张强[1]2001年在《组织移植和神经营养因子对损伤脊髓的修复作用及机理研究》文中进行了进一步梳理脊髓损伤后常常导致感觉和运动功能丧失，不仅严重影响病人的生活质量，而且还给社会和家庭带来沉重的经济负担。脊髓损伤研究的目的是改善急、慢性脊髓损伤后病人的功能，但目前尚缺乏有效的治疗方法。脊髓损伤的治疗迄今为止一直没有突破性进展，问题的焦点主要在以下几个方面（1）如何保护和挽救脊髓损伤后神经元免于死亡，（2）如何促进神经元轴突的再生和修复，（3）如何重建脊髓的解剖连接和实现功能康复。据报道许多组织和细胞移植到损伤的脊髓，都能促进动物功能恢复；目前的实验研究表明，胚胎脊髓组织移植对恢复损伤大鼠脊髓的功能和解剖连接作用最好，其可能的作用机理有：（1）移植物能作为一个细胞桥的作用填充损伤区，提供化学或机械的诱导；引导损伤神经细胞再生通过损伤区。（2）桥接脊髓损伤，提供细胞成分，修复损伤的环路。（3）提供各种神经营养因子挽救神经细胞，调节神经环路改善功能。但是胚胎脊髓移植的存活率低，在临床应用的实践中发现单纯一种组织移植治疗脊髓损伤，不能有效地促进神经元轴突的再生和运动功能恢复，因此往往不能产生满意的治疗效果。如何设计和应用组织移植，联合应用组织移植能否产生更好的治疗效果，需要进一步实验证明。 鉴于以上原因，我们设计并提出了不同组织移植和神经营养因子治疗大鼠脊髓损伤，这些方法包括：不同组织移植（胚胎脊髓移植+损伤处应用带蒂的大网膜组织移植提供血运、胚胎脊髓移植+损伤处应用带蒂的椎旁肌组织移植提供血运、胚胎脊髓移植+损伤区上下神经根吻合提供周围神经桥接）。提供神经营养因子的胚胎脊髓移植（胚胎脊髓移植+损伤处应用神经营养因子）；胚胎脊髓移植+脊髓内移植腺病毒介导的BDNF体外转基因成肌细胞。通过病理学、行为学、神经电生理、免疫细胞化学、原位分子杂交、【’切MK七0放射性配基分析法和【勺］MK术 放射自显影、细胞凋亡等技术手段，观察上述治疗方法对成鼠损伤脊髓的再生和修复作用，从 NTFS、NMDA受体和凋亡角度，初步探索不同组织移植后对损伤脊髓再生修复的作用机理。得出以下结论： 1．胚胎脊髓和大网膜联合移植后，可以与宿主脊髓形成血管联系，明显增加移植区血管数量，促进胚胎脊髓神经元存活和发育成熟。带蒂的椎旁肌和胚胎脊髓移植后，随着时间的延长，可能是由于缺少血运，肌肉组织萎缩变性，血管挛缩，对宿主脊髓修复无益。应用胚胎脊髓移植和损伤区上下神经根吻合的方法，4周以后能对损伤的脊髓起到一个桥接的作用，有利于损伤脊髓的修复，表明我们首创制备的组织移植模型，为临床治疗脊髓损伤提供了一种新的思路。 2，根据Tail”评分和MOlt斜板实验，MEP、SEP潜峰时的检查，证实组织移植各组都好于单纯脊髓损伤组，胚胎脊髓移植＋带蒂大网膜组功能恢复最好，其次是胚胎脊髓移植＋损伤平面上下神经根吻合组，单纯胚胎脊髓移植组，胚胎脊髓移植＋带蒂椎旁肌移植组功能恢复较差。不仅证明了胚胎脊髓移植的效果，而且也给国际上争论己久的大网膜移植的生物学效应提供了重要的实验依据。 3．提供血运的胚胎脊髓移植能明显增加损伤部位血流量，大网膜并胚胎脊髓移植组血流量增加最多，单纯胚胎脊髓移植组次之，椎旁肌并胚胎脊髓移植组血流量增加较少。从而为临床应用组织移植方法和实验研究者的选择提供了证据。 4．胚胎脊髓移植后，损伤脊髓可以持续高表达BDWh、NTI、GDM和 N肝免疫细胞化学反应。BD地、NT上、CNTF和 NGF与胚胎脊髓移植联合应用可以减少损伤脊髓神经元萎缩，挽救濒死的神经元，其中BDNF、NT习与胚胎脊髓移植联合应用效果更好。首次观察到胚胎脊髓移植后可使CNTFllllLrvA信号和CNTF免疫细胞化学反应增强。表明胚胎脊髓移植可能通过上调NTFS促进损伤脊髓的修复和功能重建。 Vlll 5．应用胚胎脊髓移植与单纯大鼠脊髓损伤比较发现：胚胎脊髓移植后，损伤脊髓组织可以持续高表达 GAPAP－43 InRNA、GW一3 m伽A和GFAP、cJun免疫细胞化学反应并下调 SOM mRNA。证明了胚胎脊髓移植后上述脊髓再生相关因子参与了损伤脊髓的修复、重建过程。 6．不同的组织移植后，应用［‘H］皿七 放射性配基分析和I＊AO4七of放射自显影检测，首次发现带蒂的大网膜和胚胎脊髓移植组NMDA受体水平恢复较快，能阻断NMD A受体和兴奋性毒性介导的继发性损伤，二者在防止神经元继发性损伤的保护方面可能存在协同作用。 7．应用 TUNEL荧光标记染色和 BCI上免疫细胞化学反应和电镜检查发现：胚胎脊髓和腺病毒介导的AXCAED地基因转染的成肌细胞移植后能够明显减少损伤脊髓神经细胞的凋亡，显着增加 BCI上免疫细胞化学反应。表明外源性的BDW基因转移对脊髓神经元有保护作用，其作用机制与BDN’F的抗细胞凋亡机制密切相关。
赵凡[2]2006年在《完整胚胎脊髓移植联合BDNF对大鼠完全脊髓横断损伤修复作用的研究》文中指出利用胚胎脊髓移植治疗脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)的实验研究已进行多年,目前在国内选用的实验动物模型多为脊髓不全离断或脊髓挫伤,不能完全排除受损脊髓功能自行恢复。本实验设计改良大鼠脊髓完全横断模型,确保脊髓横断完全,对研究脊髓损伤后轴突再生具有重要价值。胚胎脊髓移植多选用节段性组织块植入和混合细胞悬液注入法,很大程度地破坏了移植物本身的解剖结构和生长环境。选用完整的胚胎脊髓移植,可最大程度的克服以上缺陷。脑源性神经营养因子(BDNF)对损伤脊髓的修复、重建和挽救濒死神经元的作用明显优于其它神经营养因子,所以我们在胚胎脊髓移植的同时联合应用BDNF研究两者共同作用下的脊髓损伤修复机制。在蛋白质水平上研究脊髓损伤修复的机理十分重要,我们分别利用原位杂交技术及免疫细胞化学SP染色法观察完整胚胎脊髓移植后神经生长相关蛋白-43 (growth associated protein,GAP-43)与即刻早期基因c-Jun的表达,为进一步研究脊髓损伤的治疗策略奠定了基础。
冷向阳[3]2007年在《鹿茸多肽对脊髓损伤大鼠的保护作用及其机制研究》文中指出脊髓损伤(spinal cord injury, SCI)是外科常见的创伤,其治疗是现代医学界尚未解决的重大课题之一。虽然治疗方法很多,但尚无明显有效的治疗手段。因此,本研究在应用自制的脊髓损伤模型打击装置——打击架制备大鼠脊髓损伤模型基础上,应用鹿茸多肽对其进行治疗,以观察鹿茸多肽对脊髓损伤的疗效,并通过其对神经元细胞诱导凋亡的影响而阐明其作用机理。结果显示:结果示:1、应用自制脊髓损伤模型打击装置——打击架成功制备大鼠脊髓损伤模型。2、首次证实鹿茸多肽对脊髓损伤大鼠具有保护作用。3、体内实验表明鹿茸多肽可以通过抑制Nogo的表达、调控凋亡基因的表达,促进损伤脊髓的修复。4、在细胞水平,流式细胞术、RT-PCR、Western blot证实鹿茸多肽可调控凋亡基因的表达,使Bcl-2表达上调,caspase-3、Bax表达下调,进一步证实鹿茸多肽促进损伤脊髓修复的机制。5、本研究既丰富鹿茸多肽的药理作用及临床应用范围,也为鹿茸多肽应用于临床提供数据和理论依据。
李云[4]2010年在《NSC和OEC联合移植对SCT大鼠大脑皮质运动区神经元的作用及相关机制研究》文中指出【目的】探讨NSC和OEC联合移植对脊髓全横断损伤大鼠的运动功能及大脑皮质运动区神经元的保护作用,并探讨其作用机制。【方法】采用细胞培养、免疫组织化学、TUNEL法、蛋白质印迹法和逆转录聚合酶链式反应等技术,结合动物行为学观察(BBB评分及运动诱发电位检测),研究全横断脊髓损伤及NSC和OEC联合移植后,损伤大鼠运动功能的变化、大脑皮质运动区神经元的存活与凋亡、相关凋亡基因表达变化及其信号转导分子的调节。【结果】1.T_9全横断脊髓损伤后,大鼠后肢运动功能完全丧失,随时间延长,有一定的(甚至无)自发性恢复,但此种自发性恢复能力非常有限。在脊髓全横断损伤后的1～4周的各个时间点,手术组大鼠BBB评分明显低于假手术组(P＜0.001)。术后4周,手术组80%的大鼠未检测到MEP,20%的大鼠检测到波幅极低的MEP波形;假手术组MEP检出率为100%,波幅、潜伏期正常。细胞凋亡TUNEL检测显示:术后2周,手术组大脑皮质V层TUNEL阳性细胞数较假手术组增多(P＜0.05)。免疫组化结果表明:术后4周,手术组大脑皮质V层NeuN阳性细胞数较假手术组减少(P＜0.05);同时,手术组Bax和Caspase-3的阳性细胞数较假手术组明显增多(P＜0.05),而Bcl-2两组相比无统计学差异(P＞0.05)。RT-PCR结果显示:大脑皮质运动区Bax的表达在手术组各时间点与假手术组比较均无差异(P＞0.05);而Bcl-2的表达术后14天和28天较假手术组明显减少(P＜0.05);Caspase-3则在术后3天较假手术组表达高(P＜0.05),其他时间点接近假手术组水平。2.从细胞移植术后第3周末开始,NSC和OEC联合移植组大鼠后肢运动功能的恢复明显优于单纯全横断组(P＜0.05);叁个细胞移植组大鼠的BBB评分在整个恢复过程中均有明显的提高,其中NSC和OEC联合移植组的BBB分值在第3周末高于NSC移植组和OEC移植组,在第4周末高于NSC移植组(P＜0.05);NSC移植组和OEC移植组的BBB评分在移植术后第4周末高于单纯全横断组(P＜0.05)。细胞移植术后4周,各细胞移植组均有不同程度的MEP波幅,但均明显低于假手术组(P＜0.01);NSC和OEC联合移植组的所有受试动物均检测到MEP波形,检出率达100%,NSC和OEC单独移植组MEP检出率均为50%。细胞移植后2周,假手术组和各细胞移植组大鼠大脑皮质V层TUNEL阳性染色细胞较单纯全横断手术组少(P＜0.05);联合移植组较OEC移植组细胞凋亡数少(P＜0.05)。细胞移植术后4周,免疫组化结果显示:尽管全横断损伤组、NSC和OEC单独移植组的NeuN阳性细胞数较假手术组明显减少(P＜0.05),而NSC和OEC联合移植组与假手术组相比却无明显差异(P＞0.05),说明细胞联合移植可减轻皮质运动神经元的凋亡。结果还发现:联合移植组大脑皮质V层抗凋亡因子Bcl-2阳性细胞数较各对照组多(P＜0.05);而联合或单细胞移植组促凋亡基因Bax阳性细胞数均较手术组减少(P＜0.05);Caspase-3阳性细胞数仅联合移植组和OEC移植组较手术组减少,且联合移植组较两种细胞单一移植组减少明显(P＜0.05)。RT-PCR检测发现:NSC和OEC联合移植后3天,Bax mRNA的表达较NSC移植组增多,但较OEC移植组降低(P＜0.05);而在联合移植后14天和21天,Bcl-2的表达较OEC移植组增高(P＜0.05);Caspase-3的表达在移植后3天和7天较手术组表达降低(P＜0.05),移植后14天,较NSC移植组表达降低(P＜0.05)。3.信号通路分子RT-PCR检测显示:细胞移植术后3天,联合移植组、OEC移植组和手术组大脑皮质运动区PKB mRNA的表达均明显高于NSC移植组(P＜0.05),手术组还较假手术组表达高(P＜0.05);而术后14天,NSC移植组PKB mRNA的表达明显回升且显着高于OEC移植组(P＜0.05);移植术后21天,NSC和OEC联合移植组PKB mRNA的表达较NSC移植组和OEC移植组高(P＜0.05),其中,OEC移植组还低于手术组和假手术组(P＜0.05)。术后7天和28天,各组比较无差异(P＞0.05)。比较之,单独和联合移植术后ERK1mRNA的表达在各时间点均较假手术组和手术组明显减低(P＜0.01);且术后3天,NSC移植组高于OEC移植组和联合移植组(P＜0.01)。Stat-3 mRNA的表达则表现为细胞移植术后3天,联合移植组和OEC移植组较假手术组及手术组表达高(P＜0.05);移植术后14天手术组较假手术组降低(P＜0.05),而各细胞移植组均较手术组明显升高(P＜0.05);在细胞移植术后21天,各细胞移植组Stat-3的表达均较假手术组降低(P＜0.05);而在移植术后28天,NSC移植组Star-3较假手术组和联合移植组表达增高(P＜0.05)。进而,Western-blot检测结果发现:移植术后14天,联合移植组Akt非磷酸化蛋白、ERK1/2磷酸化蛋白的表达均比手术组和假手术组高,且Akt非磷酸化蛋白在NSC移植组比手术组表达高(P＜0.05)。联合移植组非磷酸化Stat-3的表达较假手术组、手术组、NSC移植组表达高(P＜0.05);Akt磷酸化蛋白、Stat-3磷酸化蛋白和ERK1/2非磷酸化蛋白的表达各组间比较均无差异(P＞0.05)。4.体外共培养显示:NSC和OEC共培养7天,联合培养组NeuN阳性细胞数较NSC单独培养组多(P＜0.05),而未分化的Nestin阳性细胞较单独培养组低(P＜0.05);GFAP和APC阳性细胞分化率两组比较无差异(P＞0.05)。提示OEC可能促进NSC向神经细胞分化。【结论】1.脊髓全横断损伤后可能有部分自主运动功能恢复,但非常有限,需要寻找有效的治疗措施;脊髓全横断损伤引发大脑皮质运动区神经元凋亡基因表达失控,进而导致细胞凋亡,因此,脊髓损伤的研究必须考虑到脊髓自身以外的损害,特别是大脑皮质。2.NSC和OEC作为两种有用的“种子”细胞,其单独和联合移植能有效促进脊髓损伤大鼠运动功能部分恢复,且联合移植优于单细胞移植。3.NSC和OEC联合移植发挥作用的机制可能涉及:①OEC能促进NSC的增殖和向神经元分化;②减少大脑皮质运动区神经元凋亡;③促进抗凋亡因子Bcl-2的基因和蛋白质表达;④调节ERK1/2信号转导通路。
任长乐[5]2009年在《滋补脾阴方药联合骨髓间充质干细胞移植对脊髓损伤影响的实验研究》文中研究表明脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)是骨科领域致残率、死亡率较高的创伤之一,是运动意外、交通、事故中常见的损伤。SCI包括原发性损伤和继发性损伤。原发性损伤为不可逆性改变,继发性损伤的病理改变包括轴突断裂、髓鞘崩解以及神经细胞的坏死和凋亡,治疗要素为解除脊髓压迫、重建脊柱的稳定性、避免继发性损伤。一个多世纪以来,很多学者对脊髓损伤的病因、病理、预防、治疗进行了研究,并就其损伤后的生长环境、自身的修复能力、促进再生修复的方法论述了不同的看法和观点。总结如下:(1)移植组织或细胞如神经干细胞、骨髓间充质干细胞、胚胎组织等桥接损伤部位;(2)应用神经营养因子及药物减轻继发性损伤;(3)消除抑制脊髓修复的各种因素,如降解胶质斑痕,消除抑制轴突再生的各种因素因子;(4)使脱髓鞘的轴突重新髓鞘化;(5)研究细胞的转导机制,刺激或调节细胞内生长锥的靶器官途径。而如何桥接脊髓断端并促进神经传导信号通路的重建是脊髓损伤再生修复的重要研究方向。活性巨噬细胞(Activated Macrophages AMPs)来源丰富,取材简便,易分离培养,来源于自身无免疫排斥。将活性巨噬细胞作为移植材料以促进轴突的再生是最近几年对炎症机制中巨噬细胞重新认识的结果,外源活性巨噬细胞聚集可改善局部微环境,减轻脊髓继发性损伤。我们将活性巨噬细胞移植到损伤大鼠脊髓的部位,观察损伤脊髓的功能恢复情况。实验研究证明,活性巨噬细胞对脊髓感觉及运动神经的损伤有一定的恢复作用。活性巨噬细胞在宿主脊髓中存活并促进脊髓功能恢复,其可能的机制有:(1)通过细胞移植有效的减少脊髓损伤后断端胶质瘢痕的形成。(2)清除损伤局部坏死的细胞及组织,清除轴突再生抑制物质。(3)通过炎症机制保护、恢复部分损伤的组织。(4)刺激和分泌细胞再生所需的营养物质,并调控轴突再生所需的细胞底物和蛋白酶。骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是成年动物或人骨髓中的非造血组织干细胞,具有多能干细胞的特点,能分化成多种类型的细胞,实验研究证实,MSCs具有诱导分化为神经细胞的潜能并且能向神经干细胞一样在中枢神经组织里迁移和整合,能分泌神经营养因子、细胞因子和其他生物活性因子,为治疗脊髓损伤展示了一种全新和理想的方法,将MSCs移植入大鼠脊髓损伤部位,显示MSCs可以存活,并能很好地整合到宿主组织中,并在没有基因修饰时也能促进轴突的生长。MSCs较其他移植细胞具有来源广泛、取材容易、在体外长期培养过程中始终保持其多向分化潜能、体内移植反应弱、克服了有关伦理学及免疫排斥反应问题等优点,因此探索MSCs移植治疗SCI具有重要的临床意义。研究已发现由氧自由基介导的脂质过氧化反应对脊髓继发性损伤起主要作用。脂质过氧化损伤的程度对移植细胞的命运影响也很大。祖国医学将SCI所致的截瘫,归属于体惰和痿证的范畴,治疗上以活血化瘀、疏通督脉、通经活络、益气补血、补肾填精为主。肾主骨生精髓,精髓伤则肾伤,精血互生,肾所生精髓需靠后天之本、气血化生之源的脾胃源源不断地充盈。滋补脾阴方药(NPR nourishing piyin remedy)具有益气补血、补肾填精、充盈脾胃等功效,可以改善脊髓细胞线粒体ATP酶活性,缓解脂质过氧化反应;并能通过调节磷脂代谢,增强线粒体膜抗氧化能力以保护脑神经细胞。本实验探讨了滋补脾阴方药含药血清对MSCs细胞脂质过氧化损伤的保护作用及机制,旨在探索联合应用含药血清和MSCs细胞移植对脊髓损伤的修复作用。实验一活性巨噬细胞移植促进脊髓损伤后功能恢复的实验研究目的:探讨活性巨噬细胞移植对脊髓损伤修复的促进作用。方法:用改良Allen法制成大鼠脊髓损伤动物模型,随机分成对照组(A组),脊髓损伤后脊髓内微量注射生理盐水溶液20μl。活性巨噬细胞移植组(B组),脊髓损伤后脊髓内注射活性巨噬细胞悬液20μl。移植后7、14、28d采用斜板实验、脊髓运动功能BBB评分法(Basso,Beattie and Bresnahan locomotor rating scale,BBB scale)观察大鼠运动功能恢复情况,脊髓诱发电位的检测观察神经功能恢复,HE染色观察脊髓损伤处空洞面积的改变情况,免疫组化法观察移植的活性巨噬细胞的存活情况及损伤部位神经纤维的再生情况。结果:术后28d,两组斜板倾斜角度差异有统计学意义(A组44.96°±5.70°,B组52.72°±6.51°,p<0.05)。术后28d,两组BBB评分差异有统计学意义(A组6.8±1.2,B组11.8±2.2,p<0.05)。术后28d,两组MEP潜伏期差异有统计学意义〔A组( 4.69±0.47 ) ms , B组(3.62±1.29)ms, p<0.05〕。两组SEP潜伏期差异有统计学意义〔A组(4.19±1.97)ms,B组(2.01±0.55)ms,p<0.05〕。两组神经轴突计数差异有统计学意义〔A组(32.8±6.1)条/mm2,B组(40.8±9.0)条/mm2,p<0.05〕。实验组可见损伤区巨噬细胞存在,脊髓损伤处的空洞面积明显减小,明显的神经纤维再生。结论:活性巨噬细胞可在脊髓损伤处存活并减轻脊髓损伤,能够减小脊髓损伤处的空洞面积,促进受损轴突的再生和运动功能的恢复。实验二骨髓间充质干细胞移植对大鼠脊髓损伤后功能恢复的影响目的:观察骨髓间充质干细胞(MSCs)移植对脊髓损伤修复的促进作用。方法:用改良Allen法制成大鼠脊髓损伤动物模型。随机分成对照组(A组),脊髓损伤9d后脊髓内微量注射生理盐水溶液5μl;骨髓间充质干细胞移植组(B组),脊髓损伤9d后脊髓内注射骨髓间充质干细胞悬液5μl。移植后7、14、28d采用斜板实验、脊髓运动功能BBB评分法(Basso,Beattie and Bresnahan)观察大鼠运动功能恢复情况,脊髓诱发电位的检测观察神经功能恢复,HE染色观察脊髓损伤处空洞面积的改变情况,免疫组化法观察移植的骨髓间充质干细胞的存活及分化情况,损伤部位神经纤维的再生情况。结果:移植后28d,两组斜板倾斜角度差异有统计学意义〔A组(44.96±5.70)°,B组(53.19±6.51)°,p<0.05〕;两组BBB评分差异有统计学意义〔A组(6.8±1.2),B组(10.1±3.5),p<0.05〕。同时,两组MEP潜伏期差异有统计学意义〔A组( 4.69±0.47) ms, B组(3.97±0.83)ms,p<0.05〕,两组SEP潜伏期差异有统计学意义〔A组(4.19±1.97)ms,B组(2.60±0.92)ms,p<0.05〕。两组神经轴突计数差异有统计学意义〔A组(32.8±6.1)条/mm2,B组(39.0±4.6)条/mm2,p<0.05〕。实验组可见明显星形胶质细胞和神经纤维再生,脊髓损伤处的空洞面积明显减小。结论:骨髓间充质干细胞可在脊髓损伤处分化为神经元和神经胶质细胞,能够减小脊髓损伤处的空洞面积,促进受损轴突的再生和运动功能的恢复。实验叁滋补脾阴方药联合骨髓间充质干细胞移植对脊髓损伤影响的实验研究目的:探讨脊髓损伤后即刻移植骨髓间充质干细胞对功能恢复的影响,及滋补脾阴方药含药血清对移植细胞在体内存活、迁移和分化的影响。方法:成年雌性SD大鼠90只,随机分成A组(对照组)、B组(骨髓间充质干细胞移植组)、C组(骨髓间充质干细胞与空白血清共移植组)、D组(骨髓间充质干细胞与中药血清共移植组),利用自制电控打击器制作动物模型。移植后7、14、28d采用斜板实验、脊髓运动功能BBB评分法(Basso,Beattie and Bresnahan)观察大鼠运动功能恢复情况,脊髓诱发电位的检测观察神经功能恢复,HE染色观察脊髓损伤处空洞面积的改变情况,免疫组化法观察移植的骨髓间充质干细胞的存活及分化情况,损伤部位神经纤维的再生情况。结果:移植后28d,D组斜板倾斜角度与A、B、C组差异有统计学意义〔A组(44.96±5.69)°,B组(48.11±5.47)°,C组(49.59±5.76)°,D组(55.75±4.14)°,p<0.05〕; BBB评分各组的差异均有统计学意义〔A组(6.9±1.3),B组(8.5±1.1),C组(10.7±0.9),D组(12.3±10.6),p<0.05〕。同时,D组MEP潜伏期与A、B、C组差异有统计学意义〔A组(4.57±0.33)ms,B组(4.49±0.47)ms,C组(4.39±0.65)ms,D组(3.77±0.76)ms,p<0.05〕,D组SEP潜伏期与A、B、C组差异有统计学意义〔A组(4.19±0.93)ms,B组(3.71±1.15)ms,C组(3.63±0.77)ms,D组(2.52±0.57)ms,p<0.05〕。D组神经轴突计数与A、B、C组差异有统计学意义〔A组(32.8±6.21)条/mm2,B组(34.5±5.5)条/mm2,C组(36.2±5.4)条/mm2,D组(40.9±3.1)条/mm2,p<0.05〕。D组28d可见脊髓损伤处的空腔大部分被充填,神经纤维和胶质细胞再生。结论:骨髓间充质干细胞移植后,可以在体内存活、迁移并分化成熟,促进大鼠脊髓损伤后神经纤维的修复与再生。滋补脾阴方药含药血清可以改善损伤脊髓内环境,有利于移植细胞的存活、迁移及分化。二者联合应用具有协同效应。综上所述,本实验通过对滋补脾阴方药保护骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠脊髓损伤的研究,获得了以下成果:1.活性巨噬细胞来源丰富,取材简便,易分离培养,大量巨噬细胞聚集可改善局部微环境,减轻脊髓继发性损伤。2.骨髓间充质干细胞在脊髓损伤后移植,可以在体内存活、迁移并分化为成熟的神经元、星形胶质细胞及少突胶质细胞,从而促进大鼠脊髓损伤后神经纤维的修复与再生;是治疗脊髓损伤较有前景的细胞移植物。3.滋补脾阴方药含药血清可以改善损伤脊髓的内环境,减轻移植细胞的过氧化损伤反应,有利于脊髓损伤后即刻移植的骨髓间充质干细胞在体内的存活、迁移和分化。滋补脾阴方药含药血清与骨髓间充质干细胞移植联合应用治疗脊髓损伤,具有协同效应。4.如何进一步增强滋补脾阴方药含药血清的抗氧化损伤作用,还有待今后的实验研究与完善。骨髓间充质干细胞与组织工程支架的联合应用,与基因转染技术的联合应用方面还有广阔的研究空间,待广大学者研究探讨。
徐明[6]2004年在《大鼠嗅鞘细胞移植治疗脊髓损伤的实验研究》文中认为大鼠嗅鞘细胞移植治疗脊髓损伤的实验研究 第一部分：新生大鼠嗅球嗅鞘细胞的体外培养 目的 探讨新生大鼠嗅球嗅鞘细胞(OECs)的体外培养和纯化方法，并观察其形态学及免疫细胞化学特性，为研究脊髓损伤后神经再生获得丰富OECs来源奠定基础。方法原代培养的方法分离、培养新生大鼠嗅球OECs，比较p75抗体吸附、阿糖胞苷抑制、差速贴壁叁种方法纯化效果，根据GFAP免疫细胞化学染色结果统计所得OECs的纯度，同时在相差显微镜下对不同培养时期的OECs的形态进行观察。结果体外培养的新生大鼠嗅球OECs主要为双极或叁极细胞，其突起细长。未经纯化则成纤维细胞生长迅速而占据优势，而叁种纯化方法中均能使接种14天后OECs纯度均在75％以上。p75抗体吸附法和阿糖胞苷抑制纯化效率略高于差速贴壁法。结论 新生大鼠嗅球OECs的原代培养中细胞纯化是必要的；在脊髓损伤再生研究中，较之p75抗体吸附、阿糖胞苷抑制，差速贴壁法是一种简单、经济、实用的OECs纯化方法。 第二部分：嗅鞘细胞移植促进大鼠脊髓损伤后功能恢复 目的 探讨嗅鞘细胞(OECs)移植对脊髓损伤(SCI)的功能恢复和促进神经再生作用。方法 7只成年SD大鼠T_9脊髓半横断损伤后，植入体外培养纯化的OECs于脊髓损伤处，另7只对照组只植入DMEM培养基。术后10周内采用斜板试验和BBB联合功能评分观察大鼠运动功能恢复情况。术后10周末通过辣根过化物酶(HRP)逆行示踪技术评价OECs对神经元存活和纤维再生的影响。结果 OECs移植组大鼠损伤侧后肢运动功能的恢复情况和损伤侧红核HRP标记神经元的数目均优于未移植对照组。结论 OECs移植能促进成年大鼠SCI后宿主损伤脊髓的功能恢复和轴突再生。
王莉[7]2007年在《神经干细胞联合应用丙戊酸治疗对成鼠脊髓损伤的修复作用》文中进行了进一步梳理脊髓损伤(spinal cord injury, SCI)是中枢神经系统(central nervous system, CNS)中常见的严重创伤,常导致不可逆性的感觉及运动功能丧失,主要表现为损伤平面以下感觉、运动功能的完全丧失和大小便失禁。脊髓损伤所致截瘫不仅给患者带来巨大的身心痛苦,而且也给其家庭和社会带来沉重的经济负担和严重的社会问题。现代社会与建设的发展,交通事故、高空坠落、灾害事故(如地震、海啸等)、运动损伤等的频发使脊髓损伤呈现出“叁高一低(高发生率、高伤残率、高耗费和低死亡率)”的新特点,因而,加强脊髓损伤的救治和截瘫康复研究成为广大神经科工作者亟待解决的热点和难点课题。以往的治疗方法多局限于脊柱骨折脱位后的复位固定、解除脊髓压迫、控制水肿、改善微循环等对症治疗和康复治疗,疗效欠佳。近年来,细胞移植尤其是神经干细胞移植从促进损伤脊髓再生与修复的目的出发,为SCI的治疗带来了新的希望。细胞移植治疗SCI的原理主要为:①通过细胞移植填充脊髓缺损,给神经元的再生提供一个细胞生长和附着的场所;②提供新的神经元,替代受损或坏死神经元的功能,修复神经通路;③移植细胞提供促进神经再生的各种细胞因子,如各种神经营养因子(neurotrophic fectors, NTFs),包括神经营养素(neurotrophins, NTs)、脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)、神经生长因子(nerve growth factor, NGF)等,显示了良好的应用前景。神经干细胞(neural stem cells, NSCs)是一类广泛存在于哺乳动物胚胎神经组织(大脑皮层、侧脑室、室管膜下层、海马、纹状体及中脑及脊髓)和成年动物CNS某些特定部位(大脑皮层、室管膜下区、侧脑室壁、海马齿状回和嗅回及脊髓中央管室管膜区)的一种干细胞,具有自我更新和多向分化潜能。作为修复神经系统损伤的种子细胞,它不但能满足移植时所需的细胞量,而且NSCs在一定条件下能分化为包括神经元在内的叁种不同的神经细胞系。NSCs具有获取、培养、鉴定容易,可在体外大量增殖、分化等优点,适合作为移植实验的供体。尽管从理论上讲神经干细胞的功能完美无缺,但近年来研究发现单独NSCs应用于成年SCI的治疗存在如下问题:发育的可塑性差,缺乏对NSCs定向诱导为神经元的条件;无法解决移植后分化产生的神经元少、胶质细胞大量增生的不利情形;无法提供建立大量功能性轴突连接所需要的神经元;且大量形成的胶质瘢痕不仅占据轴突生长所需要的空间,而且更为严重的是分泌抑制轴突再生的因子,不利于轴突的再生。因此,如何促进移植到损伤脊髓的NSCs向神经元分化、抑制SCI修复过程中胶质瘢痕的增生,成为利用NSCs移植修复损伤脊髓亟待解决的关键问题之一。丙戊酸(valproic acid,VPA)作为抗惊厥、抗癫痫的一线药物,已在临床广泛应用近40年,其安全性可靠。近年的研究表明,在体外细胞培养实验中VPA能明显提高NSCs向神经元分化的比例,分化比例可高达80%左右,同时还具有保护神经元、降低炎性反应、减少胶质细胞增生等作用。但VPA是否能促进体外神经干细胞的增殖及在体内促进神经干细胞向神经元分化、抑制胶质瘢痕形成,从而促进损伤脊髓的结构和功能修复,目前尚未见相关的研究报道。因此,我们首先在体外细胞培养中观察VPA是否具有促进NSCs增殖及向神经元分化的作用,然后进行体内实验研究,将NSCs与VPA联合应用治疗成年大鼠脊髓损伤,观察VPA作用下NSCs在体内的存活、分化情况以及它们对成体损伤脊髓的修复作用。在体实验分为六组:A组:脊髓T10半切块状缺损组;B组:半切缺损处放入吸收性明胶海绵;C组:半切处放入吸收性明胶海绵,同时按300mg/kg/d腹腔注射VPA,分两次注射;D组:半切处放入吸附有NSCs的吸收性明胶海绵;E组:半切缺损处放入吸附有移植NSCs的吸收性明胶海绵,同时按300mg/kg/d腹腔注射VPA,分两次注射;F组:半切缺损处放入吸附有移植NSCs和1.0 mmol/L VPA的吸收性明胶海绵,同时按300mg/kg/d腹腔注射VPA,分两次注射。通过免疫组织化学和神经病理形态学技术观察VPA对移植神经干细胞分化作用的影响,用核黄和DIL进行神经纤维逆行和顺行示踪研究,评价再生纤维的连接及轴浆运输功能的恢复情况,最后对各组进行后肢BBB运动功能评分和电生理学功能检测。主要的研究结果和结论如下:(1) VPA能促进培养NSCs的增殖,并具有一定的量效和时效关系,浓度以1.0 mmol/L为最佳,时间在培养3-7天时增殖最明显。(2) VPA对培养NSCs的分化具有重要的调控作用,能抑制NSCs向胶质细胞分化,诱导NSCs向神经元分化的比例可高达80%。(3)在体研究发现,移植的NSCs不仅能够存活,而且能够向损伤周围的脊髓组织迁移。(4)脊髓损伤后2周内,VPA能在一定程度上维持损伤脊髓内移植NSCs的增殖状态;2周后能明显促进移植NSCs向神经元分化。(5)通过神经病理学技术观察到:NSCs移植联合VPA治疗成鼠脊髓损伤后,移植细胞能填补组织缺损,再生神经纤维数量较多、排列规则,星形胶质细胞增生明显受抑,未见胶质瘢痕形成,移植部位分化神经元可与损伤周围脊髓组织形成良好的纤维联系,对损伤脊髓的结构具有较好的修复作用。(6)通过核黄、DIL神经纤维逆行和顺行示踪研究,观察到NSCs移植联合VPA治疗成鼠脊髓损伤后,能够较好地恢复损伤脊髓部位的轴浆运输功能。(7)通过后肢BBB运动评分和诱发电位检测研究,观察到NSCs移植联合VPA治疗成鼠脊髓损伤后,对后肢整体运动功能和损伤脊髓的感觉和运动传导功能的修复具有明显的促进作用。
张秦宏[8]2008年在《电针对大鼠急性脊髓损伤后胶质纤维酸性蛋白表达影响的实验研究》文中研究表明目的:通过观察电针治疗脊髓损伤前后脊髓组织中GFAP表达的变化情况来阐明电针治疗脊髓损伤的机理。方法:Wistar大鼠60只,随机分为:对照组(A组)20只,模型组(B组)20只和电针治疗组(C组)20只。采用改良的Allen's法建立SCI模型。治疗采用KWD-808Ⅱ型脉冲电针仪,选择连续密波,频率100Hz,电压9V,在T_9～T_(10)和T_(10)～T_(11)棘突间隙旁开距中线3-4mm处取穴,操作时电针仪的二组导线分别上下连接针柄,正极在上,负极在下,然后打开电流输出旋钮,电流输出强度以背部肌肉出现轻微抽动为度。每日治疗2次,每次15分钟。最后分别于不同的时间点:术后3d,7d,14d和21d取损伤部位的脊髓组织,采用免疫组化、蛋白印迹(Western Blot)等方法和光镜技术来检测脊髓组织中的GFAP表达的变化,采用BBB评分方法对各组实验大鼠后肢运动功能进行评估。结果:1.BBB评分结果显示:脊髓损伤后3d,大鼠BBB评分C组优于B组,统计学有显着差异(P＜0.05)1w开始,C组大鼠明显优于B组,统计学有非常显着差异(P＜0.01),但两组评分均低于A组(P＜0.01)。2.免疫组化染色结果显示:脊髓损伤后经电针治疗后3d,7d,大鼠C组星形胶质细胞数明显低于B组,统计学有非常显着差异(P＜0.01),14d后C组星形胶质细胞数仍低于B组,统计学有显着差异(P＜0.05),但21d后C组星形胶质细胞数与B组相近,统计学无显着差异(P＞0.05).3.Western Blot结果显示:各组脊髓均有GFAP蛋白表达。B组GFAP蛋白表达呈递增趋势。2w后表达最强,以后逐渐降低,B组表达明显高于A,C组。结论:1.电针能减少星形胶质细胞增生,从而创造了有利于脊髓损伤后功能恢复的微环境。因此证明是治疗脊髓损伤的有效手段。2.电针能够促进脊髓损伤后功能的恢复,其机理可能是通过抑制GFAP的表达而起作用。3.脊髓损伤后2周内可能为修复损伤的一个时间窗口,提示越早治疗效果越好。
麻文谦[9]2007年在《周围神经组织游离移植修复大鼠陈旧性脊髓损伤的实验研究》文中认为目的探讨利用自体周围神经组织游离移植修复大鼠陈旧性脊髓损伤的作用机理。方法利用改良Allen撞击方法建立脊髓打击损伤模型,12周后,实验组大鼠切取后肢腓肠神经,应用显微外科技术去除神经外膜游离移植于脊髓损伤处,对照组仅显露脊髓损伤处,不作神经移植。术后4,8,12周综合运用病理学,电生理学及行为学等手段分析研究移植周围神经与脊髓间的变化及大鼠后肢功能恢复情况。结果周围神经移植后损伤处脊髓的病理改变好转,脊髓体感诱发电位(SEP)及大鼠后肢运动功能恢复优于对照组。结论经显微外科技术处理的周围神经组织移植后可促进大鼠脊髓结构和功能的恢复。
刘媛[10]2003年在《神经干细胞移植对大鼠损伤脊髓的修复作用》文中提出脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)后的功能障碍不仅使患者饱尝着身心痛苦，而且给社会和家庭带来巨大的经济负担。因此,如何使截瘫的患者从轮椅上站起来是临床医生和研究人员孜孜以求的目标。神经干细胞的发现为截瘫患者带来了曙光，也坚定了战胜这一痼疾的信心。神经干细胞的发现打破了成年哺乳动物神经组织不能再生的传统 “定论”。研究表明：成年大鼠的神经干细胞主要位于海马和脑室管膜下区,而胚胎中枢神经系统(central nervous system,CNS)中则广泛存在神经干细胞(neuralstem cells,NSC)。进一步研究发现成年大鼠大脑皮质第VI层凋亡性损伤后，位于该脑区的内源性NSC能被诱导分化为该层特异性投射神经元，修复受损脑区功能。但由于内源性NSC的数量有限，难以满足大范围、严重的CNS损伤，于是利用外源性NSC移植修复CNS损伤已受到广泛关注。首先，NSC具有自我复制的功能，能满足移植时所需的细胞量；其次，NSC在一定条件下能分化为叁种不同神经细胞系即：神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞，能克服单一种类细胞移植导致局限性功能恢复的缺陷和致瘤的弊端；另外，不同来源的NSC生长、分化具有相对的特异性。脊髓源性的NSC所分化的神经元突起较长，这与脊髓组织中神经元的结构特征是相吻合的；而同样条件下皮层来源的NSC，所分化的神经元数量多、突起短。鉴于上述原因，我们首先从E12- E14天大鼠的脊髓组织中分离和培养NSC,用免疫细胞化学方法对其进行鉴定，并观察不同细胞因子对克隆形成的影响，然后在不同的条件下对其诱导分化，同时将所获NSC作为移植供体，替代受损脊髓组织，过行为学、神经电生理、免疫组织化学、病理学等技术手段，观察在损伤大鼠体内的存活、分化情况及其对损伤脊髓的修复作用。并初步探讨其机理，主要结果如下：1、我们观察到在胚胎大鼠的脊髓组织中，存在着bFGF反应性的、具有自我增殖能力的NSC，而且仅在bFGF的作用下，就能较好的保持自我复制的能力。2、在NSC的原代培养中，采用Neural basal+bFGF、Neural basal +bFGF+EGF以及Neural basal+EGF叁种不同的培养基发现：Neural basal +bFGF能较好的促进NSC的存活及增殖，是一种较为经济、有效的获取NSC的方法。3、NSC在一定的条件下，能够分化为叁种不同的细胞系即：神经元、星形胶质<WP=7>细胞和少突胶质细胞，而且分化为叁种细胞的比例随着培养条件的变化而发生改变，其中无血清诱导条件下，分化为神经元的比例最大；而血清浓度越高，分化成胶质细胞的数量越多。4、通过病理学检测观察到：移植的NSC能够在脊髓损伤的微环境中生存达8周之久。可封闭空洞并部分充填组织缺损，并与正常部位的脊髓形成纤维联系。5、移植的NSC能在损伤的环境中发生分化，其中胶质细胞的含量占优势，亦可见分化、存活的神经元。其中神经元的突起较多、形态清晰。提示在损伤环境各种因素相互作用下，可能更有利于NSC向胶质方向分化。6、通过HRP逆行示踪显示：移植组于4、8周后，损伤脊髓同侧上段前角处HRP染色阳性神经元的数量明显多于损伤组，提示移植的NSC可能部分地修复了损伤脊髓的纤维联系。7、将NSC植入损伤脊髓8周后，对同侧下肢腓肠肌运动终板胆碱酯酶染色观察到：移植组运动终板形态较完整、染色较均匀、无空泡区出现。提示NSC移植后，可能重新恢复中枢与外周的纤维联系，使下肢肌肉重新获得神经支配，通过神经的营养作用阻止运动终板的退变。8、通过BBB评分和MEP、SEP的检测证明NSC移植组感觉和运动功能的恢复均优于单纯损伤组。
参考文献：
[1]. 组织移植和神经营养因子对损伤脊髓的修复作用及机理研究[D]. 张强. 第叁军医大学. 2001
[2]. 完整胚胎脊髓移植联合BDNF对大鼠完全脊髓横断损伤修复作用的研究[D]. 赵凡. 吉林大学. 2006
[3]. 鹿茸多肽对脊髓损伤大鼠的保护作用及其机制研究[D]. 冷向阳. 吉林大学. 2007
[4]. NSC和OEC联合移植对SCT大鼠大脑皮质运动区神经元的作用及相关机制研究[D]. 李云. 昆明医学院. 2010
[5]. 滋补脾阴方药联合骨髓间充质干细胞移植对脊髓损伤影响的实验研究[D]. 任长乐. 大连医科大学. 2009
[6]. 大鼠嗅鞘细胞移植治疗脊髓损伤的实验研究[D]. 徐明. 苏州大学. 2004
[7]. 神经干细胞联合应用丙戊酸治疗对成鼠脊髓损伤的修复作用[D]. 王莉. 第叁军医大学. 2007
[8]. 电针对大鼠急性脊髓损伤后胶质纤维酸性蛋白表达影响的实验研究[D]. 张秦宏. 黑龙江中医药大学. 2008
[9]. 周围神经组织游离移植修复大鼠陈旧性脊髓损伤的实验研究[D]. 麻文谦. 第二军医大学. 2007
[10]. 神经干细胞移植对大鼠损伤脊髓的修复作用[D]. 刘媛. 第叁军医大学. 2003
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