申秀丽[1]2018年在《青海高原结核分枝杆菌耐药特征研究》文中指出目的:了解青海地区结核分枝杆菌对一线抗结核药物的耐药现状;探讨结核分枝杆菌耐药相关基因突变在敏感或耐药菌株中是否有差异。方法:对青海地区分离的198株结核分枝杆菌用改良罗氏培养基进行培养,采用比例法进行耐药性检测,分析该地区耐药状况与人口学特征的关系,并对结果进行统计学分析。采用传统水煮法提取结核分枝杆菌DNA,对异烟肼作用于结核分枝杆菌的基因kat G,pre-inh A及oxy R-ahp C间隔区进行扩增,利福平作用于结核分枝杆菌的基因rpo B进行扩增,乙胺丁醇作用于结核分枝杆菌的基因emb B进行扩增,链霉素作用于结核分枝杆菌的基因rps L和gid B进行扩增。对结核分枝杆菌耐药和敏感的菌株进行基因突变描述,并对结果进行统计学分析。基因测序药物作用相关基因的突变诊断结核菌的耐药性与传统比例法对结核菌耐药性检测的敏感性,特异度,阴性似然比,阳性似然比及kappa值。结果:1.198株结核分枝杆菌总耐药率为58.59%(116/198),四种一线药物耐药率由高到底依次为异烟肼(45.96%,91/198)>利福平(43.94%,87/198)>链霉素(40.91%,81/198)>乙胺丁醇(30.30%,60/198)。青海地区结核分枝杆菌耐药状况与地区和年龄有关(χ~2=5.236,P=0.022;χ~2=8.796,P=0.032),与性别和民族无关(χ~2=0.871,P=0.351;χ~2=0.011,P=0.916)。2.基因测序196株菌,对异烟肼耐药的89株结核分枝杆菌中kat G315位点突为61.80%(55/89),107株异烟肼敏感菌株中kat G315位点突变率为3.74%(4/107),kat G315位点突变在敏感或耐药的结核分枝杆菌中存在差异(χ~2=40.251,P<0.001)。19株株结核分枝杆菌在oxy R-ahp C间隔区发生了突变,突变率为9.69%(19/196);耐药株有17株,突变率为19.10%(17/89);敏感株有2株发生突变,突变率1.87%,oxy R-ahp C间隔区突变在结核分枝杆菌敏感或耐药菌株中存在差异(χ~2=13.456,P<0.001)。7株结核分枝杆菌在pre-inh A发生突变,突变率为3.57%,3株耐药菌发生了突变,突变率为3.37(3/89),4株敏感菌有突变,突变率为3.74%(4/107),pre-inh A突变在结核分枝杆菌敏感或耐药菌株中突变无差异(χ~2=0.019,P=0.890)。3.196株测序的结核分枝杆菌中耐药菌株占43.37%(85/196)株,敏感菌株占56.63%(111/196),共有72株菌发生了突变,突变率为36.74%(72/196)。85株耐药菌中基因突变率81.18%(69/85),111株敏感菌中基因突变率2.70%(3/111),结核分枝杆菌对利福平耐药或敏感与rpo B基因突变有关(χ~2=124.199,P<0.001)。4.196株结核分枝杆菌乙胺丁醇耐药率为30.10%(59/196),敏感菌株为69.90%(137/196),emb B基因突变率为20.41%(40/196)。59株EMB耐药结核分枝杆菌emb B基因突变率为45.76%(27/59),137株EMB敏感结核分枝杆菌emb B基因突变率为9.49%(13/137),emb B基因突变与结核分枝杆菌对EMB耐药或敏感有关(χ~2=33.406,P<0.001)。5.196株测序的结核分枝杆菌中,链霉素耐药菌占40.82%(80/196),80株耐药结核分枝杆菌rps L基因突变率56.25%(45/80),链霉素敏感菌株占59.18%(116/196),116株结核分枝杆菌rps L基因突变率19.83%(23/116),结核分枝杆菌链霉素耐药或敏感与rps L基因突变有关(χ~2=27.722,P<0.001)。共测序192株结核分枝杆菌的gid B基因,10株结核菌未发生基因突变,占5.21%(10/192)。182株结核菌发生了突变,突变率为94.79%(182/192);173株结核菌同时发生gid BE92D和gid BA205A突变,78株耐药菌中69株为gid BE92D和gid BA205A同时突变,突变占耐药株的88.46%(69/78),114株敏感菌中104株gid BE92D和gid BA205A同时突变,占敏感株中的91.23%(104/114),结核分枝杆菌gid BE92D位点和gid BA205A位点突变与结核分枝杆菌耐链霉素没有关系(χ~2=0.398,P=0.528)。结论:青海地区结核分枝杆菌耐药情况严重,高于全国水平。结核分枝杆菌对异烟肼,利福平,乙胺丁醇和链霉素产生耐药与耐药相关基因突变有关,检测耐药突变相关位点可以快速诊断结核分枝杆菌的耐药情况。
许榕青, 李丹, 林银霞, 黄明翔, 陈新朝[2]2017年在《基因芯片技术检测结核分枝杆菌利福平和异烟肼耐药性临床应用评价》文中研究表明目的评价基因芯片技术检测结核分枝杆菌利福平和异烟肼耐药性的临床应用效果。方法利用基因芯片技术对涂阳肺结核患者的痰标本和临床分离株进行利福平和异烟肼耐药基因位点检测,比较痰标本与菌株检测结果的差异;并以BACTEC MGIT 960药敏试验结果为对照评价基因芯片的检测性能。另外,通过对999株鉴定为结核分枝杆菌的临床分离菌株进行rpoB、katG和inhA基因耐药相关区域扩增产物测序,以验证基因芯片对核酸序列检测的准确性。结果在涂阳的1 108例标本中有100例经基因芯片菌种鉴定为非结核分枝杆菌。其余的1 008例痰标本基因芯片结果与BACTEC MGIT960培养阳性的菌株基因芯片结果比较仅有9例结果不一致,符合率为99.1%。以BACTEC MGIT960培养法药敏结果为对照,999株菌株基因芯片法检测利福平耐药性的符合率为98.1%,异烟肼的耐药性的符合率为94.5%。与DNA测序法相比,基因芯片法检测利福平和异烟肼耐药性的准确率分别为99.6%和99.8%。结论基因芯片技术能够快速、准确地进行结核分枝杆菌利福平和异烟肼的耐药性检测,并能直接用于痰标本检测。
胡晓红, 向启云, 韩宇, 谢传英, 庄倩[3]2015年在《基因芯片技术在宜昌地区结核分枝杆菌耐药情况监测中的应用》文中研究表明目的利用基因芯片技术检测宜昌地区结核分枝杆菌感染及耐药情况,为本地区结核病预防和控制提供依据。方法收集2013年7月-2014年7月采自宜昌地区共1 200例抗酸染色阳性患者临床标本,其中痰标本746份,菌液320份,分离菌株134份。对1 200例患者采取性别,年龄分组的方法分析本地区结核分枝杆菌感染分布及流行趋势;采用基因芯片技术检测利福平耐药相关ropB基因511(T→C)、513(C→A)516(G→T,A→T,A→G)、526(C→T,C→G,A→T,A→G)、531(C→T,C→G)、533(T→C)位点及异烟肼耐药相关KatG基因的315(G→C,G→A)位点和Inhat基因的-15(G→T)位点突变情况。以比例法药敏试验为金标准,计算基因芯片法的检出率,敏感度和特异度。结果基因芯片法检测利福平异烟肼敏感968例,单耐利福平31例,单耐异烟肼63例,利福平异烟肼双耐57例,分枝杆菌属感染39例,未检出42例。药敏试验显示本地区结核分枝杆菌对利福平、异烟肼的总耐药率为13.49%;男性占73.90%,女性占26.09%;≤20岁占2.50%(28/1119),21~岁占15.46%(173/1119),41~岁占40.21%(450/1119),>60岁占41.82%(468/1119)。基因芯片检测利福平耐药相关ropB基因突变率最高的位点为531(突变率32.35%)、其次是511(突变率20.6%);异烟肼耐药相关KatG基因突变位点为315(突变率54.69%),ihat突变位点为-15(突变率43.75%)。检出KatG和ihat双突变1例,占突变株的1.56%。与比例法药敏试验相比,基因芯片法检测利福平/异烟肼耐药株的符合率分别是90.90%(1089/1198)和97.41%(1167/1197),检测利福平耐药株的敏感度为90.62%(29/32),特异度为98.62%(1060/1166);检测异烟肼株的敏感度84.0%(63/75),特异度98.39%(1104/1122)。结论宜昌地区结核分枝杆菌对利福平和异烟肼的总耐药率低于全国平均水平,男性结核分枝杆菌感染者远高于女性,且随着年龄增大感染率及耐药率增高。本地区结核分枝杆菌耐药株的突变位点与其他地区有较大差异。
王燕平[4]2016年在《肺痨康抗耐异烟肼肺结核的作用与KatG基因突变的关系研究》文中指出目的：通过采用全基因组重测序的方法,研究肺痨康抗耐异烟肼结核分枝杆菌的作用是否与KatG基因突变的回复或修复相关,为中医药治疗耐异烟肼肺结核的机制提供新思路。方法：1、实验动物分组：SPF级昆明种小鼠120只,初始体重为18-22g,随机分6组,每组20只小鼠,分别为空白组、标准菌组、耐异烟肼组、肺痨康组、异烟肼组、联合组；2、建立模型：空白组小鼠不做尾静脉注射结核杆菌；标准菌组各小鼠行尾静脉注射H37RV标准结核分枝杆菌菌株菌悬液(ATCC:27294)；其余四组小鼠分别行尾静脉注射耐异烟肼结核菌株菌悬液；3、药物干预：空白组、标准菌组、耐异烟肼组小鼠连续56天生理盐水灌胃,每天1次；肺痨康组、异烟肼组、联合组小鼠分别用肺痨康液、异烟肼液、肺痨康联合异烟肼混合液连续灌胃56天,每天1次；4、实验周期结束后各组小鼠分离肺组织进行细菌培养、病理切片观察及各组随机选取1-2只小鼠肺组织进行结核分枝杆菌DNA提纯测序。结果：1、除空白组,其余各组小鼠肺组织细菌培养均为阳性；2、肺组织病理形态学观察发现,除空白组,其余各组小鼠肺组织均呈不同程度的增生、渗出、坏死等病理形态；3、除空白组外,其余五组样本细菌基因组DNA重测序结果：在染色体NC_000962.3第2154724和2155168位置即KatG基因常见突变位点R463L和S315T位,标准菌组未见基因突变；耐异烟肼组存在基因多态性；药物干预组基因突变。经异烟肼、肺痨康及异烟肼联合肺痨康治疗后的耐异烟肼结核分枝杆菌全基因测序发现在染色体NC_000962.3上编码假定蛋白(hypothetical protein)的Rv0104、Rv2079、Rv3898c基因,编码转座酶触合蛋白(transposase fusion protein)的Rv3327基因,均突变为终止子。经肺痨康、肺痨康联合异烟肼干预治疗后的耐异烟肼结核分枝杆菌全基因测序发现染色体NC_000962.3上可能与编码氧化还原酶相关的RV0063基因发生呈多态性的突变,突变为终止子。结论：1、除空白组外,其余组小鼠均成功感染结核菌；2、经异烟肼、肺痨康、异烟肼联合肺痨康治疗后耐异烟肼结核分枝杆菌全基因组测序显示,KatG基因第463位和第315位碱基突变均无回复现象,说明肺痨康抗耐异烟肼结核杆菌的作用为回复或修复突变基因的假说在本次实验中未得到验证；3、经异烟肼、肺痨康及异烟肼联合肺痨康治疗后的耐异烟肼结核分枝杆菌全基因测序发现在染色体NC_000962.3上编码假定蛋白的基因Rv0104、Rv2079、Rv3898c及编码转座酶触合蛋白的基因Rv3327均突变为终止密码子,有待于进一步验证是否因药物干预的影响；4、经肺痨康及肺痨康联合异烟肼干预治疗后耐异烟肼结核分枝杆菌全基因组重测序发现染色体NC_000962.3上RV0063基因仅在这两组发生突变呈“多态性”。该基因可能编码氧化还原酶,可与过氧化还原酶ps00862共价位点FAD结合,该位置突变导致编码412谷氨酸的密码子变为终止密码,使氧化还原酶的编码终止,不能产生该氧化还原酶与上述共价FAD结合位点结合,这一突变可能降低了结合分枝杆菌对氧化还原酶活性的抗性,这是否与肺痨康抗耐异烟肼结核病的作用有相关性,目前尚不能肯定。
余丽[5]2016年在《异烟肼/链霉素耐药结核分枝杆菌新耐药位点筛查》文中进行了进一步梳理结核病及耐药结核病的早发现、早治疗是提高结核病治愈率、降低死亡率的关键。然而基于固体培养的传统诊断方法检测周期长,一般为1-2个月,因此可能耽误患者的最佳治疗时机。随着分子生物学的迅速发展,出现了一批结核菌及耐药结核菌的快速基因型诊断技术;但是利用现有的异烟肼、链霉素相关耐药基因的常见突变位点(kat G、inh A、rps L、rrs)对临床异烟肼、链霉素耐药结核菌的检出率仅为60%~80%;因此发现新的耐药位点是提高基因型诊断检出率的基础和依据,并为改进和研发新的基因型诊断工具奠定基础,同时对全面研究耐异烟肼/链霉素结核分枝杆菌的耐药分子机制,以及发现新的药物作用靶点和研制新的抗结核药物具有深远意义。为此本研究首先评估基因型诊断技术的准确性,其次对预测出的新的耐药位点进行鉴定,最后通过控制单因素(药物)变量法,成功构建体外诱导耐异烟肼/链霉素的结核分枝杆菌模型,从而排除环境等因素对结核菌碱基突变的影响,达到有效筛查新耐药位点的目的。本研究的主要内容及研究结果如下:1、为评估实验室现有基因型诊断技术的准确性及最低检出限,并为制定合理的诊断路径提供依据。本试验对已知耐药表型的结核分枝杆菌进行浓度梯度倍比稀释后研究发现,Xpert MTB/RIF比基因芯片和Geno Type?MTBDRplus的检测灵敏度稍高,其检出下限同培养法相当(3×102个数/m L)。在MTB含量较高的情况下(>3×104个数/m L)基因型检测方法均能检出利福平或异烟肼耐药结核菌,因此基因型检测方法对结核菌耐药性的检测具有较高的准确性。2、发现异烟肼/链霉素耐药结核菌中新的耐药位点是提高其基因型诊断检出率的基础和依据,为此对129株结核分枝杆菌临床分离株进行PCR扩增并测序比对分析发现,异烟肼耐药结核菌中基因间区Rv1482c~Rv1483(1673425位点)碱基突变的检出率为17.78%(8/44);链霉素耐药结核菌中基因间区Rv1194c~Rv1195(1338631位点)碱基突变的检出率为11.11%(5/45)。表明基因间区Rv1482c~Rv1483、Rv1194c~Rv1195分别是异烟肼、链霉素耐药结核菌中新的耐药位点,并可提高临床异烟肼/链霉素耐药结核菌基因型诊断的检出率。3、为有效筛查异烟肼/链霉素耐药结核菌中新的潜在耐药位点,并为建立准确、高效的基因型诊断技术奠定基础。本试验构建了体外诱导耐异烟肼/链霉素的结核分枝杆菌模型,并通过分析比对诱导耐药株和未诱导对照株全基因组序列的差异,发现了7个新的潜在异烟肼耐药位点,8个新的潜在链霉素耐药位点,后续仍需对其进行验证。总之,本研究结果表明基因型检测方法是耐药结核病临床诊断不可或缺的辅助诊断技术,同时有效筛查出异烟肼/链霉素耐药结核菌中新的潜在耐药位点,可提高异烟肼/链霉素耐药结核菌基因型诊断的检出率,对进一步改进和研发耐药结核菌基因型快速诊断技术具有重要意义。
杨辉, 张国良, 张明霞, 陈心春, 陈建波[6]2012年在《某地区结核分枝杆菌利福平和异烟肼耐药相关基因突变特征分析》文中指出目的了解深圳地区结核分枝杆菌临床分离株利福平和异烟肼的耐药相关基因的突变特点。方法 60株结核分枝杆菌临床分离株通过全自动快速分枝杆菌培养鉴定系统(BACTEC-MGIT960)进行鉴定和药敏分析。在这60株菌株中,针对包括利福平耐药决定区(RRDR)在内的rpoB基因和异烟肼耐药相关位点katG315、inhA-15、kasA269、kasA312进行PCR扩增,并将扩增产物T-A克隆后进行测序。结果在60株结核分枝杆菌临床分离株中,检出利福平耐药株45株,敏感株15株;异烟肼耐药株41株,敏感株19株;利福平和异烟肼同时耐药的有14株。在45株利福平耐药株中,rpoB基因RRDR突变发生率为91.1%(41/45),共检测到12种突变形式,主要突变位点在531、526、516、533,以Ser531Leu突变最常见,占rpoB发生基因突变株的51.2%(21/45)。在41株异烟肼耐药株中,katG315位点有29株发生突变,包括28株katG315(AGC-ACC)和1株katG315(AGC-AAC)突变,突变发生率为70.7%(29/41);inhA-15位点有9株发生突变,均为(C-T)突变,突变发生率为21.95%(9/41)。kasA基因未发现常见突变形式。结论深圳地区结核分枝杆菌利福平和异烟肼耐药相关基因突变位点与国内外研究基本一致,但各位点频率有所不同。
刘厚明, 陈珊, 黄莎莎, 单万水[7]2018年在《某院结核分枝杆菌利福平和异烟肼耐药基因特征》文中研究表明目的了解某院结核分枝杆菌(MTB)利福平耐药相关基因rpo B及异烟肼耐药相关基因kat G、inh A的突变特征,为耐药结核病的预防和治疗提供科学依据。方法收集83例结核病患者痰标本,分离培养MTB,采用BD960液体法检测利福平、异烟肼耐药性,提取菌株DNA,采用聚合酶链反应扩增rpo B、kat G、inh A全基因,对扩增产物进行测序分析。结果 83株样本中,39株对利福平耐药,51株对异烟肼耐药。耐利福平菌株rpo B基因突变率为97.44%(38/39),531位点突变率60.53%(23/38),526位点突变率23.68%(9/38),32株出现多位点联合突变。耐异烟肼菌株kat G基因突变率为98.04%(50/51),共发现16种突变类型,其中以kat G 315位点突变为主,占70.00%(35/50),1株为kat G与inh A联合突变。结论该院耐多药MTB产生耐药性与rpo B和kat G基因突变相关,检测MTB耐多药相关基因突变可为早期快速诊断耐药结核病提供参考依据。
潘爱珍[8]2010年在《TaqMan-MGB荧光定量PCR用于结核分枝杆菌异烟肼耐药的研究》文中研究表明近年来,结核病耐药问题已成为全球公共卫生关注的焦点,尤其是耐多药和广泛耐药。耐药结核病的发生和流行成为当今结核病防治工作的难题和最大挑战。耐多药结核病和广泛耐药结核病已成为严重威胁我国广大人民群众身体健康的传染病之一。异烟肼是常用的一线抗结核药物,对病人的治疗发挥重要作用,因此对异烟肼耐药性研究和快速诊断很有必要,可以为结核病的防治提供科学依据。本研究的目的是建立TaqMan-MGB荧光定量PCR技术快速检测结核病异烟肼耐药,并初步应用于临床痰标本,为临床上大批量筛查提供基础。本研究选择来自全国12个省市的274株结核分枝杆菌临床分离株,经比例法药敏试验,了解其耐药概况,尤其是异烟肼耐药。对异烟肼耐药相关基因katG、pre-inhA、inhA、 ndh及oxyR-ahpC采用PCR扩增及DNA测序,了解基因突变位点在中国结核分枝杆菌临床菌株中的分布,筛选出对异烟肼耐药贡献率最大的基因突变位点。根据筛选出的基因位点设计荧光PCR探针和引物,建立TaqMan-MGB荧光定量PCR快速检测结核杆菌katG315突变的方法。用130株结核分枝杆菌,16株非结核分枝杆菌和7株非分枝杆菌标准菌株及阳性质粒标准品一起评价该方法的特异性、敏感性、重复性和最低检测下限。此外用该方法初步应用于161份确诊病人的痰液和5份非结核病呼吸疾病患者的痰液。结果统计学分析采用卡方检验。274株结核分枝杆菌经四种一线药物(SM、RFP、INH、EMB)药敏试验鉴定单耐药56株,耐多药152株,全敏感55株。222株耐药菌株中异烟肼耐药209株,其次利福平耐药159株。209株INH耐药株测序结果发现主要以katG基因、pre-inhA基因单碱基突变为主,分别占64.58%、24.88%,同时筛选出对INH耐药关系最大的katG315G→C突变,突变率达45.93%。荧光定量PCR目的基因的最低检测下限10copies/μl,低于常规PCR最低检测下限的100倍,检测16株非结核分枝杆菌标准株和7株非分枝杆菌标准株均为阴性,特异性100%。批内批间CT值变异系数均小于1%,重复性好。该方法与130株菌株的药敏试验相比符合率68.46%(89/130)、敏感性59%(59/100)、特异性100%(30/30)。与测序法相比,野生型和突变型探针的敏感性和特异性均为100%。荧光定量PCR检测166份痰液的敏感性84.47%,特异性100%。在确诊病人的痰液中阳性检出率84.47%,明显高于痰涂片40.99%(x,2=46.44,P<0.01),痰培养40.37%(χ2=47.89,P<0.01), IS6110-PCR50.31%(x2=27.39, P<0.01),且有统计学意义。其中荧光PCR在菌阳中检出率94.44%,涂阴培阴的痰液中检出率75.28%。检测61份痰培养异烟肼耐药时,荧光PCR与传统药敏试验相比,两种方法的符合率96.72%(59/61),敏感性33.3%(1/3),特异性100%(58/58)。本研究建立TagMan-MGB荧光定量PCR的方法能特异、灵敏、快速检测结核杆菌菌株或临床痰液katG315G→C突变,同时能诊断痰液中的结核分枝杆菌,提高临床疑似病人的阳性检出率。而且该方法简单、操作简便、时间简短至3小时之内,结果可靠,可成为临床诊断和治疗的一种重要辅助手段。
周爱萍, 张敏, 李文侠, 张增贤, 沙莎[9]2018年在《西安市耐异烟肼的结核杆菌耐药性及分子特征分析》文中认为目的了解西安市临床分离的结核分枝杆菌异烟肼耐药菌株katG315、inhA-15突变情况及其分子特征。方法利用BACTAC MGIT960分枝杆菌快速培养系统对临床分离结核分枝杆菌进行药敏试验,采用定向缺失多重PCR(DTM-PCR)对异烟肼耐药菌株进行基因分型研究,分别利用多重等位基因特异PCR(MAS-PCR)和PCR-DNA测序法对其katG315和inhA-15突变热点进行检测。结果 117株异烟肼耐药菌株有73株为多重耐药结核分枝杆菌(62.39%),104株为北京型菌株(88.89%),81株存在katG315位点突变(69.23%),10株存在inhA-15位点突变(8.55%)。结论西安市异烟肼耐药分枝杆菌以北京型菌株为主,耐药表型主要表现为多重耐药,主要突变为katG315突变。
孙勇[10]2012年在《北京地区结核分枝杆菌耐药分子特点及结核分枝杆菌耐喹诺酮类药物泵机制的初步研究》文中研究表明目的研究北京地区结核分枝杆菌临床分离株katG、inhA、oxyR、ahpC、ndh、dfrA、kasA、inhA启动子区、oxyR-ahpC基因间区、rpoB、rpsL、rrs、gyrA、gyrB、tlyA和thyA基因基因突变特点，探讨结核分枝杆菌对异烟肼、利福平、链霉素、乙胺丁醇、喹诺酮类、阿米卡星、卷曲霉素和对氨基水杨酸钠的耐药分子机制。方法对303例异烟肼耐药菌株和61例异烟肼敏感菌株、195例利福平耐药菌株和169例利福平敏感菌株、360例链霉素耐药菌株和53例链霉素敏感菌株、266例乙胺丁醇耐药菌株和32例乙胺丁醇敏感菌株、118例喹诺酮耐药菌株和128例喹诺酮敏感菌株、10例阿米卡星耐药菌株、25例卷曲霉素耐药菌株、15例阿米卡星和卷曲霉素交叉耐药菌株及30例双敏感菌株、31例对氨基水杨酸钠耐药菌株和65例对氨基水杨酸钠敏感菌株临床分离株相关基因进行PCR扩增及DNA测序分析。结果①303例耐异烟肼结核分枝杆菌有84.8%katG基因发生突变，97.4%突变集中在katG基因85-463密码子区，其中S315T位点最多占55.4%，而R463L位点在敏感菌株中突变达到80.3%高于耐药菌株62.7%(P<0.05)；inhA启动子区18.8%的点突变发生在-15(C→T)高于敏感菌株的4.9%(P<0.05)；在oxyR-ahpC间区突变菌株，异烟肼耐药菌株比例是9.6%高于敏感菌株的1.6%(P<0.05)。②在195例利福平耐药菌株中，168例（86.2%）rpoB基因发生突变，突变主要集中在531（41%）、526（22.5%）、516（9.7%）叁个位点，同时在27例多位点突变的菌株中，25例（92.6%）为利福平耐药菌株。③360例链霉素耐药菌株中，分别有71.7%rpsL基因和11.6%rrs基因发生突变，其中rpsL基因K43R和K88R位点突变比例分别是60.6%和11.1%，而rrs基因A1401G位点，其在耐药中比例（2.2%）少于敏感菌株（9.4%），两组间差异有统计学上意义（P<0.05）。④266例乙胺丁醇耐药菌株中，共检测到45.1%的embB基因突变菌株，98.3%突变发生在319-497密码子区，其中突变最多的位点是306位点（26.1%）。⑤在118例喹诺酮类耐药菌株中，共检测到74.6%的菌株gyrA基因突变，最常见是94位点（49.9%）和90位点（19.5%）⑥从tlyA基因突变结果显示，阿米卡星和敏感菌株均未发现突变株；卷曲霉素单耐药菌株有6株突变（24%），在阿米卡星和卷曲霉素交叉耐药菌株中有1例同义突变；A1401G在阿米卡星、卷曲霉素、阿米卡星和卷曲霉素交叉耐药菌株中突变比例10%、8%、13.3%；C1402T在阿米卡星、阿米卡星和卷曲霉素交叉耐药中各1例。⑦在31例对氨基水杨酸钠耐药菌株中，71%thyA基因发生突变，以第19位碱基C缺失和第168位碱基C缺失突变为主，在耐药菌株中的突变率分别是54.8%、25.8%，其敏感菌株中突变率也达了35.5%、12.3%，耐药与敏感相比两个位点突变差异均没有统计学意义（P>0.05）。结论本项研究进一步明确了北京地区结核分枝杆菌8种抗结核药物与相关基因之间的关系，有助于北京地区流行分子特点的研究及建立快速、特异、准确的药物敏感性分子诊断的方法。目的筛选左氧氟沙星（LFX）耐药和敏感的临床分离菌株，分析外排泵系统在LFX耐药的作用，并初步筛选LFX类药物的外排泵基因。方法采用刃天青的药敏检测方法，分析加入叁种泵抑制剂利血平（Res）、羰基氰氯苯腙（CCCP）和维拉帕米(Ver)前后最低抑菌浓度（MIC）的变化，并通过荧光定量PCR的方法检测药物刺激组和药物未刺激组对编码13种外排泵基因表达量的影响。结果筛选得到59例LFX耐药菌株和4例敏感菌株。在应用泵抑制剂之前，耐药菌株MIC大于2mg/l（包含2mg/l）的菌株共52株，MIC小于2mg/l菌株共7株；在应用泵抑制剂Res之后，耐药菌株MIC大于2mg/l菌株共43株，MIC小于2mg/l菌株共16株，应用泵抑制剂前后差异有统计学意义(X2=4.374，P<0.05)，MIC值降低2-16倍；在应用泵抑制剂CCCP之后，59株耐药菌株MIC值全部小于2mg/l，应用泵抑制剂前后差异有统计学意义(X2=970，P<0.05)，MIC值降低2-64倍；在应用泵抑制剂Ver之后，耐药菌株MIC大于2mg/l共菌株31株，MIC小于2mg/l菌株共28株，耐药率下降明显，应用泵抑制剂前后差异有统计学意义(X2=17.913，P<0.05)， MIC值降低2-64倍；同时泵抑制剂对4例敏感菌株外排泵系统也有不同程度的抑制作用，其中抑制剂CCCP和Ver作用最明显：应用泵抑制剂后仅有1株MIC值为2mg/l，而应用泵抑制剂Res后外排泵作用不明显。对59例LFX耐药菌株和4例LFX敏感的菌株gyrA和gyrB基因进行检测，45株（95.8%，45/47）突变中MIC值大于2mg/l，仅两株D94G突变菌株MIC值小于2mg/l。此外发现有12株耐药不突变的菌株，而63株结核分枝杆菌gyrB基因均未发现突变。12株耐药不突变的菌株MIC值结果显示，在应用CCCP泵抑制剂后，12株耐药菌株MIC值降低2-16倍；在应用Ver泵抑制剂，10株耐药菌株MIC值降低2-4倍，仅451和575菌株MIC值没有发生变化；在应用Res泵抑制剂后，729、777、896、838、529、642、325菌株MIC值降低2-4倍以上，其他5株在应用泵抑制剂后MIC值没有变化。在LFX药物刺激后，结果显示药物处理后有10种泵基因水平下降，其中Rv1348和Rv2686c下降比较明显，其基因水平分别是药物处理前的0.52和0.42倍。有叁个泵基因水平有所上升，分别是Rv2846c基因水平是药物处理前的1.21倍；Rv3239c基因水平是药物处理前的1.17倍；Rv2936基因水平是药物处理前的1.06倍。结论靶基因gyrA突变是喹诺酮的耐药的主要机制，而且其突变与喹诺酮高水平耐药相关。分枝杆菌的外排泵系统参与了喹诺酮耐药的发生，而泵抑制剂对外排泵系统有抑制作用，其中CCCP作用最明显。潜在的外排泵基因Rv2846c、Rv3239c和Rv2936在耐药菌株中表达上调，可能参与结核分枝杆菌耐喹诺酮药物的发生。
参考文献：
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[9]. 西安市耐异烟肼的结核杆菌耐药性及分子特征分析[J]. 周爱萍, 张敏, 李文侠, 张增贤, 沙莎. 中国现代医学杂志. 2018
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