吕丽华[1]2004年在《山羊胚胎体外培养体系的优化以及胚胎干细胞分离培养技术的研究》文中研究指明本文研究山羊卵母细胞体外培养、体外受精及胚胎体外培养程序的优化,目的是为建立一套完善的山羊胚胎体外生产体系。从而为该技术走出实验室,在实践中得以应用提供理论依据。同时探讨山羊胚胎干细胞的分离培养技术,为核移植、转基因等胚胎工程后技术的应用奠定基础。试验一研究山羊卵母细胞体外成熟的培养方法,以提高山羊卵母细胞的成熟率。使用微滴法培养,探讨山羊卵母细胞的回收、成熟液的调整对比、添加不同激素、以及不同抗氧化物质等对山羊卵母细胞体外成熟的影响。结果表明,选用胞质均一致密,外围至少有3 层以上卵丘细胞包裹的A 级卵母细胞,添加浓度为1 μg/ml 的E 2、5 μM 的?-ME,成熟培养27h 可显着提高卵母细胞体外培养的成熟率。使用国产绒促激素完全可以代替进口的FSH 和LH 用于山羊卵母细胞体外成熟培养,在相同效果的前提下可大大降低成本。试验二研究山羊体外受精条件的优化,为提高体外成熟卵母细胞的受精质量和数量提供理论基础。比较体外受精方法,不同获能物质的影响表明不同精子获能中,肝素效果比较稳定。Percoll 法处理精子卵裂率要显着高于上浮法,但是囊胚率和囊胚细胞数并没有提高。上浮法的精子镜检活力要好于Percoll 法分离的精子。但是,总体受精率、发育率还很低。试验叁通过优化培养程序,筛选培养液,以建立适合山羊胚胎体外发育的培养体系。通过共培养方法对共培养体系、换液程序、以及不同培养液的研究表明,在山羊胚胎培养中,基础培养液选用配制简单的SOF(CR1 也可使用),添加BSA/FCS,并采用正确换液程序,即48h 前是SOF+BSA,之后换为SOF+FCS 可获得理想的囊胚率和卵裂率。共培养条件下颗粒细胞和输卵管细胞对胚胎的发育并没有明显差异,但就发育率而言,显着优于无共培养体系。由此,说明共培养细胞类型对胚胎发育影响不大,但可以很好地克服胚胎的8~16-细胞阻滞。试验四利用透射电镜研究山羊体内胚和体外胚的超微结构,旨在对体外胚胎质量及其培养体系进行评价,为进一步提高体外胚胎的质量提供超微结构方面的理论依据。结果表明山羊体外胚胎质量要比体内发育胚差,包含有大量脂滴、畸形线粒体以及空泡化严重、细胞间隙连接较少且松散、核质比下降等。试验五以体内受精胚、体外受精胚和孤雌激活胚叁种不同来源的囊胚为材料,分离山
余树民[2]2007年在《小鼠胚胎干细胞建系的研究》文中认为小鼠胚胎干细胞(Embryonic stem cells, ESCs)已在发育生物学、人类疾病和药物开发等研究领域中得到广泛应用,小鼠ESCs建系技术的丰富完善为建立人类和动物ESCs系提供了参照标准和理论依据。目前小鼠ESCs建系主要来自129小鼠,少部分来自C57BL/6J和BALB/c小鼠,除129及杂交小鼠ESCs建系比较容易外,其他品系小鼠ESCs建系比较困难,建系效率很低。昆明(KM)小鼠是国内广泛使用的实验动物,但其ESCs分离建系很困难,大多数情况下只能在体外传几代,却不能充分增殖。所以,仍需要继续研究昆明小鼠ESCs。本研究在优化小鼠胎儿成纤维细胞(Mouse embryonic fibroblast, MEF)饲养层制备条件的基础上,比较不同添加物对昆明小鼠ESCs分离培养的影响;以129♂×KM♀杂交F1代小鼠胚胎为材料,分离培养小鼠ESCs,建立了该杂交小鼠ESCs的分离培养体系,获得了1株传52代的类ESCs,1株传38代的孤雌胚胎来源的类ESCs(pESCs),为更深入研究奠定了基础并准备了材料。本研究获得如下结果:1.MEF饲养层制备条件的优化利用MTT法检测丝裂霉素C(10ug/mL)处理后MEF活力变化情况,比较不同条件下MEF活力稳定维持的时间。结果显示,以5代以内MEF制备饲养层,用丝裂霉素C(10ug/mL)处理2~3h,以1.2~1.6×104/孔的细胞量接种96孔板,用体积分数10%犊牛血清(Neonatal bovine serum, NBS)的培养液培养,MEF活力可稳定维持10~12 d,是制备MEF饲养层的适宜条件。2.昆明小鼠ESCs分离培养影响因素的研究以昆明小鼠胚胎为材料,以丝裂霉素C(10ug/mL)处理的MEF为饲养层,共培养493枚胚胎,获得287个ICM集落(58.2%),将2株ESCs传到7代(0.697%),细胞表现碱性磷酸酶活性,表达Oct-4和Nanog蛋白。①ESCs培养液中添加KSR,胚胎平均贴壁时间为4.58±1.05 d,比添加FBS的平均贴壁时间(3.74±1.10 d)显着延长(P<0.05),胚胎贴壁率显着低于添加FBS(P<0.05),ICM集落形成率二者没有显着差异(P>0.05);1~5代ESCs传代结果显示,KSR比FBS显着有利于维持昆明小鼠ESCs的未分化状态。②在ESCs培养液中添加FBS+ PD98059(50μmol/L),胚胎平均贴壁时间为5.56±1.15 d,胚胎贴壁率、ICM集落形成率显着低于添加KSR或FBS(P<0.05),不能有效维持昆明小鼠ESCs的未分化状态。③昆明小鼠胚胎ICM和ESCs适宜用0.05%胰酶-0.02%EDTA离散消化,并配合机械分割。3.杂交小鼠ESCs的分离与鉴定①以129♂×KM♀杂交F1代小鼠胚胎为材料,以丝裂霉素C(10ug/mL)处理的MEF为饲养层,培养杂交小鼠胚胎135枚,形成ICM集落72个(53.3%),获得7株传9代以上的细胞,其中3株分别传了52代(编号为060728084)、40代(编号为070109137)和11代(070109153),这3株细胞有细胞冻存。对其中编号为060728084的细胞株进行鉴定。结果显示,该细胞株在33代以内75%以上细胞保持核型完整,核型为XY;具有小鼠ESCs特征性的酶活性(AKP和端粒酶)、标志抗原(SSEA-1、SSEA-3、SSEA-4、Oct-4和Nanog)和基因(Oct-4、Nanog和GDF-3)的表达模式,体内外能分化为叁胚层来源的各种类型细胞(免疫组化检测7种标志抗原,RT-PCR检测5个标志基因),除未进行嵌合体鼠实验外,其余均符合小鼠ESCs建系的各项要求。②添加3.75%FBS+ 11.25%KSR、7.5%FBS+ 7.5%KSR和15%FBS的3组培养液,其胚胎贴壁率显着高于添加15%KSR的培养液(P<0.05);添加3.75%FBS+ 11.25%KSR和7.5%FBS+ 7.5%KSR的培养液,更有利于ICM集落形成。③1~5代ESCs传代结果显示,添加15%KSR、1%FBS+ 14%KSR和3.75%FBS+11.25%KSR均能支持ESCs未分化生长;单细胞接种实验显示,添加1%FBS+14%KSR、3.75%FBS+11.25%KSR和7.5%FBS+ 7.5%KSR,其克隆形成率显着高于添加15%KSR和15%FBS。4.杂交小鼠孤雌胚胎来源ESCs的分离与鉴定①以129♂×KM♀杂交F1代小鼠MⅡ期卵母细胞为材料,经过孤雌激活、体外培养获得35枚孤雌囊胚,在MEF饲养层上培养30枚胚胎,形成11个ICM集落(36.7%),离散后接种其中8个,最终获得1株能稳定传代的pESCs,命名为P061221132,目前传到38代,有细胞冻存。对细胞株P061221132进行鉴定。结果显示,该细胞株在23代内70%以上细胞保持核型完整,核型为XX,具有小鼠ESCs特征性的酶活性(AKP和端粒酶)、标志抗原(SSEA-1、SSEA-3、Oct-4和Nanog)和基因(Oct-4、Nanog和GDF-3)的表达模式,体内外能分化为叁胚层来源的各种类型细胞(免疫组化检测5种标志抗原,RT-PCR检测5个标志基因),除未进行嵌合体鼠实验外,其余均符合小鼠ESCs建系的各项要求。②单细胞接种实验显示,在ESCs培养液中分别添加1%FBS+14%KSR、3.75%FBS+11.25%KSR和7.5%KSR+7.5%FBS,克隆形成率为41.7%~45.4%之间,不同代次细胞在不同培养液中的克隆形成率之间没有显着差异(P>0.05),但添加7.5%KSR+ 7.5%FBS,ESCs集落形态不如添加1%FBS+14%KSR、3.75%FBS+ 11.25%KSR典型。
闫龙[3]2008年在《山羊胚胎干细胞的分离与培养》文中提出山羊胚胎干细胞(ESCs)和胚胎生殖细胞(EGCs)是克隆动物、转基因动物、制备生物反应器和组织工程等理想的候选细胞,然而至今没有成功建系的报道。本研究选用关中奶山羊胚胎和胎儿为试验对象,参照小鼠和人ESCs和EGCs建系的方法,系统比较了不同培养条件和传代方法对分离培养山羊ESCs和EGCs的影响,并对得到的细胞进行了一系列的检测和鉴定,主要获得以下结论:1.本试验共超排处理了4只关中奶山羊采胚,共采集胚胎42枚,可用胚39枚,胚胎可用率为92.9%(39/42),其中桑椹胚5枚,囊胚28枚,孵化囊胚6枚,平均每只山羊获得10.05枚胚胎。原代培养时分别采用全胚培养法、酶消化法和免疫外科法处理胚胎,观察不同发育阶段的胚胎在原代培养时使用不同的处理方法对贴壁率和传代培养的影响。发现原代培养时,全胚培养法的贴壁率最高,而囊胚最适合于山羊ESCs的分离培养,最高传至18代。2.试验在传代培养时比较了机械法和酶消化法两种方法对山羊ESCs体外培养的影响,发现早期使用机械法传代有利于ESCs的增殖,而后期使用酶消化法传代有利于抑制ESCs的分化。本试验6代以前使用机械法传代,6代以后采用酶消化法传代,最高将山羊ESCs传至18代。3.试验采用山羊的克隆胚胎和孤雌激活胚胎分离ESCs,发现两种胚胎的贴壁率很低,胚胎细胞增殖较慢,通过比较不同发育阶段胚胎的体外培养结果,发现早期桑椹胚的贴壁率稍高于囊胚,试验将ntESCs和pESCs细胞最高分别传至4代和2代。4.试验对山羊ESCs进行了免疫组织化学染色和RT-PCR检测,表明其表达SSEA-1,SSEA-3,Nanog,Oct4,TERT和CD117。体外诱导分化试验证明山羊ESCs在体外经诱导可分化为心肌细胞,说明所获得的山羊ESCs具有ESCs的特性。5.试验共得到30例山羊胎儿,以胎儿生殖嵴分离培养EGCs。发现以高糖DMEM为培养基,添加15% KSR的无血清培养体系比含15%FBS的培养体系更能维持EGCs的长期传代培养,传代次数较高,但经t检验,二者之间差异不显着(P>0.05)。而传代培养时,机械法最高传至10代,酶消化法最高传至5代,机械法更适合于传代培养,二者差异显着(P<0.05)。6.山羊EGCsAKP染色阳性,Oct4和SSEA-1免疫组化染色阳性,RT-PCR检测显示其表达Nanog,Oct4,TERT基因。体外悬浮培养或延迟传代的山羊EGCs可以自发分化形成类胚体或成纤维样、神经样、脂肪样等细胞类型,表明该细胞具有ESCs的特性。
张玉玲[4]2008年在《人—山羊异质胚胎构建及胚胎干细胞的分离培养》文中提出人胚胎干细胞(hESCs)有分化为机体各种细胞的潜能,是再生医学、药物筛选及发育研究的一个重要来源。hESCs是从人胚胎细胞分离培养而来的,然而,人胚胎来源不足严重限制了hESCs的研究。以动物卵母细胞为受体、人体细胞为供体细胞的异质核移植技术为hESCs的研究提供了新的途径,本文尝试了用山羊卵母细胞为受体、人包皮成纤维细胞(HFFs)为供体构建人-山羊异质核移植(human-goat interspecies nuclear transfer, hgiNT)胚胎,并分离hESCs,旨在优化hgiNT方案,并为建立hESCs系提供技术帮助。研究内容如下:1.为了选择遗传均一的供体细胞用于核移植,本实验分别用条件培养液或用饲养层共培养对HFFs进行克隆分离和扩大培养,对照组在无饲养层的新鲜培养液中培养,Giemsa染色分析克隆细胞核型。结果:共培养组克隆存活率(31.43 %)显着高于对照组(5.56 %)(P<0.05),与条件培养液组相近(27.27 %,P>0.05);饲养层共培养组扩大培养率(11.43 %)显着高于对照组(0 %)(P<0.05)。7个细胞克隆中5个表现为正常核型(2n=44+XY)。结果表明,两种方法均能提高HFFs形成克隆的比例,且能保持细胞染色体核型正常,用于核移植前供体细胞的筛选。2.为了探索hgiNT条件,本实验首先对电融合参数进行了摸索,进而测试了融合与激活间隔时间对重组胚胎体外发育的影响,最后对比了mSOFaa和G1/G2序贯培养法对重组胚胎体外发育的影响。结果最佳的融合电压、脉冲时程和脉冲次数分别为36 V、20μs和2次,最佳的融合与激活间隔时间为4 h,G1/G2序贯培养法的卵裂率和囊胚率均显着高于mSOFaa培养法(71.81 % vs. 64.78 %,9.73 % vs. 4.76 %;P<0.05)。结果表明:hgiNT的电融合参数及融合与激活间隔时间与受体卵母细胞供应方(山羊)体细胞核移植相似,而核移植胚胎的培养条件倾向于供体细胞供应方(人)的胚胎培养条件。3.本研究探讨了TSA对供体细胞或重构胚处理对hgiNT胚胎发育的影响。选择经5、25、50、75、100 nM TSA处理24 h的山羊胎儿成纤维细胞作为供体细胞进行核移植,结果在50、75 nM组,囊胚率有所增高(9.91 %、12.10 % vs. 8.47 %,P>0.05);用5,25,50,75或100 nM TSA处理重构胚10 h,结果5、25、50、75 nM组的囊胚率均有所提高,其中25 nM组显着高于对照组(16.41 % vs. 7.63 %,P<0.05)。TSA处理供体细胞和重构胚均能显着提高克隆胚囊率,说明低甲基化的供体细胞有利于卵母细胞的重编程,推测TSA可能降低了核移植后供体细胞组蛋白去乙酰化水平,因而提高了克隆胚的发育率。4.本实验(1)用10 mg/L的丝裂霉素-C分别处理HFFs、MEFCs和GEFCs饲养层1.5 h、2 h、2.5 h、3 h,冷冻-复苏后培养12 h,统计复苏率,选择合适的处理时间;(2)用HFFs、MEFCs和GEFCs作饲养层,接种ICM,比较它们对hESCs的支持情况;(3)在不同密度的HFFs饲养层上,接种相同的ICM数,统计hESCs的贴壁率、克隆形成率、分化率,从中选择合适的饲养层密度。结果显示:(1)以10 mg/L丝裂霉素-C最佳处理时间为2 h;(2)HFFs和MEFCs饲养层均能有效地支持hESCs增殖和保持未分化状态;(3)HFFs饲养层的最佳密度是3×104/mL。五、为了克服培养体系中异源性成份污染hESCs临床应用的限制,本实验采用无动物源性成份确定的HESCO体系对hgiNT胚胎来源的hESCs(iNT-hESCs)进行体外培养(HESCO组),以HFFs为饲养层的常规培养体系为对照组(HFF组),观察iNT-hESCs在两种培养体系中的生长状况,探讨HESCO体系对iNT-hESCs生长的支持情况。结果,HESCO组的iNT-hESCs有与HFF组相似的细胞形态、增殖速度、碱性磷酸酶活性和遗传稳定性;结果表明HESCO培养体系能支持iNT-hESCs的生长并能保持其未分化状态,这对iNT-hESCs用于临床治疗且有重要意义。
葛秀国[5]2007年在《山羊胚胎干细胞的分离与培养》文中认为山羊胚胎干细胞(ESCs)和胚胎生殖细胞(EGCs)是制备乳腺生物反应器理想的候选细胞,然而至今仍没有成功建系的报道。本研究选用关中奶山羊胚胎和胎儿为试验对象,参照小鼠和人ESCs和EGCs建系的方法,系统比较了不同培养条件和传代方法对分离培养山羊ESCs和EGCs的影响,主要获得以下结论:1本试验共超排处理了46只/次关中奶山羊,共获得胚胎307枚,其中4~16细胞胚胎39枚,桑椹胚128枚,囊胚89枚,孵化胚51枚,平均每只山羊获得6.67枚胚胎。以Knockout DMEM为基础培养液,研究了含血清和无血清条件下山羊ICM的增殖规律。结果表明,含血清培养可以促进ICM的贴壁和增殖,有利于山羊ESCs细胞的体外传代培养,但也促进了细胞发生一定的分化。试验以Knockout DMEM+5%FBS+15%KSR的有血清培养体系,结合添加细胞因子LIF(1000 IU/mL)和bFGF(20 ng/mL),以MEF作饲养层,采用机械分割的传代方法,最高将山羊ESCs传至10代。2试验以Knockout DMEM+5%FBS +15%KSR+0.1mmol/Lβ-Me+0.1mmol/L NEA(非必需氨基酸)+2mmol/L谷氨酰胺+50IU/mL青霉素+50μg/mL链霉素+1000IU/mL LIF为基础培养液,比较了培养方法,饲养层和细胞因子对山羊ICM的贴壁增殖以及ESCs的分离与传代培养的影响,发现微滴培养法较四孔板培养更能促进ICM的贴壁和增殖,原代出现的可传代集落的比率较高;以山羊间充质干细胞作为饲养层细胞,与小鼠胎儿成纤维细胞饲养层相比较,都能维持山羊ESCs传代培养,差异不显着,P>0.05,表明山羊MSCs可以用于山羊ESCs的体外培养;试验发现联合使用LIF和bFGF比单独使用LIF维持山羊ESCs体外生长的时间长(细胞传代数较高),二者差异显着(P<0.05),与同时还添加SCF的处理组差异不显着(P>0.05),表明SCF对山羊ESCs体外培养的作用不明显。3试验发现来源于小鼠ESCs的条件培养基和大鼠NSCs的条件培养基,与Knockout DMEM培养基相比较,都能促进山羊ICM贴壁生长,差异不显着,P>0.05;比较山羊ESCs传代培养的结果表明,两种条件培养基都能促进山羊ESCs的长期传代培养,优于Knockout DMEM培养基,差异显着,P<0.05,本试验中,应用小鼠ESCs条件培养基最高将山羊ESCs传至10代。4试验采用山羊的克隆胚和孤雌激活胚分离ESCs,发现两种胚胎的贴壁率很低,胚胎细胞增殖较慢,通过比较不同发育阶段的胚胎(去透明带)的体外培养结果,发现早期桑椹胚的贴壁率稍高于囊胚,试验将ntESCs和pESCs细胞最高传至2代。5试验共处理山羊胎儿48例,成功分离得到山羊EGCs的有34例。发现以高糖DMEM为培养基,添加15% KSR的无血清培养体系比含血清的培养体系更能维持EGCs的长期传代培养,传代次数较高,但经卡方检验,15%KSR组与15%FBS组之间差异不显着(P=0.0506,P>0.05)。以高糖DMEM+15% KSR+ 0.1 mmol/Lβ-Me+0.1 mmol/L非必需氨基酸+2 mmol/L谷氨酰胺+50 IU /mL青霉素+50μg/mL链霉素+1000IU/mL LIF+20ng/mL bFGF为基础培养液,可以较好的维持山羊EGCs的体外生长,最高将山羊EGCs传至12代。6试验首次应用Lipofectamine2000将pEGFP-N1-hTERT和pEGFP-C1-mNanog转染入山羊EGCs,发现300μg/mL的G418适宜于山羊EGCs的筛选。离散典型细胞克隆传代培养后,可得到表达绿色荧光并具有EGCs特征的细胞克隆,发现转染hTERT和mNanog基因有利于山羊EGCs体外的长期培养,表明了通过转基因建立山羊EGCs细胞系的可行性。7试验通过免疫组织化学染色和RT-PCR分析,表明山羊ESCs表达SSEA-1和Oct4, EGCs表达Nanog,SSEA-1,Oct4和TERT。试验发现悬浮培养或延迟传代的山羊ESCs和EGCs可以分化形成类胚体或成纤维样细胞,神经样细胞,脂肪样细胞等。
刘晓坤[6]2014年在《利用“3i”体系分离培养小鼠和山羊胚胎干细胞》文中研究表明胚胎干细胞（Embryonic stem cells，ESCs）具有维持自我更新和多能性的能力，但在传统的有饲养层和血清的干细胞分离培养体系中很难建立昆白小鼠的ESCs系和山羊的ESCs系。有研究证明，应用添加叁种小分子化合物（MEK inhibitor，ALK5inhibitor和GSK3β inhibitor）组成的“3i”培养体系能抑制诱发分化的信号通路，从而更有利于分离并维持ESCs传代培养。利用此方法，一些很难分离ESCs的物种成功分离了具有形成嵌合胚胎能力的ESCs。本研究目的在于利用“3i”体系分离培养昆白系小鼠和山羊的ESCs，研究工作取得以下结果：（1）在无饲养层、无血清的培养体系中添加2.5μM6-溴靛玉红-3-肟（6-bromoindirubin-3’-oxime，BIO）（GSK3β信号通路抑制剂），分离得到了2株来源于昆白小鼠体外受精囊胚的ESCs系。在这个培养体系中，体外受精来源的扩张囊胚可以自发孵化并贴壁。培养过程中，可以观察到类胚胎干细胞集落，经过扩增，得到了2株昆白小鼠ESCs系，分别命名为KMES1和KMES2。这2株细胞系和其他啮齿类动物的ESCs具有相同的形态学特征，具有碱性磷酸酶活性，具有与细胞多能性相关的细胞标记，包括Oct-4, Nanog和SSEA-1。拟胚体实验和畸胎瘤实验证明分离得到的ESCs可以在体内外自发分化为叁胚层来源的细胞。（2）对关中奶山羊进行超数排卵和配种，手术法采集体内发育囊胚。在添加有2.5μM BIO、0.5μM PD184352（MEK信号通路抑制剂）、0.5μM SB431542（ALK5抑制剂）和1000U/mL白血病抑制因子（Leukemia Inhibitory Factor, LIF）的“3i”体系中分离培养ESCs。共超排了118只关中奶山羊，获得1204枚囊胚，分析表明，季节和气温变化会影响关中奶山羊的超排效果，秋冬季超排处理期间气温骤降会显着降低超排羊的胚胎回收数。通过机械分割法将超排获得的囊胚内细胞团分离后接种于铺有饲养层细胞的四孔板，在“3i”培养体系中培养，分离得到了山羊类ESCs，并传至12代，类ESCs具有碱性磷酸酶活性、表达OCT-4和Nanog，经悬浮培养可形成拟胚体，拟胚体贴壁培养后可自发分化为神经样细胞。研究结果证明，添加有BIO培养体系可以支持无饲养层、无血清条件下小鼠ESCs的建系；在添加有BIO，SB431542和PD184352叁种小分子化合物的培养体系中，可以分离得到山羊类ESCs，这为加快良种山羊的育种速度提供重要的技术平台。
刘春霞[7]2013年在《绵羊胚胎干细胞分离、培养、鉴定及诱导分化的研究》文中研究指明许多物种的ES细胞在建系和培养过程中多存在传代、保存难和易分化等问题，且对其诱导分化及调控机理也知之甚少，特别是家畜ES细胞的研究进展缓慢。绵羊ES细胞的研究虽早有报道，但仍未建立可稳定传代的细胞系，其发育调控机制尚属空白。为此，本研究以内蒙古优势畜种绵羊为研究对象，建立并优化了其类胚胎干细胞的体外分离、培养体系，对获得的绵羊类胚胎干细胞进行了鉴定，并对其进行了系统的诱导分化研究，主要结果如下：1.建立并优化了绵羊卵母细胞体外受精发育培养体系。添加10%～15%ESS、10μg/mL FSH、20μg/mL LH、1.5μg/mL17-βE2、100IU/mL青霉素和100IU/mL链霉素的TCM-199培养液能较好地促进绵羊卵母细胞体外成熟。绵羊卵母细胞体外成熟培养22～24h，用附睾精液进行体外受精，用Sofaa，10%FBS高糖Sofaa组合或CM，BM组合的发育液培养，置于38.5℃、叁气(5%CO2、5%O2、90%N2)、饱和湿度的条件下，可获得较高的卵裂率(76.0%)和囊胚率(31.1%)。2.建立了绵羊类ES细胞的分离体系。SEF、MEF及两者的1:1混合细胞都可较好地支持绵羊类ES细胞的生长。在不具备获得体内胚的条件下，体外受精胚可替代体内胚用于类ES细胞的分离，同样也具有较好的增殖及传代能力。囊胚的质量和胚龄影响绵羊类ES细胞的贴壁及增殖。机械切割（半胚法）处理囊胚，可获得跟免疫法相近的ICM贴壁率（46%VS53.6%）。3.建立了绵羊类ES细胞的培养体系，获得的类ES细胞体外培养传代达到了20代。机械法结合酶消化法适合于绵羊类ES细胞的分离与传代。添加一定浓度的FBS、细胞生长因子、胰岛素及VC的DMEM高糖培养液可促进类ES细胞的增殖，适于绵羊类ES细胞的培养。培养获得的绵羊类ES细胞，具有ES细胞的典型特征，AKP染色呈阳性，表达Kit、Rex1、Sox2、Nanog和Oct4基因，OCT4、SSEA-1、SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60及TRA-1-81特异性蛋白，染色体倍性正常（2n=54），在体外可自发分化为囊状体及各胚层的细胞，具有ES细胞的自我更新和分化特性。4.建立了绵羊类ES细胞体外分化培养体系。在诱导液中添加一定浓度的维甲酸或维甲酸与bFGF、Insulin联合使用，可将绵羊类ES细胞诱导分化为神经细胞，表达神经细胞特异性基因和蛋白（β-TubulinⅢ和Nestin）；添加β-甘油磷酸钠、DEX及VC盐的诱导液，可将绵羊类ES细胞诱导分化为成骨细胞，经AKP、茜素红和Kossa染色为阳性。添加DMSO或DMSO与RA联合使用的诱导液，可将绵羊类ES细胞诱导分化为心肌样细胞，其表达心肌特异性基因NKX2.5和GATA4及特异性蛋白α-Actin；脂肪细胞诱导液可促使绵羊类ES细胞分化为脂肪细胞，油红染色为阳性；添加一定浓度的ITS、EGF和NA的诱导液，可促使绵羊类ES细胞分化为胰岛分泌细胞，且表达特异性基因Insulin和PAX4及特异性蛋白Insulin。即绵羊类ES可诱导分化为来自于叁个胚层的细胞。
孙国杰[8]2002年在《山羊类胚胎干细胞的分离、克隆》文中研究说明本论文对影响山羊类胚胎干细胞(embryonic stem cell,ES细胞)和胚胎生殖细胞(embryonic germ cell,EG细胞)培养、分离、克隆、传代效果的影响因素进行了研究， 方法一：采用昆白小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)或山羊胚胎成纤维细胞(GEF)作为饲养层，高糖DMEM+10％NBS+20ng/mlLIF+10ng/mlSCF+0.1mMβ-巯基乙醇+100IU/ml青霉素+100IU/ml链霉素作为培养基，从5-6d胚胎中分离出山羊类ES细胞，克隆传至四代，其中第一代获得类ES细胞集落30个(33.3％)，第二代获得类ES细胞集落8个(8.9％)，第叁代获得类ES细胞集落3个(3.3％)，第四代获得类ES细胞集落2个(2.2％)。本实验研究了胚龄、生长因子、饲养层对山羊ES细胞分离和克隆的影响。结果表明：第6d的胚胎贴壁率最高(77.4％)；5.5d的胚胎获得11个类ES集落，有两个传至第4代；5d的胚胎贴壁率，获得类ES集落数均较低。LIF和SCF联合使用与对照组相比可提高类ES细胞的增殖率(52.9％:7.7％)，并且有两个类ES集落传至第4代。添加LIF和胰岛素对胚胎的贴壁和细胞的增殖有积极影响，单独添加LIF，没有形成类ES细胞集落，添加胰岛素有类ES集落形成，并传代一次。用小鼠胎儿成纤维细胞或山羊胎儿成纤维细胞作为饲养层，对胚胎的贴壁率、内细胞团的增值效果、ES的克隆效果，二种饲养层的差异不明显。ES细胞在体外悬浮培养，形成类胚体，山羊类ES细胞在无饲养层铺有明胶的皿底上培养，可分化为多种类型细胞，如上皮细胞、成纤维细胞、神经细胞等。同时还比较了山羊胚胎与小鼠胚胎在培养系统中的生长行为。 方法二：采用45-70d山羊胎儿的生殖腺与其同源成纤维细胞共培养，高糖DMEM+7.5％NBS+7.5％FCS+20ng/mlLIF+10ng/mlSCF+0.1mMB-巯基乙醇+100IU/ml青霉素+100IU/ml链霉素作培养基，分离出山羊原始生殖细胞(PGCs)，克隆并多次传代。45d胎儿原代观察到36个类PGCs细胞集落，传至4代后丢失。55d的胎儿获得11个PGCs集落，可传代2次，从70d胚胎的生殖腺没有分离到PGCs细胞集落。采用混合培养法，单独添加LIF和对照组相比没有积极影响，LIF和SCF联合使用有2个PGCs集落传至第4代。采用饲养层培养法，在培养基中添加LIF和SCF，分离到了原生生殖细胞，并有2个PGCs集落传至第3代。PGCs细胞具有干细胞的诸多特征，聚集生长，呈典型的鸟巢状、岛状，AKP染色呈阳性，在体外分化培养中生长形成多种类型的细胞。
闫龙, 雷蕾, 杨春荣, 高志敏, 雷安民[9]2008年在《山羊胚胎干细胞的分离与培养》文中认为对关中奶山羊配种后6~7天的桑椹胚和囊胚,分别采用全胚培养法、酶消化法和免疫外科法进行处理。将处理后的胚胎培养于小鼠胎儿成纤维细胞(MEF)饲养层上,分离培养山羊胚胎干细胞(Embryonic stem cell,ESC)。对分离传代的山羊ESCs分别进行免疫组化染色,RT-PCR检测和体外诱导分化试验。结果表明,全胚培养法易于胚胎贴壁形成原代集落,采用全胚培养法获得的ESCs有一株目前已传至18代。山羊ESCs Nanong、Oct4、SSEA-3免疫组化染色呈阳性,SSEA-1免疫组化染色呈弱阳性,SSEA-4免疫组化染色呈阴性,RT-PCR检测显示其表达Nanog、Oct4、端粒酶、CD117。山羊ESCs经DMSO体外诱导可以向心肌细胞分化,这些试验均表明该细胞具有ESCs的生物学特性。
罗树伟[10]2008年在《人类胚胎干细胞无饲养细胞体系建立及初步研究》文中研究说明人类胚胎干细胞(human embryonic stem cells, hESCs)来源于植入前人类囊胚的内细胞团(inner cell mass, ICM),是一种具有多向分化潜能和无限自我复制能力的特定细胞类型,为临床细胞替代治疗和人类胚胎发育机制研究等提供了理想的材料。目前,制约hESCs研究的一个重要的因素就是hESCs培养体系,目前普遍采用的是饲养细胞培养体系,饲养细胞培养体系由于其需要强度很到的劳动量和不稳定性,生产的hESCs细胞产量远不能够满足临床和实验研究的需要,建立简单稳定的无饲养细胞培养体系成为迫切的要求,同时无饲养细胞培养体系有助于阐明hESCs维持未分化状态的机制,也是hESCs定向诱导分化的基础,也可以消除hESCs |临床应用必需考虑动物源性成分带来潜在的危险性。本研究的主要内容是建立一种无饲养细胞hESCs体外培养体系,并对该无饲养细胞培养体系进行了初步研究。本论文第一章的研究内容是建立了一种新的hESCs无饲养细胞培养体系(称之为NB体系),对该培养体系下培养的hESCs鉴定结果显示, NB体系下hESCs和有饲养细胞培养体系下hESCs一样维持了自身的未分化状态,表现出典型的未分化hESCs外观,细胞高核质比,免疫细胞化学检测结果显示为Oct4、SSEA-4、TRA-A-60为阳性,AKP染色呈阳性,表达多能性基因Oct4、Sox2、Nanog和Rexl,在畸胎瘤中观测到叁胚层的细胞形成的组织结构,具有向叁胚层分化的潜能。hESCs解冻后依然保持了未分化状态。hESCs在NB培养体系培养的过程中,几乎所有的种植克隆处于未分化状态。同时,我们比较了4ng/ml、40ng/ml和100ng/mlFGF2对hESCs维持状态的维持作用,结果表明,在4ng/ml FGF2浓度下(NB4体系),未分化克隆百分比在无饲养细胞培养早期出现V字形波动,而40ng/ml(NB40体系)和100ng/ml FGF2 (NB100体系)始终维持高水平的未分化克隆百分壁,随着无饲养细胞传代的持续进行,当传代培养8-11代时,叁种浓度FGF2条件下的hESCs未分化克隆百分比接近一致,说明高FGF2浓度对hESCs从有饲养细胞体系转入到无饲养细胞体系时存在支持作用。总的来说,NB体系是一个非常稳定高效的无饲养细胞培养体系,不受饲养细胞波动的影响。论文第二章主要研究内容是常规人源性饲养细胞培养体系下(human embryonic feeder independent culture system, HEF体系)和NB体系下hESCs特性比较。在本章节中,我们采用了细胞倍增时间,细胞周期,细胞凋亡,SSEA4和TRA-1-60 FACS分析,EBs分化倾向以及畸胎瘤评级等指标来显示2种培养体系下hESCs存在的差异。结果显示,与有HEF体系相比较,NB体系下的hESCs具有较短的细胞倍增时间,HEF、NB4、NB40和NB100条件下平均细胞倍增时间分别为40.07±2.01 hrs、37.33±0.79 hrs.30.94±1.63 hrs和29.22±2.29 hrs,而细胞周期在这四种条件没有明显的改变,S期所占的百分比分别为41.75%±1.05%,42.90%±3.02%,41.48%±2.04%和41.34%±5.72%,细胞凋亡分别为10.8%±1.51%,8.44%±1.11%、5.96%±1.27%和3.61±%1.05%,说明,NB体系下hESCs增殖速度快主要的因素是抑制了细胞的凋亡,且与FGF2浓度存在正相关,与细胞周期没有直接的联系。就TRA-1-60和SSEA4的FACS分析结果来说,HEF、NB4. NB40和NB100体系下TRA-1-60阳性hESCs比率分别为71.6%±1.80%、93.0%±2.8%、87.8%±1.8%、83.1%±7.8%,而SSEA4阳性hESCs比率分别为81.5±5.46%,97.3%±0.8%、95.5%±2.5%、95.9%±2.4%,NB体系下的hESCs具有相对比较高的纯度,尤其是NB4培养体系；当NB体系下培养后的hESCs转回到HEF体系培养后,TRA-1-60和SSEA4阳性hESCs比率下降,介于HEF体系和NB体系之间,NB4、NB40和NB100转回HEF体系后TRA-1-60+细胞比率分别为86.1%6±4.6%、84.8%±2.0%、87.6%±1.0%,SSEA4+胞比率分别为89.2%±1.9%、85.8%±1.2%、87.9%±0.7%。在EBs自发分化倾向上,NB体系下的hESCs表现出分化抑制现象,主要体现在EBs分化过程中对多能行基因(Oct4、Nanog和Rex1)的持续高表达和对叁胚层(外胚层分化基因Sox3、Pax6、Soxl,中胚层分化基因Brachyury,内胚层分化基因Sox17、AFP、GATA6)分化基因的低表达以及不表达。将NB体系下的hESCs重新转入到有饲养细胞培养体系培养后,在培养第11代时,培养中的hESCs出现了分化克隆,于第13代时进行EBs分化倾向检测,发现NB体系下来源的有饲养细胞体系下的hESCs的分化倾向得到一定程度的恢复,在EBs的培养过程中虽然高表达多能性基因,但是叁胚层分化基因的表达得到了恢复,包括了外胚层分化基因Sox3、Pax6、Soxl,中胚层分化基因Brachyury,内胚层分化基因Sox17、AFP、GATA6。其中以NB4体系下hESCs恢复的比较完全,NB体系下高剂量的FGF2对hESCs分化能力的恢复存在抑制作用。HEF体系和NB体系下hESCs发生的分化倾向的改变可能与自身表面标记分子阳性率的改变相关。总的来说NB体系下的hESCs比有饲养细胞培养体系下的hESCs具有高的细胞增殖能力,低细胞凋亡,具有较高的细胞纯度,在EBs分化能力上受到一定的限制,但是在重新转入到饲养细胞培养体系后,其分化潜能可以得到不同程度的恢复,尤其是NB4体系下的hESCs,其TRA-1-60和SSEA4阳性细胞比率逐渐恢复到HEF体系下水平,hESCs分析倾向的改变可能与其自身表面分子标记物阳性比率相关。论文第叁章节主要内容是研究hESCs自分泌对维持自身未分化状态的作用。经过检测发现,培养中的hESCs自身表达了多种维持自身未分化状态的细胞因子,如FGF2、FGF4和Nodal等,同时也表达促进细胞分化的细胞因子,如BMP家族成员BMP2.BMP4和BMP7等。hESCs自身可以改变自身的微环境,与含有SR的培养体系相比较,NB体系具有的BMP样诱导活性较低,但是当hESCs克隆种植较高(100克隆/cm2)时,NB培养体系的BMP样诱导活性得到增强；在含有SR的培养体系中也得到了类似的结果。由于hESCs自身表达了FGF2,存在FGF信号通路的自分泌,为了检测这种自分泌强度,当hESCs在NB体系下的培养过程中撤除外源性的FGF2后,hESCs自身并没有发生分化现象,同时,当hESCs从HEF体系转入到NB体系时,在没有加入外源性的FGF2的条件下,hESCs同样可以维持自身的未分化状态,表达多能性基因Oct4、Nanog和Rex1和多能性标记Oct4、TRA-1-60和SSEA4。当然,hESCs分泌了其他的未知的细胞因子,对这些细胞因子的分离和鉴定后,在培养体系中加入对hESCs维持未分化状态的细胞因子和抑制促进分化的细胞因子的功能,可以优化和完善NB体系。国内外的研究表明,hESCs分泌的细胞因子有助于hESCs的建系,所以对hESCs自分泌的研究为hESCs无饲养细胞建系和培养提供新的思路和方向。总的来说,无饲养细胞体系一NB体系是一个稳定的高效的无饲养细胞hESCs培养体系,在该体系中,hESCs细胞的自分泌可以维持hESCs自身未分化状态,hESCs自分泌为研究hESCs建系和阐明维持未分化状态的机制提供新的思路和方法。
参考文献：
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[10]. 人类胚胎干细胞无饲养细胞体系建立及初步研究[D]. 罗树伟. 中南大学. 2008
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