪氨酸磷酸化的信号转导途径。SH2B1蛋白因C端不同而分为四种不同的亚型（α、β、γ和δ），但它们拥有相同的N端，均含有SH2、PH 及多聚脯氨酸等共同的结构域，属于SH2蛋白家族的新成员，其基因定位于人染色体16p11.2 区域。
研究报道，SH2B1可通过其SH2结构域与胰岛素、胰岛素样、神经生长因子等多种具有酪氨酸激酶活性的受体直接结合并增强受体酪氨酸激酶活性，也可直接与非受体类酪氨酸激酶JAK2 结合增强其信号传递参与细胞增殖、免疫及糖脂代谢、神经细胞伪足形成等多种生理学功能[11，12]。
SH2B1 与肿瘤的发生发展密切相关。研究报道，促癌物佛波醇、生长激素等可诱导SH2B1 磷酸化并增加粘着斑数量和大小调节促进细胞骨架蛋白重排，由于细胞骨架蛋白的动态变化与细胞的运动迁移和侵袭能力密切相关，表面SH2B1 蛋白可能通过影响细胞骨架蛋白的重排促进细胞迁移，参与肿瘤转移[13-15]。
本课题组研究发现NSCLC中SH2B1呈高表达，且表达水平与NSCLC肿瘤的大小、肿瘤的分级、临床分期淋巴结转移以及复发率成正相关[8]。由此可见，SH2B1可能是NSCLC癌变相关蛋白，其表达水平与NSCLC侵袭转移密切相关。为了进一步研究SH2B1是否参与了肺腺癌的发生、发展，先要研究SH2B1是否促进肺腺癌细胞的增殖与运动能力。本实验通过Western Blot方法选取了SH2B1表达较高的肺腺癌细胞株LTEP-a-2细胞，并通过RNA干扰技术建立稳定剔除SH2B1的肺腺癌细胞株LTEP-a-2细胞，研究结果表明被剔除SH2B1的肺腺癌细胞增殖能力及迁移运动能力显著下降。提示SH2B1蛋白可能通过促进肺腺癌细胞增殖及迁移运动能力而参与肺腺癌的转移。
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论文作者:周卧龙1,陈,伟1,段朝军2,高,阳1,程远大1
论文发表刊物:《健康世界》2015年11期供稿
论文发表时间:2016/1/22
标签：腺癌论文; 细胞株论文; 细胞论文; 转染论文; 载体论文; 酪氨酸论文; 蛋白论文; 《健康世界》2015年11期供稿论文;