徐春英[1]2004年在《应用气孔特异性启动子-KST1改良植物抗旱性的初步探讨》文中进行了进一步梳理植物激素脱落酸(ABA)在种子成熟、休眠以及植物对各种各样环境胁迫的适应都起着重要的作用。ABA的重要生理作用之一是促进气孔关闭，而气孔是植物体与外界环境间水分和气体交换的门户，对植物的光合与蒸腾具有重要的调控作用。目前通过提高ABA水平来提高植物的逆境胁迫耐力的研究表明9—顺式环氧类胡萝卜素双加氧酶(NCED)是干旱胁迫下ABA合成中的关键酶，并且超表达NCED基因可以提高植株的抗旱性；但是如果植物体内积累过多的ABA可能会对植物生长造成不良影响。为了减轻ABA的不利作用，提高其在抗旱中的有利作用，我们研究了气孔特异性启动子-KST1在提高植物抗旱性中的可能作用。 构建了组成型35S、诱导型RD29A、气孔特异表达性KST1启动子驱动AtNCED_3基因表达的真核表达载体，通过农杆菌介导的叶盘法转化烟草，得到了转基因植株。结果显示正常条件下ABA的含量35S转基因植株最高，其次是KST1，RD29A和野生型烟草。干旱条件下转基因烟草ABA含量明显高于野生型，最高是RD29A植株，其次是35S、KST1转基因植株。 比较了35S、RD29A、KST1启动子驱动AtNCED_3的表达对烟草生长和气孔运动以及抗旱性的影响，结果表明35S转基因植株明显生长矮小，发育滞后；RD29A转基因植株生长也比野生型慢一点；KST1转基因阳性苗表型最好，在正常条件下生长旺盛。AtNCED_3基因的表达对气孔运动影响较大，明显促进了暗诱导的气孔关闭。在逆境条件下，转基因烟草抗旱性显着提高，依次是35S，RD29A，KST1转基因植株，都明显高于野生型烟草。 综合以上实验结果，可以得出初步结论：利用AtNCED_3基因来人工调控植物的水分利用效率，KST1启动子是比较理想的实现植物转基因表达调控的基因开关系统。
武晓亮[2]2017年在《花生ABA途径抗逆基因AhLOS5克隆与抗逆性研究》文中进行了进一步梳理花生(Arachis hypogaea L.)是我国重要的油料作物和经济作物,以其扎根深、开花量大、花期长、无明显的需水临界期以及水分利用率较高等特点,具有较强的抗旱性,是发展旱作农业和旱薄地开发的理想作物。干旱往往伴随土壤荒漠化、盐渍化的加重,给农业生产带来多种因素的制约。在全球范围内,有2/3的花生分布在旱作地区,缺少灌溉条件加之瘠薄的砂质土壤,使干旱和高盐危害非常普遍,已成为花生生产上分布最广、危害程度最大的限制因素。在我国,常年有70%的花生遭受不同程度的干旱和高盐胁迫,干旱和高盐引起的荚果减产率平均在20%以上。植物对非生物逆境的响应伴随着对生长发育过程很多基因的调控。植物激素脱落酸(abscisic acid,ABA)能参与植物对许多环境胁迫如干旱、冷害、盐害等的生理反应和分子生物学效应。目前ABA已经公认为能够诱导植物产生对不良环境的抗性(抗旱性、抗寒性、抗病性、耐盐性等),是植物的“抗逆诱导因子”。目前公认的高等植物体内的ABA的生物合成主要为间接途径,反应过程中的玉米黄质环氧化酶(ZEP)、9-顺式环氧类胡萝卜素双加氧酶(NCED)、ABA醛氧化酶(AAO)及钼辅因子硫化酶(MCSU)是关键调控酶。本研究从花生栽培品种‘丰花1号’中克隆了钼辅因子硫酸化酶基因AhLOS5,进行了抗逆性鉴定和基因功能验证。构建了含AhLOS5基因的正义和反义植物表达载体,农杆菌介导分别转化叁生烟草,获得了不同AhLOS5表达水平的转基因烟草植株,并对这些转基因株系的T1代植株进行了生物学功能分析。通过生理分析、遗传鉴定、分子生物学和生物化学的研究确定AhLOS5应答非生物逆境的机制。具体结果如下:(1)选取了黄淮海花生产区4个主推品种,进行抗旱性鉴定。抗旱性能排名为‘花育20号’>‘丰花1号’>‘海花1号’>‘白沙1016’。(2)在黄淮海花生主产区种植面积较大,同时表现高抗旱性的花生品种‘丰花1号’中成功克隆花生AhLOS5基因。全长2731个碱基,包括2451bp的开放阅读框,115bp的5′非编码区,165bp的3′非编码区,ORF编码816个氨基酸。该基因编码钼辅因子硫酸化酶,属于MOSC超家族。同源性分析证明,我们克隆得到的‘丰花1号’AhLOS5与花生二倍体野生种A.duranensis中的AdLOS5同源性最高,达到94.7%,与AiLOS5同源性为92.2%。与其他高等植物相比,AhLOS5与同属豆科的狭叶羽扇豆、矮沙冬青、木豆、同源性较高,分别为77.7%、73.7%和72.9%,与属十字花科的拟南芥同源性略低,为59.9%。(3)以AhLOS5 cDNA核苷酸片段制备探针对4个主推品种中AhLOS5的表达特性进行了分析。结果显示,AhLOS5在4个主推品种中表达量顺序为‘花育20号’>‘丰花1号’>‘海花1号’>‘白沙1016’。我们发现,4个品种间的AhLOS5基因表达量排序与其抗旱性排序一致。验证了该基因在花生中的抗旱性。(4)采用Northern杂交的方法对‘丰花1号’中AhLOS5的表达特性进行了分析。结果表明,AhLOS5在花生中组成型表达,花生各器官中表达量顺序为花>成熟叶>幼果>果针>根>茎,在叶片中的表达量随着叶龄的增加而增加,在叶片展开第50d达到峰值。AhLOS5的表达还受干旱和盐胁迫诱导,诱导作用明显。(5)构建了2种植物表达载体,即含正义AhLOS5的载体pBI-LOS5和含反义AhLOS5的载体pBI-R-LOS5。以叁生烟草为转化受体,采用农杆菌介导的方法,将上述2种载体分别转化。转不同载体的转基因烟草当代(T0代)所结的种子,经卡那霉素筛选,并结合转基因株系的T1代植株PCR鉴定结果,初步确定,含反义AhLOS5的转基因植株有20株,含正义AhLOS5的转基因植株有52株,并选取部分不同类型的转基因植株进行了Northern杂交分析。(6)通过转基因烟草植株种子根长、叶绿素含量、相对含水量、相对电导率、丙二醛(MDA)、抗坏血酸(ASA)、抗氧化酶活性(SOD,POD,CAT,APX)、内源ABA、脯氨酸等生理生化指标检测发现,在干旱和盐胁迫下,过表达AhLOS5的转基因烟草转基因植株体内内源ABA含量显着升高,抗氧化酶活性明显升高,膜脂完整性好,渗透调节物质含量高。过表达AhLOS5能够明显的提高转基因株系对干旱和盐胁迫的抗性。(7)用Northern blot方法对转基因烟草中另外3个抗逆相关基因DREB2B,RD22,P5CS表达进行检测。结果显示,在干旱和盐胁迫下,正义转基因和野生型对照植株的3个基因DREB2B,RD22,P5CS都诱导表达;而反义转基因植株中只有不依赖ABA的抗逆基因DREB2B诱导表达,依赖ABA的抗逆基因RD22和P5CS都不诱导表达。这证明了AhLOS5参与的植物抗逆途径属于依赖ABA途径,过表达AhLOS5转基因烟草获得的抗逆性是由胁迫诱导产生的内源ABA调控的。
参考文献：
[1]. 应用气孔特异性启动子-KST1改良植物抗旱性的初步探讨[D]. 徐春英. 中国农业大学. 2004
[2]. 花生ABA途径抗逆基因AhLOS5克隆与抗逆性研究[D]. 武晓亮. 山东农业大学. 2017