曲颂[1]2006年在《DNA-PK蛋白的表达与鼻咽癌放射敏感性关系的实验研究》文中研究表明【研究背景与目的】鼻咽癌( nasopharyngeal carcinoma,NPC )是我国常见的恶性肿瘤之一,在我国南方地区尤为高发,由于鼻咽部解剖位置的特殊性及鼻咽癌细胞对射线较为敏感的特点,放射治疗被认为是首选的治疗手段。近年来,由于放疗设备不断更新、放疗技术更趋完善、放射物理及放射生物学研究的不断进步,使NPC单纯放疗的疗效得到较大的提高,目前,单纯放疗5年生存率已超过50%。众所周知,病理类型、临床分期、患者年龄、体质等是影响NPC预后的主要因素,但在日常的临床工作中也不难发现,前述情况基本相似的不同患者,其治疗效果却有较大差异,治疗失败的原因之一为放射抗拒,故研究其抗拒机制、寻找放射增敏途径是提高治愈率的途径之一,在放射治疗前即对其放射敏感性作出预测性分析是目前放射生物学的研究热点之一。放射线导致细胞损伤的主要靶点是DNA,由放射线的直接作用和电离效应产生的自由基共同导致的DNA单链和双链断裂损伤,其中以DNA双链断(DNA double-strand break,DSB)裂损伤最为重要。放射敏感性主要与照射后DNA双链断裂的数目及其修复的程度有关,人类的DSB修复以非同源末端连接途径(non-homology end joining , NHEJ)为主,参与NHEJ的主要成份有DNA-PKcs、Ku70、Ku80、ligaseⅣ、XRCC4。DNA-PK(DNA dependent protein kinase)是哺乳动物细胞中参与NHEJ主要的分子途径之一,是由Ku70、Ku80、DNA-PKcs三个亚基组成。其中Ku70、Ku80组成Ku蛋白调节亚基,在DSB修复中起着辨认、结合排列DNA末端并募招催化亚基DNA-PKcs的作用。它由分子量为70kDa的Ku70和80～87kDa的Ku80 (又称Ku86 )组成,DNA-PK催化亚基DNA-PKcs分子量为470kDa
吴冉[2]2013年在《鼻咽癌细胞凋亡及凋亡相关基因表达与放射敏感性的关系研究》文中进行了进一步梳理目的：探讨鼻咽癌细胞自发性凋亡及辐射诱发的细胞凋亡对放射敏感性的预测作用，进一步阐明凋亡及放射敏感性存在差异的分子学基础。方法:（1）克隆形成实验测定CNE-1、CNE-2不同剂量照射后的存活分数，单击多靶模型和线性二次函数模型拟合辐射剂量存活曲线并求出放射生物学参数。（2）流式细胞术检测CNE-1、CNE-2自然生长天数（2，4，6，8d）下细胞凋亡情况，RT-PCR、Westernblot方法检测CNE-1、CNE-2自然状态下凋亡相关基因Bax、Bak、Bad、Bid、Bcl-2、Bcl-xl、Bcl-w转录及蛋白表达水平。（3）流式细胞术及RT-PCR方法检测不同剂量X线（2，4，6，8Gy）照射后CNE-1、CNE-2凋亡率及凋亡相关基因Bax、Bak、Bad、Bid、Bcl-2、Bcl-xl、Bcl-w的转录水平。结果:（1）CNE-1在各个剂量点的存活分数均比CNE-2高，函数模型相关参数显示：NCNE-1> NCNE-2，D0CNE-1> D0CNE-2，Dq CNE-1> DqCNE-2，αCNE-1<αCNE-2，βCNE-1> βCNE-2，α/βCNE-1<α/βCNE-2，SF2CNE-1> SF2CNE-2。（2）相同培养天数及相同剂量点CNE-2早期凋亡率及晚期凋亡率明显高于CNE-1(均P<0.05)；（3）自然状态下CNE-2中抑凋亡基因Bcl-2、Bcl-xl、Bcl-w及促凋亡基因Bax、Bad、Bid、Bak转录及蛋白表达水平均明显高于CNE-1（均P<0.05）。（4）CNE-1照射后出现Bax表达上调，与辐射剂量呈正相关；Bcl-xl表达下调，与辐射剂量无明显相关性；Bcl-2表达上调，在4Gy时到达峰值后开始下降。CNE-2照射后出现Bax、Bak表达上调，Bcl-w表达下调，与辐射剂量分别呈正、负相关性；Bcl-xl表达下调，与辐射剂量无明显相关性。结论：（1）CNE-2较CNE-1具有更高的辐射敏感性。（2）自发凋亡率及辐射诱发的细胞凋亡率可作为放射敏感性的预测指标。（3）CNE-1、CNE-2放射敏感性差异的机理可能与照射前后多种促凋亡及抑凋亡基因差异性表达有关。
许茂轩[3]2012年在《Cyclin D1及Survivin表达与鼻咽癌放疗敏感性的相关性研究》文中认为目的：鼻咽癌是一种以放射治疗为主的恶性肿瘤,由于不同个体的病人存在着放疗敏感性的差异,故探索预测鼻咽癌病人放射敏感性的指标,对制定合理的个体化放疗方案具有重要意义。本实验旨在探讨Cyclin D1和Survivin的表达情况与鼻咽癌放疗敏感性的关系,期望能够找出预测鼻咽癌放疗敏感性的具有统计学意义的指标。方法：选取80例鼻咽癌患者放疗前活检组织标本(放疗敏感组40例,放疗耐受组40例),常规HE染色确定组织分型；免疫组化技术S-P法检测Cyclin D1和Survivin的蛋白表达情况；荧光定量RT-PCR法检测Cyclin D1和Survivin的mRNA的表达情况；TUNEL法检测标本中细胞凋亡指数。应用统计学软件IBM SPSS Statistics20进行χ~2检验、One-way ANOVA方差分析及Spearman相关性分析。结果：(1)通过数据分析发现,鼻咽癌的放疗敏感性与患者组织类型、分化类型和临床分期有显著相关性(P<0.05),与患者性别和年龄无明显关系(P>0.05)(2)通过免疫组化发现,Cyclin D1蛋白在鼻咽癌放疗敏感组和放疗耐受组的高表达率分别为22.5%(9/40)和70%(28/40),两组比较有统计学差异(P<0.05)；Survivin蛋白的高表达率分别为35.0%(14/40)和77.5%(31/40),两组比较有统计学差异(P<0.05)。Cyclin D1和Survivin的蛋白表达呈正相关性,r=0.313(P<0.05)。CyclinD1和Survivin的表达与鼻咽癌的组织类型、分化类型和临床分期有显著相关性(P<0.05),与患者性别和年龄无明显关系(P>0.05)。(3)通过Real-time PCR发现,Cyclin D1mRNA在鼻咽癌放疗敏感组和放疗耐受组的相对表达量(RQ值)的平均值分别为16.62±2.24和31.44±2.97,两组比较有统计学差异(P<0.05)；Survivin mRNA在鼻咽癌放疗敏感组和放疗耐受组的相对表达量(RQ值)的平均值分别为29.48±3.19和45.38±4.57,两组比较有统计学差异(P<0.05)。(4)通过细胞凋亡检测发现,放疗敏感组和放疗耐受组的凋亡指数分别是15.93±2.44和8.56±1.81两组之间比较,差异显著(P<0.05)。Cyclin D1高表达组和低表达组的凋亡指数分别是10.17±2.23和14.2±2.95,两组之间比较,差异有统计学意义(P<0.05)。Survivin高表达组和低表达组的凋亡指数分别是7.81±1.54和16.68±2.76,两组之间比较,差异有统计学意义(P<0.05)结论：(1)鼻咽癌的放疗敏感性与患者组织类型、分化类型和临床分期有显著相关性,与患者性别和年龄无明显关系。(2) Cyclin D1和Survivin的表达水平与鼻咽癌放疗敏感性呈负相关,可以作为预测鼻咽癌患者放疗敏感性的分子标志。Cyclin D1和Survivin的表达水平与鼻咽癌的组织类型、分化类型和临床分期有显著相关性,与患者性别和年龄无明显关系。(3)细胞凋亡水平与鼻咽癌放疗敏感性呈显著正相关,鼻咽癌细胞凋亡水平可以作为预测其放疗敏感性的有效指标。同时发现Cyclin D1和Survivin的表达水平与鼻咽癌细胞凋亡水平呈负相关,证明Cyclin D1和Survivin的表达水平可以作为评估细胞凋亡的有效指标。。(4)鼻咽癌组织中Cyclin D1和Survivin的表达水平呈正相关,同时检测这两个基因的表达水平能更加准确预测鼻咽癌患者的放疗敏感性。
潘智育[4]2017年在《靶向调控RAC1与鼻咽癌放射敏感性关系的动物实验研究》文中研究说明目的:构建稳定沉默和过表达RAC1基因的低分化鼻咽癌CNE-2细胞系,建立鼻咽癌裸鼠移植瘤模型,在体内研究靶向调控RAC1与鼻咽癌放射敏感性的关系,证实RAC1作为鼻咽癌放射治疗增敏靶点的可能性。方法:1.利用RNA干扰和基因过表达基因重组技术,构建沉默和过表达RAC1基因的慢病毒表达载体,感染鼻咽癌CNE-2细胞,通过荧光显微镜和Western blot法筛选出最佳感染条件和最佳沉默靶序列,建立稳定沉默和过表达RAC1基因的鼻咽癌CNE-2细胞系。2.对沉默和过表达RAC1基因的鼻咽癌CNE-2细胞,采用MTT法绘制生长曲线,划痕实验检测细胞迁移能力,流式细胞仪检测细胞周期变化,Western blot法检测RAC1/NADPH信号通路中关键蛋白P67、P47和RAC1的表达情况。3.将沉默和过表达RAC1基因的鼻咽癌CNE-2细胞悬液接种于裸鼠皮下,构建鼻咽癌裸鼠移植瘤模型,接种14 d给予4 Gy单次照射处理,照射10 d后处死裸鼠。记录裸鼠一般情况、体重和移植瘤重量及体积变化,绘制裸鼠体重变化曲线、移植瘤生长曲线。取瘤体组织,HE染色观察瘤体的病理学变化,免疫组化和Western blot法检测RAC1/NADPH信号通路中RAC1、P67和P47关键蛋白表达情况,透射电镜观察瘤体组织细胞中超微结构的变化。结果:1.成功构建沉默和过表达RAC1基因的慢病毒表达载体,测序结果显示插入序列正确。病毒颗粒转染鼻咽癌细胞后分别获得RAC1沉默的RAC1(-)细胞,RAC1过表达的RAC1(+)细胞,荧光显微镜下观察其感染效率高于95%,Western blot结果显示RAC1(+)细胞RAC1蛋白表达显著高于对照组,RAC1(-)细胞RAC1蛋白表达显著低于对照组。2.体外实验表明,与对照组比较,鼻咽癌RAC1(-)细胞生长增殖速度增加,迁移速度减慢,细胞中P67、P47和RAC1蛋白表达明显下降(P<0.05);RAC1(+)细胞增殖速度没有改变,但是迁移速度加快,并上调NADPH氧化酶的关键亚基P67、P47和RAC1蛋白表达(P<0.05);但不管是沉默还是过表达RAC1基因,其细胞周期各时相比例无明显改变。3.成功构建鼻咽癌裸鼠移植瘤模型,成瘤率100%。照射前各组裸鼠体重稳步上升,各组间无统计学差异;裸鼠移植瘤生长迅速,其中RAC1(+)组和RAC1(-)组的瘤体生长速度略快于对照组。但在第14 d进行4 Gy照射后,各组裸鼠体重均下降,尤其是RAC1(-)组体重下降最明显。而各组的瘤体体积均比相应未照射组有不同程度的缩小,其中RAC1(+)和RAC1(-)组的瘤体与照射前相比急剧缩减。裸鼠处死后,照射组移植瘤体重量均比相应不照射组减轻,其瘤重下降率RAC1(+)组最为明显,高达68%。瘤组织的HE染色可见,照射后RAC1(-)组角质纤维化、核固缩明显,RAC1(+)组细胞大面积坏死、核碎裂明显,其他组间差异不明显。Western blot和免疫组化结果显示,RAC1(-)组瘤组织P67、P47和RAC1表达下调,联合照射的RAC1(-)组下调更为明显。RAC1(+)组P67、P47和RAC1表达增高,而联合照射的RAC1(+)组上调更为明显。透射电镜下可以观察到除对照组外,各瘤组织细胞出现出不同程度的超微结构改变,其中照射后RAC1(-)组线粒体肿胀、空泡样改变明显,线粒体内膜和外膜模糊不清,嵴消失,部分嵴融合;而照射RAC1(+)组细胞结构不完整,出现细胞溶解坏死,细胞膜破裂,核碎裂,细胞器损坏消失,可见大量细胞碎片形成。结论:1.成功构建沉默和过表达RAC1基因慢病毒表达载体及沉默和过表达RAC1基因的低分化鼻咽癌CNE-2细胞系。2.沉默或过表达RAC1基因能有效抑制或上调NADPH氧化酶关键亚基P67、P47和RAC1蛋白表达。3.建立了慢病毒介导沉默和过表达RAC1裸鼠鼻咽癌移植瘤模型,体内实验证实,联合4 Gy照射,过表达RAC1能明显增加瘤体对辐射敏感性,RAC1有望成为鼻咽癌放射增敏调控新靶点。
武岳[5]2014年在《Evi1通过上调miR-33抑制p53表达进而促进鼻咽癌细胞增殖》文中进行了进一步梳理研究背景和目的:鼻咽癌是我国南方部分省份最为常见的肿瘤之一,其发病率约为每10万人25～50例,是西方国家的50-100倍。先前的研究表明鼻咽癌的发生与遗传因素、EBV感染以及环境因素相关,有较为显著的家族聚集倾向性。患者基因组多存在不稳定性,易受各种环境因素的影响。EB病毒研究显示,在鼻咽癌患者的血清中,抗EB病毒抗体的种类和含量均高于一般人。可见,EB病毒与鼻咽癌的发生发展有着极其密切的关系。Evi1(Ecotropic viral integration site 1)基因是作为逆病毒的整合位点,在患髓细胞样白血病的老鼠中被发现和鉴定,逆病毒的整合使Evi1活化从而导致髓细胞样白血病的发生[1]。在人类,由于染色体t(3;21)(q26;q22)的移位或inv[2](q21q26)的倒位所致Evi1异常表达被认为与慢性髓细胞样白血病(CML)、急性髓细胞样白血病(AML)的发生相关,Evi1的持续高表达也被公认为AML的不良预后指标[3]。此外在卵巢癌[3]、结肠癌[4]和肺癌[5]等实体癌中也发现Evi1高表达。这些证据表明Evi1在肿瘤的起始和进展中起到极为重要的作用。Evi1的肿瘤促进作用是通过抑制转化生长因子β(TGF-β)的信号转导来实现,Evi1直接与TGF-β的效应分子Smad3相结合而阻断TGF-β信号的传递[6,7],或者通过与CtBP(C末端结合蛋白)相结合来抑制Smad3的功能[8]。Evi1通过两段5氨基酸序列(PFDLD......PLDLS)与CtBP结合,CtBP然后把Smad3从一个对TGF-β反应的转录活化子转换成一个转录抑制子[8,9]。EBNA3A是EBV对细胞转化所必需的五个基因之一[10,11],也是通过与CtBP相结合来促进细胞转化[12]。值得指出的是,EBNA3A是通过与Evi1五氨基酸序列类似的位点而与CtBP结合。这一现象提示,Evi1可能在功能上与EBNA3A重叠,并与鼻咽癌的发病有关。在前期实验中,我们采用微阵列比较基因组技术,发现位于3q26区的瘤基因Evi1和PKC(?)在鼻咽癌中共扩增。随之发现Evi1在大多数鼻咽癌细胞系和原发性鼻咽癌组织中均有较强表达。采用慢病毒shEvi1感染Evi1高表达的鼻咽癌细胞,沉默Evi1蛋白,导致细胞体外增殖显著减缓,裸鼠体内致瘤性显著降低。TP53基因是迄今发现与人类肿瘤相关性最高的基因,约有50%以上的肿瘤患者被发现有TP53基因突变,约有70%-80%的肺癌患者发现有TP53基因突变,而且TP53基因突变在肿瘤发生中是早期事件,可应用于肿瘤的早期诊断[13]。TP53基因位于人染色体17q13.1区带,编码的野生型p53蛋白包含N-末端的转录激活结构域、DNA结合结构域、四聚体化结构域和C-末端调节域[14]。p73、p51、p63等基因由于在结构上与TP53基因具有同源性,因而被归为TP53基因家族[15]。TP53基因与其上、下游功能相关基因组成了一个复杂的基因网络,是联系不同遗传应急和细胞应答的中间环节。离子辐射、化疗药物及异常的细胞生长信号均能刺激TP53基因表达[16]。p53表达升高后,可通过p53-MDM2环路对p53表达水平进行精确调节。p53可以调控下游多种基因表达,其功能主要表现在阻滞细胞周期、促进细胞凋亡、维持基因组稳定性和抑制肿瘤血管生成四个方面[17,18]。microRNA是一种调节性的非编码小分子RNA,其在生命活动中起着重要的作用。microRNA 一般作用于靶标分子mRNA的非编码区,通过不完全互补配对的方式抑制靶标mRNA的翻译,从而对靶标基因在转录后水平进行调控[19]。研究发现,miR-33与多种肿瘤发生有关,miR-33能特异性结合于p53 mRNA的3'-UTR区,抑制p53表达,从而促进细胞增殖,抑制细胞凋亡[20]。在本研究中我们采用一系列分子生物学及细胞生物学技术,首次证明了 Evi1通过miR-33下调p53蛋白表达水平,影响其下游信号通路,进而影响鼻咽癌细胞的增殖、凋亡以及致瘤性。研究内容及方法:一、Evi1通过miR-33对p53进行调节(一)Evi1基因对p53表达的抑制作用1.采用免疫组化检测Evi1和p53在鼻咽癌组织中表达的相关性。2.采用Westen Blot方法,检测鼻咽癌细胞株SUNE1、CNE1、CNE2、HONE1、6-10B、5-8F以及永生化鼻咽上皮细胞NP69中Evi1和p53的表达水平。3.合成siEvi1,转染HONE1细胞,沉默Evi1。4.构建pWPI-Evi1慢病毒过表达载体,包装慢病毒感染鼻咽癌细胞6-10B,过表达Evi1。5.采用Westen Blot方法,检测在HONE1中沉默Evi1和在6-10B中过表达Evi1后,p53的表达水平。6.采用细胞免疫荧光技术,检测Evi1和p53在HONE1和NP69中的表达水平和定位以及在沉默Evi1的HONE1细胞中的表达水平和定位。(二)Evi1对p53的调节作用1.采用Westen Blot方法,分别在HONE1中沉默Evi1和在6-10B中过表达Evi1,检测p53表达水平的变化。2.采用细胞免疫荧光技术,检测在HONE1细胞中沉默Evi1后p53的表达水平和定位。(三)miR-33对p53的调节作用分别在HONE1和6-10B细胞中过表达和抑制miR-33,通过western blot检测p53表达水平的变化。(四)Evi1对miR-33的调节作用1.分别在HONE1中沉默Evi1和在6-10B细胞中过表达Evi1,采用RT-PCR技术,检测miR-33的变化情况。2.构建pGL4.51-miR-33promotor荧光素酶报告载体,与pcDNA-Evi1表达载体共转染293T细胞,检测Evi1基因对miR-33 promotor的调控作用。3.构建PGL4.51-miR-33 promotor点突变荧光素酶报告载体,明确miR-33 promotor区的Evi1调节位点。(五)Evi1通过miR-33对TP53基因表达的调控作用1.采用Westen Blot方法,分别在HONE1细胞中沉默Evi1的同时上调miR-33和在6-10B细胞中过表达Evi 1的同时抑制miR-33,检测p53表达水平的变化。2.采用免疫荧光技术,检测p53在沉默Evi1的HONE1细胞和沉默Evi1的同时上调miR-33的HONE1中的表达情况。二、在鼻咽癌细胞中Evi1通过miR-33调节p53信号通路,进而调节鼻咽癌细胞的增殖和凋亡。(一)Evi1对鼻咽癌细胞增殖的调节作用1.以siEvi1序列为基础构建shEvi1,稳定转染HONE1和6-10B细胞,沉默Evi1。2.采用MTT方法,检测沉默Evi1的HONE1细胞和沉默Evi1的同时上调miR-33的HONE1细胞以及过表达Evi1的6-10B细胞和过表达Evi1的同时抑制miR-33的6-10B细胞的6天生长曲线。3.采用EdU方法,检测沉默Evi1的HOE1细胞和沉默Evi1的同时上调miR-33的HONE1细胞以及过表达Evi1的6-10B细胞和过表达Evi1的同时抑制miR-33的6-10B细胞的EdU的吸收水平。4.采用平板克隆实验,检测沉默Evi1的HONE1细胞和沉默Evi1的同时上调miR-33的HONE1细胞以及过表达Evi1的6-10B细胞和过表达Evi1的同时抑制miR-33的6-10B细胞的平板克隆形成率及形成克隆大小。(二)Evi1对鼻咽癌细胞周期调控蛋白的调节作用采用western blot方法,检测在沉默Evi1的HONE1细胞和沉默Evi1的同时上调miR-33的HONE1细胞以及过表达Evi1的6-10B细胞和过表达Evi1的同时抑制miR-33的6-10B细胞中,p21和MDM2的表达水平。(三)Evi1对鼻咽癌细胞凋亡的调节作用1.采用western blot方法,检测在沉默Evi1的HONE1细胞和沉默Evi1的同时上调miR-33的HONE1细胞以及过表达Evi1的6-10B细胞和过表达Evi1的同时抑制miR-33的6-10B细胞中,Bax和Survivin的表达水平。2.采用流式细胞仪凋亡检测方法,检测沉默Evi1的HONE1细胞和沉默Evi1的同时上调miR-33的HONE1细胞以及过表达Evi1的6-10B细胞和过表达Evi1的同时抑制miR-33的6-10B细胞的凋亡比例。(四)采用western blot方法,检测Evi1对由化疗药物(阿霉素)诱导的p53蛋白水平上调的拮抗作用。(五)采用裸鼠体内成瘤实验,检测沉默Evi1的HONE1细胞的体内成瘤能力。对瘤体做western blot检测,再次检验Evi1和p53的表达水平。三、Evi1的癌细胞转化作用1.用pWPI-Evi1感染小鼠成纤维细胞NIH3T3和永生化鼻咽上皮细胞NP69,稳定过表达Evi1。2.采用转化灶形成实验,检测过表达Evi1的NIH3T3细胞和NP69细胞形成转化灶的能力。3.采用软琼脂克隆实验,检测过表达Evi1的NIH3T3细胞和NP69细胞在软琼脂中形成克隆的能力。4.采用裸鼠体内成瘤实验,检测过表达Evi1的NIH3T3细胞和NP69细胞的体内成瘤能力。四、统计学方法采用统计软件SPSS 13.0对实验结果进行统计学处理和分析,计量资料以均数±标准差(x±s)表示。RT-PCR实验采用单样本t检验,荧光素酶报告实验采用单因素方差分析(One-way ANOVA),方差分析显著时,分别采用Bonferroni和Dunnett法进行多个处理组相互比较以及多个处理组和一个对照组的多重比较。EdU实验和平板克隆实验采用单因素方差分析,方差分析显著时,采用Bonferroni法进行多重比较。P<0.05被认为有统计学差异。结果:一、Evi1通过miR-33对p53进行调节(一)Evi1对p53表达的抑制作用1.采用免疫组化检测Evi1和p53在鼻咽癌组织中表达的相关性。免疫组化检测鼻咽标本显示,在50例鼻咽癌标本中,有35例呈Evi1高表达,其中29例呈p53表达阴性,6例呈p53表达阳性;15例Evi1低表达的标本中10例呈p53表达阳性,5例呈p53表达阴性。2.采用Westen blot方法检测Evi1在鼻咽癌细胞株及永生化鼻咽上皮细胞NP69中的表达水平。结果显示Evi1在鼻咽癌细胞株SUNE1,CNE1,HONE1,5-8F中呈高表达,在CNE2、6-10B细胞和永生化鼻咽上皮细胞NP69中呈低表达;p53在NP69中显著高表达,在鼻咽癌细胞5-8F中呈高表达,6-10B中呈中高表达,在CNE1,CNE2,HONE1,SUNE1 中呈中低表达。3.在HONE1中沉默Evi1和在6-10B中过表达Evi1后,Western blot结果显示,沉默Evi1使p53在HONE1细胞中表达升高;过表达Evi1则使p53在6-10B细胞中表达降低。4.免疫荧光结果显示,Evi1在HONE1中高表达,在NP69中低表达,定位于细胞核;p53在HONE1中低表达,在NP69中高表达,亦定位于细胞核。在沉默Evi1的HONE1细胞中,p53表达增强。p53在HONE1的两个处理组中均主要呈核表达。(二)Evi1对p53的调节作用1.采用Westen Blot方法,分别在HONE1中沉默Evi1和在6-10B中过表达Evi1,检测p53表达水平的变化。结果显示,在沉默Evi1的HONE1细胞中,p53表达升高;在过表达Evi1的6-10B细胞中,p53表达降低。2.采用细胞免疫荧光技术,检测在HONE1细胞中沉默Evi1后p53的表达水平和定位。结果显示,沉默Evi1后,p53在HONE1细胞中的表达水平显著升高。(三)miR-33对p53表达的抑制作用在HONE1和6-10B细胞中分别过表达和抑制miR-33后,通过western blot检测p53的表达水平。结果显示,在HONE1细胞中,过表达miR-33,p53表达略降低,抑制miR-33,p53表达升高;在6-10B细胞中过表达miR-33,p53表达降低,抑制miR-33,p53表达升高。(四)Evi1对miR-33的促进作用1.采用RT-PCR技术,分别在HONE1中沉默Evi1以及在6-10B中过表达Evi1后,检测miR-33的变化情况。结果显示,miR-33在沉默Evi1的HONE1细胞中扩增量减低(tHONE1=-43.862,PHONEI=0.001);在过表达Evi1的6-10B细胞中,扩增量升高(t6-1OB=1 72.730,P6-1OB=0.000)。2.构建两组pGL4.51-miR-33 promotor荧光素酶报告载体(pGL4.51-miR-33 promotor upstream,pGL4.51-miR-33 promotor downstream),分另与pcDNA3-Evi1表达载体共转染293T细胞,检测Evi1对miR-33 promotor的调节作用。结果显示,与pcDNA3-Evi 1共转染的两组293T细胞荧光素酶活性均比与pcDNA3共转染的对照组有不同程度升高(tup=-18.464,Pup=0.003;tdown=-7.557,Pdown=0.017)。3.构建五组pGL4.51-miR-33 promotor点突变荧光素酶报告载体,明确miR-33 promotor区的Evi1调节位点。结果显示,分别点突变可能受Evi1调节的五个miR-33 promotor位点,其中上游-2378和下游+183两处调节位点突变后,荧光素酶活性较未突变的对照组显著降低(Fup=220.621,Pup=0.000;Fdown=98.451,Pdowen=0.000)。(五)Evi1通过上调miR-33抑制p53的表达1.WestenBlot结果显示,在沉默Evi1的HONE1细胞中,p53表达升高,在沉默Evi1的同时上调miR-33的HONE1细胞中,p53表达的升高趋势被部分抑制,但较对照组仍略有升高,在过表达Evi1的6-10B细胞中,p53表达降低,在过表达Evi1的同时抑制miR-33的6-10B细胞中,p53表达的降低趋势被部分回调,但较对照组仍略有降低。2.免疫荧光结果显示,在沉默Evi1的HONE1细胞中,p53表达升高。在沉默Evi1的同时上调miR-33的HONE1细胞中,p53表达无显著升高。二、在鼻咽癌细胞中Evi1通过miR-33调节p53信号通路,进而调节细胞的增殖、周期和凋亡。本部分选取鼻咽癌细胞HONE1和6-10B作为实验对象。(一)Evi1对鼻咽癌细胞增殖的调节作用1.MTT实验结果显示,沉默Evi1的HONE1细胞生长速度较对照组显著减缓,沉默Evi1的同时上调miR-33的HONE1细胞生长速度较单独沉默Evi1组加快,但较对照组仍减缓;过表达Evi1的6-10B细胞生长速度较对照组显著加快,过表达Evi1的同时抑制miR-33的6-10B细胞生长速度较单独过表达Evi1组减缓,但较对照组仍加快。2.EdU吸收实验结果显示,沉默Evi1的HONE1细胞EdU吸收水平较对照组显著降低,沉默Evi1的同时上调miR-33的HONE1细胞EdU吸收水平较单独沉默Evi1组增高,但仍较对照组降低(F=26.558,P=0.001);过表达Evi1的6-10B细胞EdU吸收水平较对照组显著增高,过表达Evi1的同时抑制miR-33的6-10B细胞EdU吸收水平较单独过表达Evi1组降低,但仍较对照组增高(F=33.134,P=0.001)。3.平板克隆实验结果显示,沉默Evi1的HONE1细胞形成克隆速度,克隆大小均较对照组显著减低,沉默Evi1的同时上调miR-33的HONE1细胞形成克隆速度,克隆大小均较单独沉默Evi1组增高,但仍较对照组减低(F=180.399,P=0.000);过表达Evi1的6-10B细胞形成克隆速度,克隆大小较对照组显著增高,过表达Evi1的同时抑制miR-33的6-10B细胞形成克隆速度,克隆大小较单独过表达Evi1组减低,但仍较对照组增高(F=244.169,P=0.000)。(二)Evi1对鼻咽癌细胞周期调控蛋白的调节作用p21和MDM2是调节细胞周期的重要因子,Western blot结果显示,它们在两种细胞各组中的表达水平与p53基本一致。在沉默Evi1的HONE1细胞中,表达升高,在沉默Evi1的同时上调miR-33的HONE1细胞中,表达较单独沉默Evi1组降低,但仍较对照组略增加;在过表达Evi1的6-10B细胞中,表达水平降低,在过表达Evi1的同时抑制miR-33的6-10B细胞中,表达水平较单独过表达Evi1组升高,但仍较对照组略降低。(三)Evi1对鼻咽癌细胞凋亡的调节作用1.Western b1ot结果显示,Bax的表达水平在两种细胞各组中的变化趋势与p53基本一致。而Survivin的表达水平与p53相反,在沉默Evi1的HONE1细胞中,表达水平降低,在沉默Evi1的同时上调miR-33的HONE1细胞中,表达水平较单独沉默Evi1组升高,但仍较对照组略降低;在过表达Evi1的6-10B细胞中,表达水平升高,在过表达Evi1的同时抑制miR-33的6-10B细胞中,表达水平较单独过表达Evi1组降低,但仍较对照组略升高。2.流式细胞仪凋亡检测结果显示,沉默Evi1的HONE1细胞凋亡细胞比例较对照组增加,沉默Evi1的同时上调miR-33的HONE1细胞早期凋亡细胞较单独沉默Evi1的HONE1细胞组降低,较对照组略增加。过表达Evi1的6-10B细胞凋亡细胞比例较对照组减少,过表达Evi1的同时下调miR-33的6-10B细胞凋亡细胞较单独沉默Evi1的HONE1细胞组增加,较对照组略减低。(四)采用western b1ot方法,检测Evi1对由阿霉素(Doxorubicin)诱导的p53蛋白水平上调的拮抗作用。结果显示,阿霉素可诱导p53表达,并呈时间依赖性,该作用可被Evi1部分拮抗。(五)采用裸鼠体内成瘤实验,检测沉默Evi1对鼻咽癌细胞体内成瘤性的影响。结果显示,沉默Evi1的HONE1细胞于接种后第10天开始形成肿瘤,对照组于接种后第6日开始成瘤。至第四周末观察截止时,沉默Evi1的HONE1细胞所成肿瘤体积显著小于对照组。Western blot结果显示,在沉默Evi1的HONE1细胞形成的肿瘤组织中,Evi1仍较对照组降低,p53仍较对照组增高。三、Evi1的癌细胞转化作用1.采用转化灶形成实验,检测过表达Evi1的NIH3T3和NP69细胞形成转化灶的能力。在NIH3T3细胞中过表达Evi1可在三周内平均形成1-3个转化灶/孔(24孔板),对照组无转化灶形成。在NP69中过表达Evi1的及其对照组细胞在三周内均无转化灶形成。2.采用软琼脂克隆形成实验,检测过表达Evi1的NIH3T3和NP69细胞在软琼脂中形成克隆的能力。在NIH3T3细胞中过表达Evi1在三周内形成6-8个克隆/孔(12孔板),对照组形成2-3克隆/孔,两组克隆大小无显著差异。在NP69中过表达Evi1在三周内形成1-2个克隆/孔(12孔板),对照组无克隆形成。3.采用裸鼠体内成瘤实验,检测过表达Evi1的NIH3T3的体内成瘤能力。结果显示,至第八周末停止观察时,NIH3T3细胞的处理组和对照组均无肿瘤形成。结论1.Evi1通过上调miR-33抑制p53表达。2.沉默Evi1在鼻咽癌细胞中部分通过促进p53信号通路抑制细胞增殖,促进细胞凋亡。3.Evi1可部分拮抗由DNA损伤药物诱导的p53蛋白水平上调。本研究创新之处1.第一次证明Evi1通过miR-33对p53进行调节。2.第一次证明Evi1通过p53信号通路对鼻咽癌细胞增殖和凋亡进行调节。3.第一次证明Evi1可部分拮抗由DNA损伤药物诱导的p53蛋白水平上调。
佚名[6]2004年在《肿瘤流行病学与肿瘤病因学》文中研究表明肿瘤高发人群上消化道肿瘤筛查方法的应用与体会贺立绩黄瑞德山西省阳城县肿瘤防治办公室,山西阳城,048100 摘要目的:肿瘤筛查是癌症“三早”的唯一途径,应用胃液隐血技术隐血珠+胃镜+活检的筛查方法在肿瘤高发人群中对30岁以上的居民进行了三级筛查,以期降低人群晚期肿瘤发生率及死亡率,提高患者生存率。方法:1、全县30岁以上人群均为筛查对象;2、《防癌自查隐血试剂盒》即隐血珠为筛查药具;3、筛查方法采用一级隐血珠初筛,二级电子胃镜检查,三级病理确诊的.“三级法”。结果:1、隐血珠人群筛查,
曲亚明[7]2010年在《锰型过氧化物酶与鼻咽癌放射敏感关系研究》文中指出背景鼻咽癌流行于中国南方。低分化型是鼻咽癌最常见的病理组织型,对放射治疗敏感。常规放射治疗是鼻咽癌最常用和最有效的治疗。但是鼻咽癌五年生存率仅为50%左右,而失败主要原因是鼻咽癌组织对放射线的抵抗。增加照射剂量,因会引起周围组织的损害而受到限制。因此,提高疗效只能从增加肿瘤而不增加周围组织的辐射量,或者提高肿瘤组织相对于周围组织的放射敏感性入手。前者涉及改善放疗物理因素。后者涉及探索影响肿瘤与正常组织不同放疗差别的生物因素。步入分子医学时代,诸如免疫疗法和RNA干扰等靶向目标分子治疗等走向应用。对于鼻咽癌治疗,发现和应用有潜力的放射敏感相关生物分子更有意义。受离子辐射的细胞会产生自由基,起辐射诱导细胞毒作用。而锰型过氧化物酶(SOD2)则能歧化超氧阴离子自由基,降低哺乳动物细胞对放射的敏感性。研究目的实验探索锰型过氧化物酶对鼻咽癌放射抵抗性的影响及其作用机制。研究方法①应用集落形成实验检测鼻咽癌细胞株CNE1和CNE2放射前和不同剂量放射后的存活分数,应用多靶单击模型和线性二次模型拟合放射存活曲线,测算放射生物学参数D0,Dq,α,β和SF2,比较两细胞株的放射敏感性。②应用水溶四氮唑盐微孔板实验测定细胞株CNE1与CNE2的总SOD和SOD2活性,测评SOD活性和SOD2活性与鼻咽癌细胞株放疗敏感或抵抗的关系。③应用Western blot检测照射前和不同时间及不同剂量照射后细胞株CNE1和CNE2的SOD2蛋白表达,测评SOD2蛋白表达与鼻咽癌细胞株放疗敏感或抵抗的关系和随辐射剂量时间的变化。⑤使用Gateway(?)-adapted expression vector构建表达miRNA对SOD2基因RNA干扰的质粒。⑥采用脂质体转染法将构建的针对SOD2基因的miRNA干扰的质粒转染CNE1细胞,cck-8实验和FCM检测转染质粒对细胞增殖和细胞周期的影响。Western blot和RT-PCR检测瞬转细胞的SOD2的蛋白和mRNA表达变化。⑦应用杀稻瘟素(Blasticidin)筛选转染细胞,建立针对SOD2基因表达miRNA干扰的CNE1细胞株,检测稳转细胞的SOD2的蛋白和mRNA表达情况。⑧集落形成实验等测算和比较稳转SOD2基因沉默细胞的放射生物学参数,直接测评SOD2对鼻咽癌细胞放射抵抗的影响。⑨x-线2Gy和4Gy辐射接受miRNA沉默SOD2基因治疗的CNE1细胞实验,测算细胞生存率,测评基因治疗对鼻咽癌细胞放射增敏作用。结果①鼻咽癌细胞株放射生物学参数在CNE1和CNE2两细胞株放射生存曲线上,每一放射剂量点CNE1的细胞存活分数都高于CNE2。在放射敏感参数D0、Dq、SF2、α和MID CNE1与CNE2相比的分别为：高出50.97%、高出2.31倍、高出1.67倍、少3.35倍,P<0.05。②鼻咽癌细胞CNE1与CNE2的SOD活性和SOD2活性在总SOD活性和SOD2活性水平细胞株CNE1比CNE2分别高出：63.69%和49.36%,P<0.05。③鼻咽癌细胞CNE1与CNE2的SOD2蛋白表达细胞株CNE1的SOD2蛋白表达量是CNE2的量的1.94倍,P<0.05。受辐射,CNE1细胞的SOD2蛋白量增加(P<0.05),但是不随时间和剂量变化(P>0.05); CNE2细胞的SOD2蛋白量变化不明显(P>0.05)。④构建靶向SOD2的miRNA载体质粒与转染CNE1细胞经过质粒DNA测序,质粒pcDNATM6.2-GW/EmGFP-imR-SOD2(411、424和700)构建成功。质粒转染鼻咽癌细胞CNE1,经检测EmGFP编码绿色荧光蛋白,转染成功。转染的细胞imR-SOD2411、imR-SOD2424、imR-SOD2700与未转染的细胞相比,SOD2的mRNA分别下调37%、52.19%、45.12%,P<0.05; SOD2蛋白分别下调13.43%、51.76%、41.36%,P<0.05。转染质粒pcDNATM6.2-GW/EmGFP-imR-SOD2424抑制细胞增殖生长25.87%,质粒pcDNATM6.2-GW/EmGFP-imR-SOD2700和阴性质粒抑制16.88%和17.15%。转染质粒对细胞周期影响不明显(P>0.05)。⑤建立沉默SOD2的稳定转染细胞株经抗生素筛选获得稳定转染质粒pcDNATM6.2-GW/EmGFP-imR-SOD2700的CNE1细胞克隆。稳转imR-SOD2700的CNE1细胞与未转染的CNE1细胞相比,SOD2的mRNA分别下调72.18%,P<0.01; SOD2蛋白分别下调69.95%,P<0.05。⑥沉默SOD2基因表达细胞放射生物学参数与基因治疗实验在放射生存曲线上,稳转质粒pcDNATM6.2-GW/EmGFP-imR-SOD2700的CNE1细胞与无转染的CNE1细胞相比每一放射剂量的生存分数减小,在放射生物参数SF2、D0、α前者比后者分别降低12.81倍、降低2.43、升高2.68倍,P<0.05。⑦通过沉默SOD2基因-放射增敏治疗实验接受基因治疗敲除SOD2基因的CNE1细胞与未受干扰的CNE1细胞照射2Gy和4Gy的x-线细胞的生存率,基因治疗的CNE1细胞比未受治疗的CNE1细胞分别降低2.53倍和3.72倍。结论鼻咽癌细胞株CNE1相比CNE2的放射抵抗性高。SOD和SOD2活性与鼻咽癌细胞株的放射抵抗有关,活性高的细胞的放射抵抗性大。SOD2蛋白表达与鼻咽癌细胞株的放射抵抗有关,蛋白表达高的细胞的放射抵抗性大。构建靶向SOD2的质粒,能够表达miRNA,下调SOD2基因表达,其中针对SOD2基因位点700至721的niRNA最有效。miRNA沉默SOD2的稳转细胞,SOD2基因mRNA和蛋白显著下调,放射抵抗变弱。总之,miRNA干扰沉默SOD2基因疗法可以应用于放疗抵抗的鼻咽癌,能使癌症放疗的放射敏感性增高。
钟晓鸣[8]2005年在《鼻咽癌中自发凋亡及相关基因表达与放射敏感性的实验研究》文中研究说明目的:探讨鼻咽癌组织中细胞自发凋亡及凋亡基因P53、bcl-2的表达在预测放射敏感性中的意义。方法:对38例初治、无远处转移、放疗前鼻咽癌患者活检标本分别采用TUNEL法检测细胞自发凋亡,免疫组化技术检测P53和bcl-2基因的表达情况;临床观测患者放疗过程中鼻咽部肿瘤的消退情况。结果:①突变型P53和bcl-2基因的表达:P53基因表达阴性(—)、弱阳性(十)、中阳性(十十)、强阳性(十十十)4组的病例数分别为17、14、7、0例,阳性表达者占55%;bcl-2基因表达—、十、十十、十十十的4组病例数分别为15、13、8、2例,其中阳性者占60.5%;P53和bcl-2基因在鼻咽癌中的表达呈正相关(Rs=0.426,p<0.05)。②自发凋亡率与突变型P53和bcl-2基因表达:P53基因不同表达—、十、十十的3组平均凋亡率分别为0.755%、0.566%和0.196%,鼻咽癌组织中突变型P53基因阳性表达水平与细胞自发凋亡率呈负相关(Rs =-0. 658,p<0.05); bcl-2基因表达—、十、十十、十十十的4组平均凋亡率分别为0.788%、0.61%、0.30%及0.11%,鼻咽癌组织中bcl-2基因表达水平与细胞自发凋亡率呈负相关(Rs =-0.756,p<0.05);将P53与bcl-2基因表达分为二者皆阴性组、二者皆阳性组及其中之一为阳性组,则它们的凋亡指数分别为0.858%、0.365%和0.659%,三组之间统计学上显示有显著性差异(p<0.01)。③突变型P53和bcl-2基因表达及自发凋亡率与鼻咽瘤体消退率:突变型P53基因阳性表达水平与鼻咽癌瘤体的消退率呈负相关(放疗40Gy时,Rs =-0.564;放疗70Gy时,Rs =-0.526;P<0.05);bcl-2基因阳性表达水平与鼻咽癌瘤体的
王志远[9]2007年在《多药耐药（MDR1）基因多态性与鼻咽癌放射敏感性的相关性研究》文中进行了进一步梳理1．背景与目的鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma，NPC)是东南亚及中国南方各省常见的一种恶性肿瘤，发病率15～50／10万，其发病极具地域性和人群特色，中国广东省的发病率居世界首位，死亡率平均约为十万分之七，严重危害着人民的生命健康。放射治疗是鼻咽癌的首要治疗手段，放疗后5年生存率达60％左右。但仍有8～13％的病例放疗后局部残留，20～30％的病例局部复发；其中照射野内残留或复发约占50％，提示部分鼻咽癌放射抗拒。人们对肿瘤放射抵抗的机制尚缺乏全面和深入的认识。肿瘤微环境的炎症、血供不足以及乏氧细胞、DNA损伤修复能力增强和某些癌相关基因等因素被认为和放射抵抗有关。同放射抵抗相比，人们目前对肿瘤多药抗性(multidrug resistance，MDR)的发生机制已有较深刻的认识，其中多药耐药基因(MDR1)基因扩增及其编码产物P糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)的过度表达是目前已发现的最重要的一种多药耐药机制，大多数肿瘤MDR的发生被认为与P-gp有关。P-gp是由MDR1基因编码、由1280个氨基酸残基组成、分子量为170KD的跨膜蛋白，具有能量依赖性的外流泵功能，在ATP供能的条件下，将细胞内化疗药物或毒素等物质逆着浓度差转运到细胞外，从而减少多种不同化学结构和作用机制的药物或毒素在细胞内的蓄积，结果细胞对细胞毒药物的敏感性降低，产生细胞的耐药性。肿瘤细胞一旦产生耐药性，就不单是仅针对某一细胞毒药物，对其他细胞毒药物也同时产生了耐药性，表现为肿瘤的多药抗性。现已证实人MDR1基因位于第7号染色体7q21，含28个外显子，cDNA全长为4.5Kb，仅有一个开放阅读框。在不同的细胞系中MDR1启动子显示的活性不同，其增强子的活性亦不同，因此MDR1表达具有异质性和组织特异性。P-gp可能具有潜在的多重生理效应，直接或间接地参与细胞的分子代谢、增殖、分化、凋亡等方面的调控。P-gp不仅引起肿瘤耐药，还可延迟凋亡级联反应，保护耐药细胞免于细胞毒性药物诱导的多种形式的caspase依赖性凋亡；P-gp通过稳定肿瘤细胞线粒体膜电位和线粒体膜通透性，抑制X射线的凋亡效应，从而递呈放射抵抗表型，阻断P-gp表达可有效逆转放射抵抗。基因的多态性可能对基因的表达或功能产生重要影响。迄今已报道MDR1基因在27个位点上有28个单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)，其中研究较多的21外显子G2677T(Ala893Ser)和26外显子C3435T(Ile1145Ile)及其单体型，与P-gp的功能和表达密切相关。MDR1基因的多态性可能与鼻咽癌的放射敏感性相关以影响放疗对鼻咽癌局部控制的疗效。本研究旨在通过调查MDR1基因的单核苷酸多态性在鼻咽癌放射敏感和放射抵抗患者中的分布以及上述多态性对MDR1 mRNA在分具不同放射敏感性的三株细胞系内的差异表达的影响，探讨MDR1基因多态性与鼻咽癌放射敏感性的相关性。2．方法采用病例—对照的研究方法。(1)以小样本为研究对象，选取鼻咽癌放射抵抗和放射敏感各5个病例，针对NCBI Genebank中MDR1所有外显子和启动子核心调控区域设计引物进行PCR扩增，产物在ABI 3730测序仪上测序，序列读解采用Chromas软件，并结合NCBI SNP数据库和文献资料寻找和验证SNP位点，筛选出合适的SNP用于下一步实验。(2)以18例鼻咽癌放射抵抗病例及30例鼻咽癌放射敏感病例为研究对象，针对已筛选出的SNP进行批量PCR扩增及测序分型，序列结果采用Chromas软件读解；针对所筛选的SNP位点在放射抵抗组和放射敏感组基因型或等位基因分布差异做χ~2检验，计算其P值和OR值；将每个SNP位点的基因型分布数据分别做Hardy-Weiberg equilibrium检验，使用基于贝叶斯算法的PHASE软件构建单体型，并对所构建单体型在两组中的分布差异做χ~2检验，计算其P值和OR值；上述统计学处理均使用SPSS13.0统计软件完成，双侧检验，显著性标准为P＜0.05。(3)利用同样的方法对CNE1、CNE2、HNE1、HONE1、5-8F、6-10B六株鼻咽癌细胞系做MDR1基因测序，根据其在所筛选SNP位点基因型分布，并结合上述细胞系的放射生物学行为特点，选择CNE1、HNE1、5-8F，利用实时荧光定量PCR(realtime fluorescent quantitiative PCR)测定MDR1 mRNA在上述三株细胞系的表达情况，分析其表达差异。3．结果3．1 MDR1基因第21号外显子G2677T基因型在抵抗组与敏感组的分布均表现出显著性差异(P=0.009)：以GG基因型为参照，暴露于T等位基因型(GT+TT基因型)的OR值为5.333(95％CI∶1.033～27.534，P=0.033)，GT、TT基因型各自的OR值为3.375(P=0.283)和21.000(P∶0.009)；以GG+GT基因型为参照，TT基因型的OR值为8.909(95％CI∶1.596～49.717，P=0.017)。可见随等位基因T的出现鼻咽癌发生放射抗拒的风险将增加，尤其是TT纯合子基因型出现时，这种风险将显著增加；趋势检验：χ~2=8.784，P=0.003。以G等位基因为参照，暴露于T等位基因的OR值为3.538(95％CI∶1.488～8.416，P=0.004)。3．2 MDR1基因第26号外显子C3435T基因型和等位基因在抵抗组与敏感组的分布差异均具有统计学意义(P≤0.017)：以CC基因型为参照，暴露于T等位基因型(CT+TT基因型)的OR值为4.632(95％CI∶0.892～24.042，P=0.111)，CT、TT基因型各自的OR值为3.361(P=0.271)和27.500(P=0.010)。以CC+CT基因型为参照，TT基因型的OR值为11.154(95％CI∶1.182～105.243，P=0.022)。可见随等位基因T的出现鼻咽癌发生放射抗拒的风险将增加；尤其是TT纯合子基因型出现时，这种风险将显著增加。趋势检验：χ~2=7.352，P=0.007。以C等位基因为参照，暴露于T等位基因的OR值为2.800(95％CI∶1.194～6.569，P=0.017)。3．3 MDR1基因第12号外显子C123 6T基因型和等位基因在抵抗组与敏感组的分布差异均不具有统计学意义(P≥0.100)，尽管抵抗组T等位基因或TT基因型出现频率高于敏感组，而C等位基因或CC基因型频率低于敏感组。3．4 MDR1基因T-129C(exon 1b)、C1149T(exon 11)基因型和等位基因在抵抗组与敏感组的分布均无显著性差异(P≥0.1 36)，尽管杂合子仅在抵抗组出现。G1400A基因型和等位基因在抵抗组与敏感组的分布亦无显著性差异(P≥0.142)。3．5上述所筛选的MDR1基因SNP在两组的基因型分布均符合Hardy-Weiberg equilibrium(P≥0.188)。基于上述基因型分布，构建三个block：C1236T-G2677T、G2677T-C3435T和C1236T-G2677T-C3435T。分别比较上述block在两组的分布发现：C1236T-G2677T单体型在两组的分布无显著性差异(P=0.056)，但携带有1236T-2677T单体型的病人发生放射抗拒的可能性显著高于其它单体型(P=0.033)；G2677T-C3435T单体型在两组的分布有显著性差异(P=0.029)，携带有2677T-3435T单体型的病人发生放射抗拒的可能性显著高于其它单体型(P=0.013)；C1236T-G2677T-C3435T单体型在两组的分布无显著性差异(P=0.128)。3.6鼻咽癌细胞系CNE1、HNE1、5-8F分别具有不同的放射敏感性，HNE1和5-8F放射敏感性高于CNE1；经DNA测序发现它们在MDR1 C1236T、G2677T、C3435T三个SNP位点的基因型也有差异，CNE1的基因型分别为：C1236T为CT型，G2677T为GT型，C3435T为CT型；HNE1的基因型为：在C1236T为CT型，G2677T为GT型，C3435T为CC型；5-8F的基因型为：C1236T为CT型，G2677T为GG型，C3435T为CC型。抽提上述三株细胞系的总RNA，并做realtime RT-PCR，测定MDR1 mRNA在这三株细胞系中的表达水平并分析：MDR1 mRNA在CNE1细胞系的表达量分别是其在HNE1和5-8F细胞系表达量的2.34和2.42倍。这一结果提示上述三株细胞系的放射敏感性差异可能与MDR1 mRNA在它们中的表达差异相关，而它们MDR1的基因多态性可能影响mRNA的表达；MDR1上述SNP位点的突变等位基因可能提示MDR1 mRNA表达上调而使鼻咽癌细胞发生放射抗拒的风险增加。4．结论G2677T、C3435T等MDR1基因单核苷酸多态性与鼻咽癌放射敏感性显著相关(P≤0.017)，2677TT、3435TT、1236T-2677T、2677T-3435T基因型或单体型携带者鼻咽癌发生放射抗拒的风险显著增加(P≤0.033)；鼻咽癌细胞系MDR1 mRNA表达与细胞系放射敏感性相关，鼻咽癌细胞系G2677T、C3435T等基因多态性可能影响其MDR1 mRNA的表达。总之，MDR1基因多态性可作为遗传学标志预测鼻咽癌细胞放射敏感性的差异，MDR1基因型多态性可能影响其mRNA在细胞系内的表达。上述结论还需继续扩大标本加以验证，阐明上述基因多态性的生物学意义以期进一步明确MDR1基因多态性对鼻咽癌放射抵抗表型递呈的作用机制。
马敬[10]2007年在《2450MHz微波辐照对人鼻咽癌细胞增殖活性的影响及其机理研究》文中进行了进一步梳理微波是一种频率范围在300 MHz～300 GHz之间的非电离辐射，广泛应用于雷达、航空、通讯、工业及医学等领域。近年来，随着频率为2450 MHz家用微波炉的应用，及频率范围为800～1800 MHz移动电话的普及，人们暴露于微波辐射的机会明显增加，公众已经开始关注暴露于微波辐射可能产生的生物效应及其对健康的影响。微波的生物学效应主要有两种：热效应和非热效应，非热效应和热效应的产生与微波的频率、功率密度、脉冲调制有关。文献报道较多的是关于比吸收率(specific absorption rate，SAR)较高时微波辐射产生的热效应，而对非热效应报道相对较少。本实验利用不同强度的2450MHz微波辐照人鼻咽癌细胞一定时间后，探讨微波对人鼻咽癌细胞的形态结构、细胞增殖及凋亡的影响，以期认识微波致鼻咽癌细胞凋亡的分子机制并对临床治疗提供一定的理论依据。研究内容与结果：1．微波辐照对人鼻咽癌细胞增殖的影响观察不同功率密度微波辐照对人鼻咽癌细胞存活率和细胞增殖周期的影响。随着微波辐照功率密度的增加，人鼻咽癌细胞存活率逐渐降低，10mW／cm~2组存活率与对照组相比略有下降，两者之间无显著差异性；20mW／cm~2与30mW／cm~2组存活率分别为76.75％、65.07％，两组与对照组均存在差异(P＜0.01)；两组与10mW／cm~2组相比也均存在差异(P＜0.01)；微波辐照可致人鼻咽癌细胞存活率降低。随着微波剂量的增加，细胞周期中G_1期细胞明显增加，S期和G_2期细胞数量逐渐减少，20mW／cm~2组和30mW／cm~2组均出现了亚G_1峰，两组凋亡细胞的数量有随微波强度增加而增加的趋势，S期细胞数量减少说明细胞能进入DNA合成的S期降低。2．微波辐照后细胞形态结构的改变及凋亡检测微波辐照后光镜下即刻观察细胞，3组均未见明显的形态学改变，继续培养24h，10mW／cm~2组可见细胞边缘模糊，少部分细胞脱壁。20mW／cm~2组大部分脱壁，少部分细胞结构不清，并可见部分细胞碎片。30mW／cm~2组大部分脱壁，细胞结构模糊，细胞碎片明显增多。电镜观察10mW／cm~2组以可逆性损伤为主，内质网部分扩张，细胞内空泡形成，并有髓鞘样结构形成，线粒体肿胀，但核膜清晰；20mW／cm~2组少数细胞出现空泡样变，细胞大部分表现为早期凋亡改变，染色质浓集、边聚；30mW／cm~2组细胞可见到大部分细胞凋亡和少数细胞变性，典型的凋亡细胞，染色质浓集并凝聚于核膜周围，呈弯月状，胞体缩小，细胞器结构完整。TUNEL法观察微波辐照后人鼻咽癌细胞的凋亡改变。凋亡过程中的细胞，其染色质DNA发生链断裂。根据此原理采用末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记方法(TdT-mediated dUTP nick end labeling method，TUNEL法)检测人鼻咽癌细胞DNA双链的损伤阳性细胞数明显增加。3．微波辐照对人鼻咽癌细胞MDA含量和SOD活性影响10mW／cm~2组辐照后，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性下降，丙二醛(Malondialdehyde，MDA)含量稍有上升，与对照组无显著性差异(P＞0.05)；20mW／cm~2组和30mW／cm~2组辐照后，SOD活性下降明显，MDA含量明显上升，两组分别与对照组相比有显著性差异(P＜0.05)，而且随着微波强度的增大，SOD活性呈下降趋势，MDA含量呈上升趋势。结论：1．微波辐照能抑制人鼻咽癌细胞的增殖，阻抑细胞周期。2．微波辐照能影响人鼻咽癌细胞的形态结构，促进凋亡小体的形成，促进细胞凋亡。3．微波辐照可致人鼻咽癌细胞MDA含量明显增高，SOD活性降低。
参考文献：
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[10]. 2450MHz微波辐照对人鼻咽癌细胞增殖活性的影响及其机理研究[D]. 马敬. 兰州大学. 2007
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