张为民[1]2001年在《实验性鼠脑梗塞早期活性MMP-9的表达研究》文中研究说明【背景和目的】细胞外基质（ECM）是一种以高度方式组合的多功能蛋 白质和蛋白多糖复合物，在机体内参与组织、细胞结构完整性的维 持；基底膜（BM）是一层特殊的ECM，参与血管壁结构的构成， 由ECM分子如IV型胶原、层粘连蛋白（LN）、纤连蛋白组成，正常 情况下，ECM处于不断产生和不断降解的动态平衡中，病理情况下， ECM调节失衡，导致组织结构损伤、破坏。基质金属蛋白酶（MMPs） 是一组降解ECM的蛋白分解酶，在许多病理过程中起作用，如动脉 粥样硬化、炎性反应、肿瘤生长和浸润等。MMP-9即92KDⅣ型胶 原酶（又称明胶酶B），是MMPs家属中分子量最大的一种，其主要 功能是降解ECM分子，包括Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型胶原、明胶、弹性蛋白、 纤维连接蛋白等。近年有报道，脑缺血早期损伤与MMP-9表达升高 有关，但对活性型MMP-9出现的时间大家看法不一。另外，能否通 过检测外周血中MMP-9的浓度来反映其相应脑组织局部含量的变 化，尚无相关研究报道。本实验主要基于以上问题而设计探讨。【方法】用线栓法建立SD大鼠永久性大脑中动脉闭塞（MCAO）模型， 经过2h、6h和16h的血管闭塞后，观察大鼠行为学改变；用TTC 和HE法染色各组脑片，观察脑组织形态学改变；用ELISA法测定 浙江大学硕士学位论文2001 右脑组织和血浆中活性 MMP．9水平。所得数据用 SPSS刀统计软 包进行分析。【结果］1．行为学：各血管闭塞组大鼠麻醉醒后出现局灶性脑损伤的行为学表 现。2．形态学：Zh时点右脑组织未出现明显神经细胞损害；随栓塞时间延 长，6h和 16h逐见梗塞病灶，神经细胞出现显着变性、坏死，尤以 16h点为着。3．生化学：脑组织活性 MMP．9于梗塞后 6 h开始升高，16h明显增高， 达 14 ＊812．59u／mg，各为 6h、Zh时点的 1．9和 2．2倍（P＜0＊5）。血浆 中各时点活性 MMP－9含量的改变与脑组织中相似，16h时点最高， 各为6h、Zh时点的2．7和2．2倍什叼刀5），但血浆中6h点未见升高。【结论】1．脑梗塞早期可以诱导MMP－9基因表达，其组织中活性成份于血管闭 塞后6小时开始增高，16小时明显升高。并与脑组织损伤加重的时 间相一致。2．检测血浆中活性MMP－9的含量能在一定程度上反映其脑组织局部浓 度的变化。提示其可作为临床应用的一项检测指标。
谭涛[2]2012年在《补阳还五汤对脑梗死急性期患者血管新生相关因子及MCAO小鼠蛋白芯片表达的影响》文中指出[目的]：观察补阳还五汤对脑梗死急性期患者的临床疗效及血清VEGF、Ang-1含量变化及MCAO小鼠蛋白芯片表达的影响,进而从血管新生方面阐述补阳还五汤的作用机理。[方法]：临床资料将90例入选病例随机分成对照组、汤剂组和超微组各30例,对照组按西医常规治疗,汤剂组在对照组基础上加服补阳还五汤汤剂,超微组在对照组基础上加用超微补阳还五汤,与治疗前及治疗后1d、7d、14d检测血清VEGF和Ang-1含量的变化,并从神经功能缺损积分,中医临床症候积分的改善分析评价疗效。同时选用SPF级小鼠20只,线栓法造模后分为模型组和补阳还五汤组,每组10只,模型组给予生理盐水3ml。补阳还五汤汤剂组给予补阳还五汤传统汤剂灌胃,2组动物喂养21天后断头取脑,进行细胞因子芯片检测。[结果]：治疗后叁组神经功能缺损积分较治疗前均有改善(P<0.05),汤剂组、超微组改善更明显(P<0.05)；治疗后对照组显效率为31.03%,总有效率为79.31%,汤剂组显效率为56.67%,总有效率为90.00%,超微组显效率为65.52%,总有效率为93.10%,叁组疗效比较,汤剂组、超微组优于对照组,汤剂组、超微组之间无差异。两组中医证候均有好转(P<0.05)；中医证候疗效,对照组显效率为31.03%,总有效率为79.31%,汤剂组显效率为56.67%,总有效率为90.00%,超微组显效率为65.52%,总有效率为93.10%,叁组疗效比较,汤剂组、超微组优于对照组,汤剂组、超微组之间无差异。对照组患者血清VEGF、Ang-1含量有下降趋势,治疗7d、14d后较治疗前降低(P>0.05),汤剂组、超微组患者血清VEGF、Ang-1水平在7d、14d均有提高(P<0.05)。实验资料显示与对照组比较,补阳还五汤组有4个细胞因子蛋白表达稳定下调,1个细胞因子蛋白表达稳定上调。[结论]：补阳还五汤能够明显降低脑梗死急性期患者的神经功能缺损积分及中医证候积分,提高临床疗效,与汤剂无明显差异。超微补阳还五汤能够显着增加并维持血液VEGF、Ang-1水平,与汤剂无明显差别。促进血管新生可能是补阳还五汤治疗脑梗死急性期的作用机制之一,补阳还五汤对脑梗死急性期患者血管新生相关因子的影响可能与细胞因子蛋白表达下调有关。
冯淑怡[3]2007年在《含与不含朱砂雄黄的安宫牛黄丸对大鼠出血性脑损伤的保护作用及机理研究》文中提出脑出血是指非外伤性脑实质内出血,属中医中风病之范畴。其患病人数约占所有脑卒中病人的20%~30%,住院死亡率往往高达43%~51%。且现在发病年龄呈年轻化的趋势,因此对脑出血的治疗和实验方面的研究日益受到关注。对于脑出血的治疗,中医有着独特的疗效。传统医学认为脑出血为风火相煽,痰湿蕴盛,瘀血阻滞致气血逆乱,上犯于脑而发病。因此中医治疗拟予化痰通腑、解毒通络、泻火熄风开窍、活血化瘀等法。安宫牛黄丸具有清热解毒、镇惊开窍之功效,在临床上对于脑出血的治疗有很好的疗效。方中朱砂、雄黄由于含有重金属化合物,历来是大家争议的焦点。中医理论认为:雄黄具有清热解毒、化瘀消积的功效,朱砂具有清心镇惊,安神解毒的功效。从二者的功效上看,与中医治疗出血性中风的治法相一致,因此北京市科委立专项(项目编号:H040230130712)探讨含与不含朱砂雄黄的安宫牛黄丸在药效上的区别,以明确朱砂、雄黄在安宫牛黄丸方中存在的意义。本论文研究的主要内容包括两部分:第一部分采用大鼠脑出血损伤动物模型,从整体水平观察含与不含朱砂雄黄的安宫牛黄丸对大鼠脑出血损伤的保护作用并探讨其机制;第二部分从细胞水平观察含与不含朱砂雄黄的安宫牛黄丸含药血清和含药脑脊液对原代皮层神经元的保护作用并探讨其机制。第一部分含与不含朱砂雄黄的安宫牛黄丸对大鼠脑出血损伤的保护作用及机制研究建立胶原酶诱导大鼠脑出血损伤动物模型,观察安宫牛黄丸对大鼠脑出血损伤的保护作用,并探讨其可能机制,同时以不含朱砂雄黄的安宫牛黄丸与之对比,观察去掉朱砂雄黄之后作用与全方是否存在差别。1含与不含朱砂、雄黄的安宫牛黄丸对脑出血大鼠保护作用的研究目的:研究安宫牛黄丸对脑出血模型大鼠神经症状、脑系数、脑含水量、全血的血液流变性、抗氧化能力、病理形态学的影响。同时观察不含朱砂雄黄的安宫牛黄丸与之是否存在差异。方法:采用尾状核注射胶原酶(TYPEⅣ)脑出血模型大鼠,于术后第3天进行神经病学症状评分;称重法测定脑系数;干湿重法测定脑含水量;生化试剂盒检测脑组织匀浆中LDH、SOD活性,MDA含量;血流变仪进行血液流变学检测;HE染色进行病理形态学观察。结果:(1)模型组动物神经功能症状评分、脑指数、脑含水量增加;红细胞变形性降低;LDH活性升高,SOD活性降低,MDA含量增加;损伤侧脑组织可见出血、水肿,血肿周边脑组织呈大片变性、坏死,神经细胞肿胀等明显病理形态学改变。(2)安宫牛黄丸200mg/kg、400mg/kg可显着改善神经症状评分(与模型组比,p<0.01, p<0.05)、降低脑指数(与模型组比,p<0.01,p<0.05),提高红细胞变形性(与模型组比,p<0.05),提高SOD活性(与模型组比,p<0.05, p<0.01),降低MDA含量(与模型组比,p<0.01),降低LDH活性(与模型组比,p<0.01);缩小出血面积、减轻组织间隙水肿、修复血肿周围组织,减轻神经细胞肿胀。(3)不含朱砂雄黄的安宫牛黄丸两个剂量组改善动物神经功能障碍的作用不显着,小剂量提高红细胞变形性、降低脑指数作用不显着,与模型组相比未见显着差异。320mg/kg可明显降低脑组织含水量(与模型组比,p<0.05);提高SOD活性(与模型组比,p<0.05);降低LDH活性(与模型组比,p<0.05)。160mg/kg、320mg/kg可显着降低MDA含量(与模型组比,p<0.01, p<0.05);可缩小出血面积、促进血肿周围组织修复。结论:(1)安宫牛黄丸对脑出血模型大鼠有保护作用。可显着改善神经症状、降低脑指数、提高红细胞变形性,降低LDH活性、提高SOD活性、降低MDA含量,改善组织病理形态。(2)去朱砂、雄黄后改善神经症状作用有所减弱,两个剂量组与模型组相比均无显着性差异。降低脑指数、提高脑组织SOD活性,减少LDH含量和提高红细胞变形性指标上作用有所减弱,小剂量组与模型组相比无显着性差异。全方等效剂量对这些指标有显着改善作用,但两种药物等效剂量组间比较无显着性差异。2含与不含朱砂雄黄的安宫牛黄丸对脑出血模型大鼠脑组织凋亡相关蛋白、血脑屏障通透性相关蛋白的影响目的:探讨安宫牛黄丸对脑出血模型大鼠细胞凋亡、凋亡相关蛋白表达、以及血脑屏障通透性相关蛋白表达的影响。同时观察不含朱砂雄黄的安宫牛黄丸对这些蛋白表达的影响与之是否存在差异。方法:用免疫组化的方法观察脑出血模型大鼠出血侧细胞的凋亡(TUNEL染色)、凋亡相关蛋白的表达(Bcl-2,Bax)、血脑屏障通透性相关蛋白(MMP9、AQP4)的表达。结果:(1)模型大鼠TUNEL染色阳性表达增加,说明脑出血后脑组织细胞出现凋亡。Bax染色模型组阳性表达较假手术明显增加,MMP9、AQP4染色模型组阳性表达增加。(2)安宫牛黄丸400mg/kg可以显着减少TUNEL染色阳性表达(与模型组比,p<0.05),可促进Bcl-2的表达,安宫牛黄丸200mg/kg、400mg/kg剂量组可以减少AQP4的阳性表达(与模型组比,p<0.01),减少MMP9的阳性表达(与模型组比,p<0.01),减少Bax阳性表达(与模型组比,p<0.01)。(3)不含朱砂雄黄的安宫牛黄丸160mg/kg、320mg/kg可以减少MMP9(与模型组比,p<0.01)、AQP4的阳性表达(与模型组比,p<0.05),减少Bax的阳性表达(与模型组比,p<0.01,p<0.05)。两个剂量组促进Bcl-2表达的作用均不显着。结论:(1)安宫牛黄丸可以通过抗凋亡、影响血脑屏障通透性来发挥神经保护作用。(2)不含朱砂雄黄的安宫牛黄丸对血脑屏障通透性相关蛋白表达的影响与全方相近,对凋亡的抑制作用有所减弱,两个剂量组TUNEL染色阳性表达与模型组相比均无显着性差异。两个剂量组促进Bcl-2表达的作用均不显着。全方和简方等效剂量组间比较无显着性差异。3含与不含朱砂雄黄的安宫牛黄丸对脑出血模型大鼠脑组织MAPK通路的影响目的:探讨安宫牛黄丸对脑出血模型大鼠脑组织MAPK通路的影响,同时观察不含朱砂雄黄的安宫牛黄丸对脑出血模型大鼠MAPK通路的影响与之是否存在差异。方法:应用免疫组化的方法观察脑出血大鼠脑组织与MAPK通路活化相关蛋白—PKC、MAPK通路底物蛋白c-fos、c-jun的表达,用实时荧光定量RT-PCR的方法观察MAPK通路家族ERKmRNA、P38mRNA的表达,比较不含朱砂、雄黄的安宫牛黄丸对其表达的影响与安宫牛黄丸是否存在差异。结果:(1)出血损伤引起脑组织PKC、c-fos、c-jun蛋白表达增加,ERKmRNA表达减少,P38mRNA表达增加。(2)安宫牛黄丸200mg/kg、400mg/kg减少c-fos的表达(与模型组比,p<0.01)、减少c-jun的表达(与模型组比,p<0.01),减少PKC的表达(与模型组比,p<0.05),促进ERKmRNA表达(与模型组比,p<0.05)、减少P38mRNA的表达(与模型组比,p<0.01)。(3)不含朱砂雄黄的安宫牛黄丸两个剂量组也可减少c-fos、c-jun、PKC的阳性表达(与模型组比,p<0.01or p<0.05),促进ERKmRNA表达(与模型组比,p<0.05)。不含朱砂雄黄的安宫牛黄丸大剂量减少c-fos、c-jun、P38mRNA表达的作用显着低于安宫牛黄丸大剂量(与全方大剂量比,p<0.05),小剂量减少c-fos阳性表达的作用显着低于安宫牛黄丸小剂量(与全方小剂量比,p<0.05)。结论:(1)安宫牛黄丸可以通过影响MAPK通路发挥神经保护作用。(2)不含朱砂雄黄的安宫牛黄丸也可以通过影响MAPK通路发挥神经保护作用。其中减少c-fos、c-jun、P38mRNA的表达的作用明显弱于安宫牛黄丸组,在这些指标上,两种药物相应剂量之间进行组间比较,差异有统计学意义。朱砂雄黄与安宫牛黄丸对MAPK通路的调节作用可能有关。第二部分含与不含朱砂雄黄的安宫牛黄丸对原代培养大鼠皮层神经元损伤的保护作用及机理的研究(血清、脑脊液药理)建立缺糖缺氧诱导损伤、谷氨酸诱导损伤原代培养皮层神经细胞模型,观察含与不含朱砂雄黄的安宫牛黄丸含药血清、含药脑脊液对两种损伤细胞的保护作用,及对损伤细胞线粒体膜电位、细胞内钙离子浓度的影响。同时进行脑脊液、血清中砷、汞含量测定,探讨神经元保护与血清、脑脊液中砷、汞的关系。4含与不含朱砂雄黄的安宫牛黄丸对体外培养的原代皮层神经元的保护作用目的:观察含与不含朱砂雄黄的安宫牛黄丸含药血清、含药脑脊液对损伤神经细胞的保护作用是否存在差异,明确朱砂雄黄在全方中的作用。方法:采用缺糖缺氧诱导损伤细胞模型和谷氨酸诱导损伤细胞模型,用血清药理学和脑脊液药理学的方法观察含与不含朱砂雄黄的安宫牛黄丸含药血清、含药脑脊液对损伤神经元的保护作用。结果:Ⅰ抗缺糖缺氧损伤(1)缺糖缺氧损伤使细胞LDH漏出率增加,细胞活性降低。(2)安宫牛黄丸800mg/kg剂量组含药血清、20%添加比例含药脑脊液可显着升高细胞活性(与模型组比,p<0.05),降低LDH漏出率(与模型组比,p<0.01,p<0.05);400mg/kg剂量组含药血清、20%添加比例含药脑脊液,可以显着降低LDH漏出率(与模型组比,p<0.05)。(3)不含朱砂雄黄的安宫牛黄丸640mg/kg含药血清、640mg/kg,20%添加比例含药脑脊液可显着升高细胞活性(与模型组比,p<0.05),降低LDH漏出率(与模型组比,p<0.05)。Ⅱ抗谷氨酸损伤(1)谷氨酸200μmmol·L-1损伤细胞后,LDH漏出率明显增加、细胞活性下降。细胞中MDA含量升高、SOD活性降低。(2)安宫牛黄丸800mg/kg剂量组含药血清、800mg/kg剂量组10%、20%添加比例的脑脊液可以显着提高损伤细胞的活性(与模型组比,p<0.05,p<0.01,p<0.05),显着降低LDH漏出率(与模型组比,p<0.01,p<0.05),降低MDA含量(与模型组比,p<0.05),提高SOD活性(与模型组比,p<0.05)。400mg/kg剂量组含药血清可以显着降低损伤细胞LDH漏出率(与模型组比,p<0.05)。(3)不含朱砂雄黄的安宫牛黄丸640mg/kg剂量组含药血清可以显着提高损伤细胞的活性(与模型组比,p<0.05)、降低LDH漏出率(与模型组比,p<0.01),降低MDA含量(与模型组比,p<0.05),提高SOD活性(与模型组比,p<0.05)。不含朱砂雄黄的安宫牛黄丸640mg/kg剂量组20%添加比例的含药脑脊液可以降低损伤细胞的MDA含量(与模型组比,p<0.05),提高损伤细胞的SOD活性(与模型组比,p<0.05)。不含朱砂雄黄的安宫牛黄丸640mg/kg剂量组10%添加比例的含药脑脊液可提高损伤细胞的SOD活性(与模型组比,p<0.05),降低MDA含量作用不显着。结论:(1)安宫牛黄丸大剂量组含药血清、含药脑脊液可对抗缺糖缺氧损伤引起的细胞活性降低,两个剂量组含药血清含药脑脊液均可降低LDH漏出率。不含朱砂雄黄的安宫牛黄丸含药血清、含药脑脊液降低缺糖缺氧LDH漏出率作用有所减弱,小剂量含药血清含药脑脊液不能显着降低LDH漏出率。两种药物相应剂量含药血清、含药脑脊液组间比较无统计学意义。(2)安宫牛黄丸含药血清、含药脑脊液对谷氨酸诱导的神经元损伤有对抗作用。提高损伤细胞活性、降低损伤细胞LDH漏出率、降低MDA含量、提高SOD活性是其对抗谷氨酸诱导损伤的可能机制。不含朱砂雄黄的安宫牛黄丸含药血清、含药脑脊液提高损伤细胞活性、降低损伤细胞LDH漏出率、降低MDA含量的作用均有所减弱。两个剂量的含药脑脊液对损伤引起的细胞活性降低均无明显对抗作用,与模型组相比无统计学意义。小剂量含药血清、大剂量10%添加比例的脑脊液不能显着降低损伤细胞LDH漏出率,大剂量10%添加比例的脑脊液不能显着降低损伤细胞MDA含量,全方相应剂量的血清或脑脊液在相应指标上有显着改善作用。但两种药物相应剂量含药血清、含药脑脊液组间并无明显差异。5含与不含朱砂雄黄的安宫牛黄丸对谷氨酸损伤神经元线粒体膜电位、细胞内钙离子浓度的影响目的:观察安宫牛黄丸含药血清、含药脑脊液对损伤神经细胞的线粒体膜电位、细胞内钙离子浓度的影响。同时观察不含朱砂雄黄的安宫牛黄丸含药血清、含药脑脊液的作用,与之进行比较。方法:采用谷氨酸诱导损伤细胞模型,应用流式细胞技术测定线粒体膜电位和细胞内钙离子浓度,进行组间比较。结果:(1)细胞损伤后,线粒体膜电位下降,细胞内钙离子浓度增加。(2)安宫牛黄丸含药血清、含药脑脊液可显着改善线粒体膜电位的下降(与模型组比,p<0.01),安宫牛黄丸含药脑脊液、含药血清能对抗损伤造成的细胞内钙离子浓度升高(与模型组比,p<0.01, p<0.05)。(3)不含朱砂雄黄的安宫牛黄丸含药血清、含药脑脊液可显着改善线粒体膜电位的下降(与模型组比,p<0.01),不含朱砂雄黄的安宫牛黄丸含药脑脊液降低细胞内钙离子浓度的作用显着弱于安宫牛黄丸含药脑脊液(与全方组比,p<0.05)。含药血清对谷氨酸损伤引起的钙超载无明显对抗作用。结论:安宫牛黄丸可以升高损伤细胞的线粒体膜电位,降低损伤细胞内钙离子浓度;不含朱砂雄黄的安宫牛黄丸对损伤引起的膜电位降低有明显改善,不含朱砂雄黄的安宫牛黄丸含药脑脊液对细胞内钙超载的对抗作用较全方含药脑脊液明显减弱,朱砂雄黄可能与安宫牛黄丸抑制钙超载作用有关。6含与不含朱砂雄黄的安宫牛黄丸含药血清、含药脑脊液中砷、汞含量的测定目的:观察组方中朱砂、雄黄所含的砷、汞是否能够被吸收入血或穿透血脑屏障进入脑脊液,从而探讨安宫牛黄丸的脑保护作用与朱砂、雄黄之间是否有一定的关联。方法:采用电感耦合等离子质谱法测定安宫牛黄含药血清、含药脑脊液中砷、汞的含量。结果:(1)正常对照组大鼠和不含朱砂雄黄的安宫牛黄丸组大鼠血清、脑脊液中也可检测到微量的砷。正常对照组大鼠血清中砷含量为36.83ng/ml,脑脊液中砷含量为12.92 ng/ml,血中砷含量为脑脊液中砷含量的2.85倍。(2)不含朱砂雄黄的安宫牛黄丸组大鼠血清中砷含量40.12 ng/ml,脑脊液中砷含量16.34 ng/ml,血中砷含量为脑脊液中砷含量的2.45倍。(3)安宫牛黄丸组大鼠血清中砷含量为228.18 ng/ml,脑脊液中砷含量为43.37 ng/ml,血中砷含量为脑脊液中砷含量的5.26倍。(4)汞的含量在仪器检出限附近,未能精确测定,故论文暂不讨论,需采用更精确的测定方法来进行定量分析。结论:安宫牛黄丸含药血清、含药脑脊液中有砷、汞的存在,含与不含朱砂雄黄的安宫牛黄丸对损伤神经细胞的保护作用的差异与朱砂雄黄可能相关。结语:1.安宫牛黄丸对胶原酶诱导的脑出血损伤有明显保护作用,可以降低损伤动物神经症状评分,降低脑指数、提高红细胞变形性、降低脑组织MDA含量,LDH活性、提高SOD酶活性,改善损伤脑组织病理形态。2.安宫牛黄丸通过减少MMP9、AQP4的表达改善血脑屏障通透性,减轻脑损伤;通过影响Bax、Bcl-2的表达、以及促进MAPK通路中ERKmRNA,抑制P38mRNA、c-fos、c-jun表达发挥抗凋亡的作用,起到神经保护作用。3.安宫牛黄丸含药血清、含药脑脊液对缺糖缺氧诱导的原代皮层神经细胞损伤有一定的对抗,可以降低损伤细胞的LDH漏出率,提高细胞活性。对谷氨酸诱导的原代皮层神经细胞损伤有一定的对抗,可以降低LDH漏出率,提高细胞活性,通过降低MDA含量、升高SOD活性、提高线粒体膜电位、减轻钙超载保护损伤的神经元。4.去朱砂雄黄后对脑出血损伤仍表现一定的保护作用,简方减少c-fos、c-jun、P38mRNA表达的作用显着弱于全方,两者相应剂量组进行组间比较,有显着性差异。在其他指标上改善作用较全方有所减弱。但两种药物相应剂量组之间比较无统计学差异。简方含药血清、含药脑脊液对缺糖缺氧损伤、谷氨酸损伤原代皮层神经元表现出一定的保护作用,简方含药脑脊液对钙超载的抑制作用较全方含药脑脊液明显减弱,二者进行组间比较,差异有统计学意义。在其他指标上,改善作用较全方含药血清、含药脑脊液有所减弱。但两种药物相应剂量组之间比较无统计学差异。创新点:1.从整体药效学、血清药理学、脑脊液药理学叁个层面研究和分析含与不含朱砂雄黄的安宫牛黄丸对脑出血大鼠损伤的保护作用及差异,明确朱砂雄黄在全方中存在的意义。2.通过含与不含朱砂雄黄的安宫牛黄丸对大鼠脑出血损伤保护作用机制的探讨,明确朱砂、雄黄可能与安宫牛黄丸抗凋亡、抑制钙超载作用有关。3.首次报道含与不含朱砂雄黄的安宫牛黄丸对于MAPK信号转导通路的影响。
赵航[4]2018年在《实验性小鼠脑梗死后血管再生检测方法的建立及不同时间和区域血管再生的特点研究》文中研究指明脑梗死又称缺血性脑卒中,世界卫生组织将“缺血性卒中”定义为一种临床综合征,其特征是由于脑血管发生血流较少或缺血,局灶性脑组织缺血、缺氧持续一定时间会导致局部神经元死亡和继发性脑损伤。大脑血管血流中断后会导致局部脑组织的氧气和葡萄糖摄入减少,从而增加患者的残疾率和病死率。众所周知,缺血性卒中具有高发病率、高复发率、高死亡率以及高致残率,给社会和家庭都带来的沉重的负担。缺血性卒中的危险因素包括年龄、吸烟、糖尿病、高血压以及肥胖等,如心脏瓣膜病以及心房颤动这些容易导致栓塞的疾病同样会增加患病的危险。随着生活方式的改变,人口的老龄化,包括缺血性卒中的脑血管疾病的发病率有逐年增高的趋势,且已成为我国居民死亡最主要的原因,所以对缺血性卒中的防治刻不容缓。尽管最近的研究取得了一些进展,但在全球范围内缺血性卒中仍然是一个棘手的问题。目前的一些研究表明,中枢神经系统的自我修复能力是非常有限的。但是缺血性卒中发病后,机体的自我修复能力主要通过神经再生,神经可塑性以及血管再生从而达到神经修复的最终目的。越来越多的研究证明,血管再生对于神经修复所产生的作用较为重要。但是非常遗憾的是,目前并没有特别有效的方法能够清楚的观察到这些新生的血管的具体变化以及走向。目前已经有多种方法通过标记组织切片中梗塞周围组织的结构变化从而来量化血管密度。随着共聚焦多标记技术的发展,有许多检测和量化动物模型和人的血管变化的方法已被广泛应用。这其中就包括血管相关抗原的免疫组织化学方法(包括血小板内皮细胞粘附分子(PECAM-1),其也被称为分化簇31(CD31))、von Willebrand因子对内皮细胞的作用、基底层中的胶原蛋白IV、层粘连蛋白以及纤连蛋白等。同样在内皮细胞上存在一些蛋白质抗原,它们可以利用葡萄糖转运蛋白1(GLUT1)和整联蛋白αvβ3来区分微血管的再生。然而,所有这些方法在显微镜下仅显示血管壁的染色情况。由于无法观察到血管腔内的染色情况,所以这些对血管密度进行量化的方法都是不准确的。此外,多聚甲醛固定的脑组织中的大多数血管对这些抗原的染色性很差。在活体转基因动物中,大脑的毛细血管网络可被荧光蛋白标记,使其可用于长期观察微血管在特定位置的结构以及血液动力学变化。然而,长期研究活体血管结构变化通常依赖于双光子激光扫描显微镜和基因工程的新技术,由于昂贵的成本使其不适用于大多数实验室。明胶-墨汁灌注是检测微血管的一种方法。明胶可以在高于40℃的温度下溶于水中,然后在低于30℃的温度下凝结。明胶-墨汁灌注使外周视网膜血管腔完全充盈,血管连续性令人满意。之前有研究通过使用明胶-墨汁的方法来观察大鼠视网膜微血管,由明胶-墨汁标记的视网膜微血管数量多于vWf免疫染色。此外,明胶-墨汁灌注不会对同一组织中神经元或神经胶质细胞的免疫染色造成污染。除了墨汁灌注之外,明胶还可以与不同的荧光物质共存从而与脑中的其他抗原进行共染色。本研究采用健康成年雄性C57BL/6小鼠为研究对象,建立电凝法远端大脑中动脉闭塞(distal middle cerebral artery occlusion,dMCAO)模型。在此研究中,我们通过明胶-墨汁灌注的方法来测试标记是否是量化半胱氨酸和梗塞中心血管生成的替代方法。我们还观察了这种标记技术是否可以用来检测在发生缺血性卒中后同一脑片中形成软脑膜吻合。并通过使用Image J分析软件,从而提供了详细的血管生成的量化结果。本研究分为叁部分,各部分内容概述如下。第一部分通过行为学以及血流动力学的方法对实验性脑梗死小鼠进行观察目的:通过使用行为学以及血流动力学的方法来观察实验性脑梗死小鼠的神经功能缺损以及脑梗死体积从而从直观方面来验证dMCAO模型的有效性,并为接下来明胶-墨汁染色的测定提供有效的证据。方法:采用健康成年雄性C57BL/6小鼠为研究对象,体重20-25 g,8-12周龄,通过电凝法建立dMCAO模型。实验一:将C57BL/6小鼠随机分为以下各组:假手术组(Sham):动物接受假手术但并不闭塞大脑中动脉;术后3天组(3 d):动物接受dMCAO后3天;术后7天组(7 d):动物接受dMCAO后7天;术后14天组(14 d):动物接受dMCAO后14天。对采用健康成年雄性C57BL/6小鼠建立dMCAO模型,并对术前以及术后3天、7天、14天的小鼠进行Rota-Rod以及mNSS神经功能评分。实验二:将C57BL/6小鼠随机分为以下各组:假手术组(Sham):动物接受假手术但并不闭塞大脑中动脉;Vehicle组(Vehicle):动物接受dMCAO;术后3天组(3 d):动物接受d MCAO后3天;术后7天组(7 d):动物接受dMCAO后7天;术后14天组(14 d):动物接受dMCAO后14天。每一组使用TTC(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride)染色法来测定脑梗死体积。实验叁:将C57BL/6小鼠随机分为以下各组:假手术组(Sham):动物接受假手术但并不闭塞大脑中动脉;Vehicle组(Vehicle):动物接受dMCAO;术后3天组(3 d):动物接受dMCAO后3天;术后7天组(7d):动物接受dMCAO后7天;术后14天组(14 d):动物接受dMCAO后14天。每一组使用激光散斑成像仪监测脑血流量(cerebral blood flow,CBF)。结果:1.Rota-Rod实验结果:与没有进行大脑中动脉闭塞的Sham组相比,进行大脑中动脉闭塞后3 d组、7 d组和14 d组的神经功能出现了明显的下降(P<0.05)。而14 d组与3 d组相比,神经功能有了明显的好转(P<0.05)。mNSS结果显示:与没有进行大脑中动脉闭塞的Sham组相比,进行大脑中动脉闭塞后3 d组、7 d组和14 d组的神经缺陷评分出现了明显的上升(P<0.05)。而14d组与3d组相比,神经缺陷评分则有了显着改善(P<0.05)。2.TTC染色结果显示:与没有进行大脑中动脉闭塞的Sham组相比,进行大脑中动脉闭塞后即刻、3 d组、7 d组以及14 d组的小鼠的脑梗塞体积显着增加(P<0.05)。3.激光散斑成像CBF测量结果显示:与没有进行大脑中动脉闭塞的Sham组相比,进行大脑中动脉闭塞后即刻、3 d组、7 d组以及14 d组的小鼠的脑血流量明显减少(P<0.05)。第二部分通过灌注不同浓度的明胶-墨汁来确定最佳浓度,并对健康小鼠大脑半球不同区域的微血管进行观察目的:通过对健康小鼠灌注不同浓度的明胶-墨汁来检测在何种浓度下灌注的微血管最为清晰,并且观察哪个部位的微血管最适合接下来的观察。方法:采用健康成年雄性C57BL/6小鼠为研究对象,体重20-25 g,8-12周龄。实验一:将C57BL/6小鼠随机分为两组:20%组:给小鼠灌注20%的明胶-墨汁;3%组:给小鼠灌注3%的明胶-墨汁。取材后对两组大脑的微血管进行比较从而观察应用何种浓度的明胶-墨汁进行灌注可以呈现出更清晰的微血管。实验二:应用3%的明胶-墨汁对小鼠进行灌注,观察各个区域的微血管的密度以及填充情况。结果:1.对小鼠进行20%明胶-墨汁灌注后,我们观察到在Willis环、基底动脉以及大脑前后动脉上表现出令人满意的充盈以及皮层动脉血管的连续性。由软脑膜血管提供的潜在的二级侧支途径也在低背景下实现了良好的填充。然而,由于20%明胶-墨汁的高粘度,与使用3%明胶-墨汁灌注相比,在微毛细血管中观察到较少的填充效果。2.对小鼠进行3%明胶-墨汁灌注后,我们对大脑前动脉(ACA)、大脑中动脉(MCA)、大脑后动脉(PCA)、纹状体以及海马附近的微血管进行观察到在MCA附近的区域,这些穿支血管和毛细血管的数量最多,充盈性也表现的最好。与MCA相比,剩下四个区域的血管密度明显减少(P<0.05)。海马区附近的微血管与纹状体区域以及大脑前动脉区域附近的血管密度相比也有明显的减少(P<0.05)。第叁部分通过不同的方法对不同时间段的实验性脑梗死小鼠的血管再生进行观察目的:通过明胶-墨汁灌注以及与HE染色共染的方法对不同时间段、不同区域的实验性脑梗死小鼠的血管再生进行观察。方法:采用健康成年雄性C57BL/6小鼠为研究对象。实验一:应用3%的明胶-墨汁灌注脑梗死后3天的小鼠,取材后在显微镜下观察梗死灶、梗死灶对侧、梗死灶上,梗死灶上对侧、梗死灶下、梗死灶下对侧、基底节区以及基底节区对侧的血管密度,并对其进行统计学分析。实验二:应用3%的明胶-墨汁灌注脑梗死后7天小鼠,取材后在显微镜下观察梗死灶、梗死灶对侧、梗死灶上,梗死灶上对侧、梗死灶下、梗死灶下对侧、基底节区以及基底节区对侧的血管密度,并对其进行统计学分析。实验叁:应用3%的明胶-墨汁灌注脑梗死后14天小鼠,取材后在显微镜下观察梗死灶、梗死灶对侧、梗死灶上,梗死灶上对侧、梗死灶下、梗死灶下对侧、基底节区以及基底节区对侧的血管密度,并对其进行统计学分析。实验四:将C57BL/6小鼠随机分为两组:假手术组(Sham):动物接受假手术但并不闭塞大脑中动脉,并用HE染色和明胶-墨汁灌注双重标记来观察细胞和毛细血管的轮廓;术后14天组(14 d):动物接受dMCAO后14天,并用HE染色和明胶-墨汁灌注双重标记来观察细胞和毛细血管的轮廓。结果:1.实验一的结果显示:通过3%的明胶-墨汁灌注我们观察到梗死灶中心以及缺血半暗带的毛细血管的数量明显减少,而梗死灶中心几乎见不到完整的充盈的毛细血管。与此相比,梗死灶对侧的毛细血管则表现为充盈良好且并无明显减少。根据对不同区域的毛细血管密度进行统计学分析可见,梗死灶内的血管密度与梗死灶对侧、梗死灶上、梗死灶下、基底节区相比有了显着的下降(P<0.05)。而梗死灶上与梗死灶上对侧、梗死灶下与梗死灶下对侧、基底节区与基底节区对侧的血管密度相比也有明显下降(P<0.05)。2.实验二的结果显示:通过使用3%的明胶-墨汁灌注对不同区域的毛细血管密度进行统计学分析可见,梗死灶内的血管密度与梗死灶对侧、梗死灶上、梗死灶下、基底节区相比有了显着的下降(P<0.05)。而梗死灶上与梗死灶上对侧也有明显下降(P<0.05)。而梗死灶下与梗死灶下对侧、基底节区与基底节区对侧的血管密度相比则无明显差异(P>0.05)。3.实验叁的结果显示:通过3%的明胶-墨汁灌注我们观察到在术后第14天,梗死灶中心与缺血半暗带中的血管密度明显增加。新生的穿支血管和毛细血管在梗死灶中心中异常增长,其表现为异常的曲折与充盈。根据对不同区域的毛细血管密度进行统计学分析可见,梗死灶内的血管密度与梗死灶对侧、梗死灶上、梗死灶下、基底节区相比有了显着的增加(P<0.05)。而梗死灶上与梗死灶上对侧、梗死灶下与梗死灶下对侧、基底节区与基底节区对侧的血管密度相比则无明显差异(P>0.05)。4.实验四的结果显示:我们发现,缺血性卒中的恢复期,梗死灶中心内HE标记的细胞核数目明显增多,同时源于软脑膜吻合的新生血管也明显增多。与此同时,梗死灶中心的坏死斑块出现退化,其表现为嗜酸性染色,同时核成分也渐渐消失。总之,我们在这些使用明胶-墨汁灌注切片中观察到,在缺血性卒中恢复期梗死灶中心区域发生了叁个主要变化,即:胶质细胞增殖加快;继发性软脑膜侧支血管生成增强;胶质细胞变性坏死并形成斑块。结论:1.本实验通过电凝法成功建立实验性小鼠右侧dMCAO模型,发现缺血性卒中急性期的实验性小鼠神经功能出现了严重的缺损,脑血流量出现了明显的减少。而处于恢复期的实验性小鼠的神经功能出现了明显的好转,脑梗死体积也出现了明显的下降,而脑血流量也出现了明显的回升。2.本实验通过使用不同浓度的明胶-墨汁对实验性小鼠进行灌注,并且首次使用3%的明胶-墨汁进行灌注,从而解决了一直以来无法清楚的观察到缺血性卒中后微毛细血管到底是如何再生的这个关键问题,也为今后微血管的灌注与观察提供了一个新的方法。3.本实验通过应用3%的明胶-墨汁对脑梗死后3、7、14天的小鼠进行灌注发现,在缺血性卒中急性期,梗死灶中心区域的穿支血管和微毛细血管出现碎裂和硬化。在缺血性卒中恢复期,脑皮质支呈现出大量曲折、肿胀的软脑膜血管增生,它们可以跨越梗死灶中心的皮质表面。与此同时,通过应用3%的明胶-墨汁和HE染色进行共染,从而发现在缺血性卒中恢复期会发生胶质细胞增殖加快;继发性软脑膜侧支血管生成增强;胶质细胞变性坏死并形成斑块的现象。
刘华[5]2004年在《灯盏细辛对脑缺血再灌注后基质金属蛋白酶-9及脑代谢物质的影响》文中研究指明目的：通过对大鼠脑缺血再灌后脑含水量、血脑屏障通透性、基质金属蛋白酶-9表达、脑代谢物质及脑梗塞比的检测，探讨基质金属蛋白酶-9在脑缺血再灌注损伤中的作用及灯盏细辛的作用机制。方法：实验大鼠共165只。130只大鼠随机分为叁组：假手术组、模型组和治疗组。按照Zea Longa的线栓造模方法，并进行部分简化制作脑缺血／再灌注模型，假手术组线栓插入深度为1cm。假手术组(n=10)大鼠不做任何处理，术后1 d处死取材，5只测定脑含水量、血脑屏障通透性，5只检测基质金属蛋白酶-9的表达；治疗组60只大鼠造模后腹腔注射灯盏细辛，模型组60只大鼠造模后给予等量的生理盐水。麻醉苏醒后按Zea Longa方法进行神经功能缺损评分，取评分在1-3分的动物。治疗组和模型组在缺血1.5 h再灌后6 h、12 h、1 d、2 d、4 d、7d处死取材，两组每时间点各取5只测定脑含水量、血脑屏障通透性，5只检测基质金属蛋白酶．9的表达。另外的35只大鼠随机分为假手术组(n=5)、模型组(n=15)和治疗组(n=15)。造模方法、处理方式、评分同前。假手术组造模后立即进行T_2加权像、脑代谢物质的检测，1 d时处死取材测定脑梗塞比；治疗组和模型组在缺血1.5h再灌后1 d、2 d、4 d进行T_2加权像、脑代谢物质检测后处死取材，测定脑梗塞比。结果：模型组再灌后6 h脑含水量和脑系数增加，4 d达到高峰。血脑屏障通透性再灌后6 h增加，2 d达到高峰。基质金属蛋白酶-9在假手术组和未缺血侧半球未见表达；缺血侧半球可见阳性表达，6 h表达增加，2 d达到高峰。治疗组脑含水量和脑系数比模型组同时间点下降，与假手术组比较，在1 d后有显着性差异；血脑屏障通透性比模型组同时间点降低，与假手术组比较，6 h-12 h差异有显着性。治疗组的基质金属蛋白酶-9与模型组同时间点比较在1 d开始减少。活体检测模型组鼠脑T_2加权像，再灌1 d后损伤区出现高信号强度区；处死动物进行TTC染色，可见与T_2像高信号区相对的白色梗死区；比治疗组同时间点梗死比大。模型组脑代谢物质检测显示，再灌后1 d与假手术组相比，NAA／Cr比值减低，Cho／Cr比值增大；与治疗组同时间点相比，NAA／Cr减少、Cho／Cr增大。结论：脑缺血再灌注后脑含水量增多，血脑屏障通透性增加，基质金属蛋白酶-9的表达增加。灯盏细辛可能在减轻血管源性脑水肿，稳定BBB通透性方面起作用；同时它能减轻脑梗塞，影响脑物质代谢，减轻脑缺血再灌注损伤。
余广兰[6]2016年在《脑苷肌肽对大鼠脑出血后TNF-α，MMP-9，TIMP-1干预的实验性研究》文中指出目的:经过大鼠尾状核脑出血模型的建立,同时给予脑苷肌肽干预,观察脑苷肌肽对脑出血继发性脑损伤中炎性因子(TNF-α)、脑水肿相关因子(MMP-9、TIMP-1)的影响,探讨脑苷肌肽对脑出血后继发性脑损伤中炎症反应、脑水肿的影响及其保护作用。方法:1.采用立体定位技术,将50ul大鼠自体鼠尾不凝血注射入大鼠脑尾状核,建立大鼠脑出血模型。2.80只SD大鼠被随机分为四组:对照组、ICH组、小剂量治疗组、大剂量治疗组;对照组5只,ICH组及大、小剂量治疗组每组各25只;每组采取5个时间点观察:术后6h、24h、48h、72h和5d,每个时间点选用5只大鼠。3.给药方式:向大鼠腹腔内注射脑苷肌肽,小剂量治疗组按3.15ml/Kg给药,大剂量治疗组按5.25ml/Kg给药,首次给药时间为术后2小时,之后每24小时1次,首次给药量加倍。对照组及ICH组同一时间点给予同等剂量生理盐水。4.术后2h对脑出血模型进行评价,确定模型是否成功,在拟定的各个时间点对成功模型进行神经功能障碍评分。5.运用免疫组化、图像分析技术来观察并量化TNF-α,MMP9,TIMP-1在各个时间点的变化情况。6.HE染色观察脑组织血肿周围神经细胞,炎性细胞及脑组织变化情况。结果:1.神经功能障碍:对照组无明显神经功能障碍(P>0.05),ICH组及治疗组与对照组相比,手术后2h时间点有明显神经功能障碍(P<0.05);大小剂量治疗组和ich组相比,手术后2h及6h时间点神经功能障碍无明显差异(p>0.05),但二者神经功能障碍在24h、48h、72h以及5d时间点相比有明显差异(p<0.05);大剂量与小剂量治疗组相比,神经功能障碍在24h、48h、72h以及5d时间点有明显差异(p<0.05),在6h时间点神经功能障碍无明显差异(p>0.05)。2.脑组织含水量:对照组脑组织含水量在各个时间点无明显差异(p>0.05);ich组脑组织含水量在术后6h、24h、5d与72小时时间点比较有明显差异(p>0.05);ich组和治疗组与对照组相比,脑组织含水量在各个时间点均有增加(p<0.05);治疗组与ich组相比,在24h、48h、72h及5d脑组织含水量有明显减少(p<0.05);大剂量与小剂量治疗组相比,在24h、48h、72h及5d脑组织含水量有明显减少(p<0.05)。3.tnf-α表达数量:对照组tnf-α的数量有少量表达;ich组tnf-α表达的数量在6h、24h、48h、5d与72h比较有统计学差异(p<0.05);ich、治疗组与对照组相比,tnf-α表数量在各个观察点有所增加(p<0.05);治疗组与ich组各个观察点相比,tnf-α表达数量有所减少(p<0.05);大剂量与小剂量治疗组相比,各个观察点tnf-α表达数量有所减少(p<0.05)。4.mmp-9表达数量:ich组及治疗组与对照组相比,mmp-9表达数量在各个观察点有明显差异(p<0.05);ich组mmp-9阳性表达数在6h、24h、72h、5d与48h相比,具有明显差异(p<0.05);大小剂量治疗组与ich组相比,mmp-9表达数量在各个观察点均有减少(p<0.05);大剂量与小剂量治疗组相比,mmp-9表达数量在各个观察点均减少(p<0.05)。5.timp-1表达数量:ich组与对照组相比,timp-1表达数量在各个观察点具有明显差异(p<0.05);ich组timp-1表达数量在6h、24h、48h、5d与72h相比,具有明显差异(p<0.05);大小剂量治疗组与ICH组相比,TIMP-1表达数量在各个观察点有所增加(P<0.05);大剂量与小剂量治疗组相比,TIMP-1表达数量在各个观察点有所增加(P<0.05);6.HE染色:ICH组在术后各个观察点,可以看到血肿周围组织充血水肿明显,其中大量白细胞浸润,神经元变性坏死;随着术后时间点的延长,血肿周围组织中的胶质细胞显着增多,脑水肿在3d后开始减轻。治疗组与ICH组相比,细胞及组织充血水肿相对较轻,炎症细胞的浸润明显减少。大剂量与小剂量治疗组相比,脑水肿减轻更为明显。结论:1.采用自体不凝血注入法制作大鼠模型方法简单,易操作。该脑出血模型与人体脑出血的病理生理变化较接近,为一种比较理想的研究脑出血的动物模型。2.脑出血血肿周围组织中TNF-α、MMP-9明显增多,可能参与脑出血后脑水肿、炎症损伤。3.脑出血后血肿周围组织TIMP-1明显升高,可能对脑出血后脑水肿及炎症反应有保护作用。4.脑苷肌肽可能通过减少TNF-α、MMP-9表达以及白细胞浸润;增加TIMP-1的表达,从而对脑出血后脑水肿及炎症反应有保护作用。
蒋晓帆[7]2002年在《基质金属蛋白酶在局灶性缺血及再灌注后的表达、调节及意义》文中指出金属基质蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)是一组锌依赖的蛋白水解酶，具有降解多种细胞外基质成分，如胶原、层粘素、明胶、弹性硬蛋白、粘连蛋白及蛋白多糖等功能。通常情况下，MMPs受多层次的调控并以酶原的形式存在，激活过程受丝氨酸蛋白酶或纤维蛋白酶的介导，也可以自主催化激活，此外还受其特异性组织抑制剂(TIMPs)的调节。近年的研究表明，MMPs参与了缺血后脑损伤的病理过程。临床上已有报道MMP-2及MMP-9的活性在脑中风发作后明显升高。动物实验也显示局部脑缺血后MMP-9在早期就被激活，抑制MMP-9的活性可以减小脑梗塞面积。所有这些表明，MMP-9参与了缺血后脑损伤的病理过程；同时提示MMP-9可能是一个潜在的治疗靶点。为了探讨MMPs在缺血性脑损伤过程中的意义，我们从下列四方面进行了初步研究：1．利用显微手术技术和多功能生理监测手段建立稳定的小鼠局灶性线栓脑缺血及再灌注模型；2．在小鼠局灶性永久脑缺血模型上检测MMPs的表达，并检测 虏 口 旱 匡 大 纱 博 士 学 戍 论 文 一 MMPS抑制剂KB－R7785对永久性脑缺血的保护作用；3．利用RT－PCR、 NOrthern七＊ 和酶谱分析技术检测 MMPs及其组织型抑制剂（TIMP）在 局灶性脑缺血再灌注后的表达，同时检测分裂原激活蛋白激酶抑制剂 U－of 26对 MMPs及其组织型抑制剂（TIMP）在脑缺血再灌注后表达的影 响：4．分别或同时利用EVallS bltts外渗法和TTC染色法检测U－0126和 KB－R7785对缺血再灌注后脑梗塞灶和脑水肿形成的影响。本实验研究将 进一步阐明MMPS在缺血性脑损伤中的致病机制，为针对MMPS的脑保 护药物的开发提供一定的理论依据。 H 小鼠局灶性线栓脑缺血及再灌注模型的建立。本实验利用显微手术 技术和多功能生理监测手段，显微镜下游离人侧颈总、颈外及颈内动脉， 用5－0丝线分别结扎颈总动脉近端及颈外动脉；经颈总动脉插入8－0尼龙 纤维线段（门mm），将其头端送至左侧大脑中动脉起始部。通过激光多谱 勒流量仪监测人脑中动脉血流量，当其突然降至栓塞前血流量的25％以 下，即标志着闭塞大脑中动脉（MCAO）成功；而暂时性脑缺血及再灌注模 型则经颈外动脉将8＊0尼龙纤维线段头端送至左侧大脑中动脉起始部，Zh 后抽出线段，恢复血供，其再灌注率达到栓塞前血流量的95％以上，即 标志着再灌注成功。术后24h的脑切片经hC染色计算梗塞灶的大小。 通过反复实践和摸索，我们认为如下几方面是决定模型可靠性和稳定性的 关键：1．线段的制备和选择。首先线段的制备要求硅胶树脂涂层要均匀 一致。头端要圆钝，避免形成锐尖或弯钩，以防止穿破血管的危险；另外， 山于动物血管的个体差异与动物的体重呈正相关，因此在模型制作中一方 面要求个体体重要尽量一致；另一方面还需要根据体重的大小选择不同粗 细的线段。2．动物种系的选择。不同种系的小鼠由于颅底WillS环发育 的差异，使得不同模型的要求具有相对的种系选择性。在本实验中我们分 别用不同种系的小鼠（ICR和 DDY）进厅了模型的对比和筛选，发现在 －4－ 第 囚 旱 医 大 学 浴 士 学 位 论 文 一 永久性脑缺血模型的制作中，ICR小鼠的成功率和稳定性均高于DDY小 鼠；而后者在暂时性脑缺血及再灌注模型制作中又优于前者。这为我们下 一步实验的动物种系选择提供了依据。3．局部脑血流（dBF）及其他基础 生理参数的实时监测。山于局部脑血流（rCB）及体温、平均动脉压、血糖 等参数都会影响脑缺血及再灌注后的损伤结果，因此，在模型制备过程中 对上述参数的实时监测和调控为个体间和组间的损伤结果评估提供了客 观可比性依拢。总之，我们的实验结果表明，借助于显微技术和多功能生 理监测手段建立起的小鼠局部线栓脑缺血模型重复性好、可比性强，操作 简便易行，避免厂颅，线段可经颈外动脉插入且很容易抽出，附加创伤小， 不仅可以以低廉成本进行大宗实验，而且几乎可以观察到其他在大型动物 模型上所能观测的指标，完全能够满足我们下一步的实验要求。 口 利用小鼠局部永久性线栓脑缺血模型，观察了MMPs抑制剂 KB－R7785对局部永久性脑缺血后脑梗塞形成的影响。通过观察不同时 间、剂量KB－R7785对24 h后脑梗塞灶体积的影响及应用酶谱印迹技术
王蔚[8]2016年在《脑出血急性期中医分阶段治疗方案及蛭龙活血通瘀胶囊的干预作用机制研究》文中认为第一部分：临床观察目的：通过临床观察脑出血急性期应用中医分阶段治疗方案对患者相关指标的影响,研究中医分阶段治疗方案对脑出血急性期治疗的临床疗效,从而制定符合临床实际、规范化且行之有效、易于推广应用的脑出血急性期的临床治疗方案,以期提高该病的临床疗效。方法：采用随机平行对照的临床试验方法,纳入脑出血急性期患者,共60例,随机分为观察组和对照组,每组各30例,其中对照组采用西医常规治疗,包括稳定生命体征、控制血压、血糖、营养神经、改善脑代谢等；观察组在此基础上采用中医分阶段治疗方案,针对急性期不同阶段分别给予中药汤剂辨证施治,中成药、针灸理疗等方法进行治疗,两组均于治疗前及治疗后14d对患者的临床疗效及中医症状分级量表评分、NIHSS评分、Rankin评分、Barthel指数评分讲行检测,并于治疗前、治疗后7d及14天对患者颅内血肿的变化情况以及安全性指标,包括血常规、肝肾功、凝血等进行检测,从而比较两组的临床疗效和对上述指标的影响情况,分析并评价两组的有效性和安全性。结果：1、中医分阶段治疗方案组(观察组)患者的中医症状分级量表评分、NIHSS评分、Rankin评分、Barthel指数评分、颅内血肿体积改善情况均明显优于单纯西医治疗组(对照组),P<0.05；观察组的中医证候疗效、西医临床疗效、颅内血肿疗效均明显高于对照组,P<0.05；2、两种治疗方案对患者的生命体征、肝肾功、血常规、凝血等指标均未造成不良影响,具有较好的安全性。结论：对脑出血急性期患者采用中医分阶段治疗方案较单纯西医治疗能够更加有效的使患者神经功能得到改善,从而提高患者治愈率,并改善生活质量,安全有效,值得推广。第二部分：动物实验目的：探讨蛭龙活血通瘀胶囊对脑出血大鼠脑水肿、血脑屏障功能的影响,并研究该药脑保护的作用机制,为蛭龙活血通瘀胶囊在脑出血急性期的临床运用提供科学的实验依据。方法：取255只雄性、健康的SD大鼠,采用随机分组法分为假手术组、模型组、蛭龙活血通瘀胶囊高、中、低剂量组,各组又根据指标检测的时间不同划分为12h、48h、72h叁个亚组,采用自体血注入法制备脑出血大鼠模型,各药物组于术后分别给予蛭龙活血通瘀胶囊灌胃,每日量分别为0.3g/kg、0.6g/kg和1.2g/kg,而模型组和假手术组则灌胃与药物组同等体积的生理盐水,3ml／次,给药次数及时间同药物组。各组进行相应干预后,在各规定的时间点对大鼠神经行为学评分(NSS)进行测定,取出脑组织,检测大鼠脑含水量及脑系数,HE染色对大鼠脑出血血肿周围组织行病理学观察,采用伊文思蓝法检测血脑屏障的通透性,电子显微镜观察血脑屏障的超微结构,Western-blot法检测与脑水肿相关的蛋白AQP-4、MMP-9及TIMP-1的表达,PT-PCR法检测AQP-4、MMP-9及TIMP-1 mRNA表达。结果：1、脑出血模型大鼠在术后12h可见脑组织水肿,48h及72h脑水肿程度逐渐加重,神经功能缺损情况逐渐明显,NSS评分随之升高,脑含水量及脑系数也逐渐升高,HE染色见脑组织明显水肿,间质疏松,血肿周围结构紊乱。蛭龙活血通瘀胶囊低、中、高剂量组在术后12h、48h及72h,大鼠脑水肿情况均较模型组有所改善,神经功能评分较之下降,脑含水量及脑系数也较之下降(P<0.01),HE染色可见脑组织血肿周围水肿均有不同程度的改善,各药物组之间比较以高剂量组改善最为明显。2、脑出血模型大鼠在术后12h血脑屏障的通透性即可发现有明显改变,脑组织EB含量明显升高,术后48h时升高最为明显,72h时稍有下降。电镜超微结构显示术后48h,整个血管腔形态不规则,基膜厚薄不均,毛细血管周围水肿明显,组织稀疏,电子密度降低,内皮局部膨出,部分与基膜剥离,血脑屏障结构发生破坏。蛭龙活血通瘀胶囊低、中、高剂量组在术后12h、48h及72h,大鼠血脑屏障通透性较模型组均具有不同程度的改善(P<0.01),脑组织EB含量较之有所下降,电镜超微结构观察发现血管周围水肿程度较为轻微,血脑屏障的结构得到明显改善,以高剂量组改善最为明显。3、脑出血模型大鼠在术后12h、48h及72h脑组织中AQP-4、MMP-9、TIMP-1蛋白及基因的表达均有明显上升,其中,AQP-4蛋白及基因表达呈进行性升高,在72h时升高最为明显,MMP-9、TIMP-1蛋白及基因表达也有明显升高,在48h时上升明显并达到高峰,在72h时略有下降。而蛭龙活血通瘀胶囊低、中、高剂量组在术后12h、48h及72h时大鼠脑组织AQP-4、MMP-9蛋白及基因的相对表达量均有不同程度的下降,TIMP-1蛋白及基因的相对表达量有所升高,与模型组比较,差异均具有显着性(P<0.01),不同剂量组间比较,高剂量组最为明显(P<0.01)。结论：1、蛭龙活血通瘀胶囊能够明显改善脑出血大鼠神经功能缺损症状,使神经功能缺损评分有所减轻,并降低脑出血大鼠脑含水量及脑系数,从而使脑组织水肿程度得到明显改善。2、蛭龙活血通瘀胶囊能够明显改善脑出血大鼠血脑屏障的通透性,使脑组织EB含量有所减轻,保护血脑屏障的组织结构避免血脑屏障受到破坏,从而减轻脑组织的水肿程度。3、蛭龙活血通瘀胶囊能够明显降低脑出血大鼠脑组织AQP-4、MMP-9蛋白及基因的表达,同时升高TIMP-1蛋白及基因的表达,从而改善血肿周围脑组织水肿。4、蛭龙活血通瘀胶囊上述药理作用存在一定的量效关系,以高剂量组作用最为明显。
朴圣浩[9]2008年在《电项针对脑出血大鼠脑水肿与细胞凋亡调控因素的影响》文中进行了进一步梳理目的:通过电项针对脑出血大鼠模型影响的实验研究,探讨电项针对脑出血后脑水肿和细胞凋亡调控因素影响的机制。方法:本实验用健康雄性(wistar)大鼠144只,体重250-300克,按随机数字表分为A、B、C叁组,每组又各分为12h、24h、3d、7d四个小组。每小组每时间点各12只动物。动物经10%水合氯醛腹腔麻醉(400mg/kg体重),头顶备皮后将动物固定于叁维立体定位仪上,局部皮肤处理后以前囱为坐标原点,向大鼠尾侧0.2mm,大鼠右侧2.9mm,确定注射点坐标,用牙科钻钻孔约直径1.0mm(在右尾状核位置),A组(对照组)注入2ul0.9%的生理盐水,B组(模型组)C组(电项针组)均用微量注射器吸取含0.5u/ul胶原酶的生理盐水和7u/ul肝素的生理盐水各1.0ul注入,每组于注射完毕退出针后,缝合头皮,并于12h、24h、3d、7d参照Longa FZ五级评分法进行神经功能学评分,评分完毕后,按要求处置,测定脑含水量,及脑组织形态学观察,超微结构改变及免疫组化方法观察AQP-4,MMP-9,Caspase-3和Bcl-2蛋白的表达。结果:1、脑出血后大鼠出现神经功能缺损,3d达高峰,之后有所下降。电项针组与模型组比较差异显着(P＜0.05)。电项针组可以降低神经功能缺损程度。2、脑出血大鼠模型24h后脑含水量明显增高,3d达高峰,电项针组有较明显的抗脑水肿作用,各时间点比较有统计学意义(P＜0.05)。3、HE染色显示:脑出血后24h血肿周围可见白细胞浸润,细胞间隙和血管周围间隙增宽,3d上述病变加重,并见大量神经细胞变性坏死,7d仍有增生的胶质细胞,从病变的程度和范围看,电项针组的病理改变要轻于模型组。4、电镜观察电项针组神经细胞超微结构的变化明显改善;与模型组比较电项针组神经元细胞内,可见高尔基,线粒体和其他细胞器结构完整,突触膜活性区,突触小泡增多。5、AQP-4表达;模型组中3d达高峰,各时点均显着高于对照组;电项针组的表达显着低于模型组(P＜0.01)。6、MMP-9表达;模型组3d达高峰,各时点均显着高于对照组;电项针组的表达显着低于模型组(P＜0.01)。7、Caspase-3表达;模型组24小时达高峰,各时点均显着高于对照组;电项针组的表达显着低于模型组(P＜0.01)。8、Bcl-2表达;模型组24小时达高峰,各时点均高于对照组;电项针组的表达显着高于模型组(P＜0.01)。结论:1、电项针能明显降低脑出血大鼠模型神经功能缺损评分,促进神经功能恢复。2、通过血肿周围脑组织形态学,血脑屏障超微结构,脑组织水肿带超微结构的观察与对比,电项针刺能够有效调整微观组织结构的病理改变程度。3、大鼠脑出血后AQP-4与MMP-9的释放与激活,是脑出血后早中期脑水肿形成的重要因素之一,导致BBB通透性增加而造成脑水含量增加。4、大鼠脑出血后Caspase-3与Bcl-2的释放与激活,是脑出血后脑细胞凋亡相关的重要因素。5、电项针治疗具有抗脑出血后脑水肿的作用及减轻脑细胞凋亡的作用,机制之一是对AQP-4,MMP-9,Caspase-3表达的抑制,Bcl-2表达的增加,使BBB开放程度减小,降低脑组织含水量,减轻脑水肿程度及保护神经细胞。
郑一[10]2004年在《脑络舒通治疗缺血性中风的作用机制研究》文中指出1 目 的 中风病是中老年人的常见病, 多发病, 严重危害人类健康. 本课题的目的是讨论颅脑瘀水毒邪与缺血性中风病发病的关系和脑络舒通治疗缺血性中风的药效学机制. 本课题在中医基础理论的指导下 ,分析了缺血性中风的发病规律, 认为瘀, 水 ,毒邪互结于脑内是中风病急性期的病机重点. 提出活血利水 ,解毒通络治法是缺血后脑水肿治疗的关键. 从脑络舒通对脑组织含水量, 血脑屏障通透性-EP和MMP-9等方面深入探讨脑络舒通的利水作用, 采用血瘀证大鼠凝血指标和临床中风病人血瘀证证侯积分的方法证明脑络舒通的活血功能 .通过观察临床病人血清TNF-α和IL-1的变化来探讨脑络舒通的解毒作用,并从bFGF和nestin 蛋白的表达来讨论脑络舒通对成体神经功能重塑的治疗机制. 2 方 法 2.1 采用光化学诱导大鼠局灶性脑缺血的方法, 设脑络舒通治疗组 ,模型对照组 ,假手术组, 空白组 ,于造模成功后3h始,给予脑络舒通灌胃,连续4d 动态观察体重及神经功能评分的变化,术后第5d 取脑TTC染色后计算梗塞灶体积HE染色后观察病理学改变. 2.2 采用栓线法造成大鼠大脑中动脉缺血3h, 再灌注24h 模型 ,观察各组神经功能评分脑组织含水量 ,用 Evans 蓝测定法观察血脑屏障通透性的改变 ,并采用免疫组织化学方法观察缺血再灌注大鼠大脑-EP表达. 采用RT-PCR方法测定MMP-9mRNA 的表达. 2.3 采用大鼠血瘀模型,观察脑络舒通对血瘀证大鼠凝血,纤溶系统的影响.并在临床观察脑络舒通治疗前后治疗组和对照组病人的血瘀证证侯积分的改变. 2.4 采用放射免疫RIA法观察脑络舒通治疗前后治疗组和对照组病人血清TNF-α 和IL-1 的变化. 2.5 采用免疫组化方法观察光化学诱导的脑缺血大鼠治疗组, 模型组, 假手术组, 空白组脑的第5d 时bFGF的表达和第10d 时nestin 蛋白的表达. 3 结 果 3.1 脑络舒通可以减小光化学诱导的大鼠局灶性脑梗死体积, 治疗组梗死灶体积为7.322.03mm3 明显小于对照组(16.01 2.62mm3)( P<0.001).治疗组大鼠的缺血性病理改变比对照组明显减轻,假手术组和空白组无缺血灶形成. 3.2 MCAO大鼠脑缺血3h再灌注,24h的对照组缺血侧脑组织含水量(79.24 0.61%)和EB含量( 4.78 0.72ug/g) 明显高于空白组(73.43 0.57%)( 2.07 0.15ug/g)治疗组缺血侧脑组织含水量(76.85 0.87%)和EB含量( 3.52 0.63ug/g )明显降低 ,与对照组相比具有显着性差异( P<0.001 )假手术组与空白组则无显着性差异.对照组非缺血侧脑组织含水量(75.590.48%)和EB含量3.24 0.57ug/g 也较空白组增高(P<0.001). MCAO大鼠缺血3h 再灌注24h 时,对照组大鼠缺血灶 -EP 的表达明显升高,以神经胶质细胞表达为主,治疗组大鼠缺血灶 -EP 的表达与对照组相比明显减少.具有显着性差异(P<0.001) 假手术组与空白组相应缺血灶-EP的表达较少,无显着性差异( P>0.05) MCAO大鼠脑缺血3h 再灌注24h时,对照组大鼠(MMP-9mRNA)的表达明显升高,与假<WP=5>手术组和空白组相比具有显着性差异(P<0.001),治疗组大鼠(MMP-9mRNA)的表达较对照组减少(P<0.05).假手术组和空白组大鼠表达较少, 相比较无显着性差异. 3.3 血瘀证大鼠凝血-纤溶指标观察中, 血瘀证大鼠与空白组比较, PT, APTT 明显缩短.(P<0.01 P<0.001) Fig.显着增加(P<0.001), PA 显着增高 (P<0.001).说明血瘀证大鼠存在高凝状态, 治疗组PT, APTT 较对照组延长(P<0.01) Fig 和PA 降低(P<0.001). 3.4 对照组病人血清, TNF- 含量在治疗后 7d 312 041ng/ml 略有下降 与入院时351 045ng/ml 相比无显着性差异(P>0.05) 治疗后 21d血清TNF- 含量 2.810.59ng/ml 与治疗前相比具有显着性差异 (P<0.01) . 治疗组病人血清TNF含量在治疗后7d 2.39 0.33ng/ml 迅速下降 治疗后21d 血清TNF- 含量 1.77 0.48ng/ml 明显下降P<0.001 与对照组相比具有显着性差异(P<0.001) 两组治疗后血清 IL-1 含量较治疗前下降 P<0.05 治疗组下降 0.38 0.16ng/ml 较对照组 0.52 0.12ng/ml 明显 具有显着性差异 P<0.001. 3.4 光化学诱导脑缺血第5d时, 治疗组大鼠缺血边缘区 bFGF 的表达明显增高 ,神经元细胞和神经胶质细胞均有表达 ,与对照组相比具有显着性差异(P<0.001).治疗组海马锥体细胞层中bFGF的表达明显增高, 与对照组相比具有显着性差异(P<0.05) 假手术组与空白组相应缺血边缘区及海马没有bFGF的表达 .各组缺血灶内部 ,皮层与皮层下, 小脑等部位均无bFGF 阳性细胞的表达. 光化学诱导脑缺血第 10d 时, 治疗组大鼠侧脑室室管膜下层和第叁脑室底部 nestin 蛋白的表达明显增高, 与对照组相比具有显着性差异( P<0.001 ),假手术组与空白组侧脑室室管膜下层和第叁脑室底部仅有少量nestin蛋白表达. 治疗组大脑皮质缺血边缘区 nestin 蛋白表达明显增高. 与对照组相比具有显着性差异( P<0.05) 缺血区周围的大脑皮质和皮层下nestin蛋白的表达两组无显着性差异, 假手术组与空白组无阳性细胞表达. 4 结 论 4.1 脑络舒通可减轻MCAO鼠缺血再灌注对血脑屏障的损伤.对血脑屏障通透性具有一定的保护作用, 可抑制脑内 -EP 的合成和释放. 降?
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