【中图分类号】Ｒ１５【文献标识码】Ａ【文章编号】１６７２－３７８３（２０１５）０７－０１２５－０１【摘要】脱氧雪腐镰刀菌烯醉（ＤＯＮ）是一种霉菌毒素，也是谷物中的主要污染物之一，对农产品生产、人类健康、国际贸易交流和社会经济发展均有重要影响。
适宜的检测方法是确定毒素含量是否符合相关限量标准、制定谷物饲料和食品中毒素污染控制措施的关健。本文就脱氧雪腐镰刀菌烯醇的毒性特征，常用检测方法及最新研究进展进行综述。本文综述了脱氧雪腐镰刀菌烯醇的毒性及该毒素的分析方法，比较各自的优、缺点。
【关键词】脱氧雪腐镰刀菌烯醇，毒性，检测 ｌ前言脱氧雪腐镰刀菌烯醇（ｄｅｏｘｙｎｉｖａｌｅｎｏｌ，ＤＯＮ）又称呕吐毒素（ｖｏｍｉｔｏｘｉｎ），主要是由镰刀菌的某些种产生的化学结构和生物活性相似的有毒代谢产物———单端抱霉烯族化合物中的一种。ＤＯＮ的主要产生菌是禾谷镰刀菌，据报道也有其它一些镰刀菌可产生［１］。ＤＯＮ于１９７２年由日本的Ｍｏｒｏｏｋａ等首次分离，同年Ｙｏｓｈｉｚａｗａ等阐明了这种新的真菌毒素的结构，并将其命名为４－ｄｅｏｘｙｎｉｖａｌｅｎｏｌ（ＤＯＮ）。ＤＯＮ的化学名为３α，７α，１５－三羟基－１２，１３一环氧单端孢酶－９－烯－８酮，是一种Ｂ型单端孢酶烯族化合物，为一种倍半烯衍生物。ＤＯＮ分子量为２９６．３，分子式为Ｃ１５Ｈ２０Ｏ６，结晶为无色针状，熔点为１５１一１５３℃。ＤＯＮ易溶于水和极性溶剂，但不溶于正己烷和乙醚。乙酸乙酯和乙睛是长期储存最适合的溶剂。ＤＯＮ耐热、耐压，弱酸中不分解，加碱及高压处理可以破坏其部分毒力。２ＤＯＮ的毒理ＤＯＮ广泛存在于全球，主要污染小麦、大麦、玉米等谷类作物，也污染粮食制品，人和动物在误食被该毒素污染的粮谷类后可以产生广泛的毒性效应。另外，它还常与其它的霉菌毒素如黄曲霉毒素共同污染农作物，进入人体后可以相互影响。ＤＯＮ在体内可能有一定的蓄积，但无特殊的靶器官，具有很强的细胞毒性。人畜摄人了被ＤＯＮ污染的食物后，会导致厌食、呕吐、腹泻、发烧、站立不稳和反应迟钝等急性中毒症状，严重时损害造血系统造成死亡。另外ＤＯＮ对免疫系统有影响，有明显胚胎毒性和一定致畸作用，可能有遗传毒性，但无致癌、致突变作用。但对免疫毒性研究结果冲突较多，尚无确凿的证据。２．１对动物的毒性低剂量ＤＯＮ，主要引起动物的食欲下降，体重减轻、代谢紊乱等症状，大剂量可导致呕吐。动物对ＤＯＮ的反应有种属和性别差异，雄性动物对毒素比较敏感，猪比小鼠、家禽和反当动物更敏感。对于不同动物的半致死剂量（ＬＤ５０）和致吐剂量如表１所示。
２．２对人的毒性人误食ＤＯＮ以后急性中毒症状一般出现在０．５ｈ后，快的可在１０ｍｉｎ后出现，主要症状是头昏、腹胀、恶心、呕吐，以及白细胞缺乏症，一般在２ｈ后可自行恢复。老人和幼童，或大剂量中毒者，症状较重，呼吸、脉搏、体温及血压均略有升高，但未见死亡。２．３对细胞的毒性ＤＯＮ具有很强的细胞毒性，它对于原核细胞、真核细胞、植物细胞和肿瘤细胞等均具有明显的毒性作用。它对于生长较快的细胞如胃肠道黏膜细胞、淋巴细胞、胸腺细胞、脾细胞和骨髓造血细胞等均有损伤作用，并且可以抑制蛋白的合成。研究发现，ＤＯＮ可明显抑制猪卵母细胞的成熟，同时ＤＯＮ还可使培养的猪子宫内膜细胞减少，一些细胞出现了线粒体肿胀、细胞膜破裂和细胞浆空泡化等细胞死亡的表现。另外，ＦＣＭ检测表明ＤＯＮ影响细胞周期的分布，抑制细胞进入Ｓ期，使细胞阻停滞在Ｇ０／Ｇ１期，具有明显的抗增殖作用［２］。２．４对免疫功能的影响ＤＯＮ污染粮谷类的情况相当普遍，其对免疫功能的影响已受到了医学工作者的重视。近年来，随着分子生物学技术的发展，ＤＯＮ对免疫系统的影响引起人们极大的兴趣。ＤＯＮ既是一种免疫抑制剂，又是一种免疫促进剂，其作用与剂量和作用时间有关［３］。ＤＯＮ对免疫系统的毒作用主要表现在具有明显的急性和慢性毒性作用，引起食欲下降、呕吐、体重减轻和代谢紊乱；在细胞水平有明显的细胞毒作用，引起细胞的损伤；根据浓度和作用时间不同，对免疫细胞因子既可表现为抑制，又可表现为超诱导；可诱导并促进免疫细胞的凋亡、抑制其增殖；促进ＩｇＡ分泌，抑制ＩｇＭ和ＩｇＧ的分泌。３ＤＯＮ的提取、纯化与定量检测方法３．１ＤＯＮ的提取ＤＯＮ可用纯水或乙睛－水、甲醇－水、ＰＥＧ水、氯仿－甲醇－水、氯仿－乙醇－水进行提取。提取溶液的优劣主要是根据回收率判断的。１９８５年Ｔｒｅｈｏｌｍ评估提取方法发现天然污染的样品比加样样品需更长的提取时间，因此推荐在可能的条件下回收率应以天然污染的样品为参照，并证实采用乙睛－水比采用甲醇－水的回收率更高。目前采用较多的是８４：１６的乙睛－水溶液［４］。
超临界流体抽提取法（ｓｕｐｅｒｃｒｉｔｉｃａｌｆｌｕｉｄｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ，ＳＦＥ）是一种提取和纯化同步进行的快速方法，与以上的传统方法相比不需要使用大量的有潜在危险的有机溶剂，只需使用无毒的ＣＯ２，可实现抽提和净化同步完成，但ＳＦＥ用于天然污染的样品回收率不高［５］。３．２ＤＯＮ的净化ＤＯＮ的净化方法主要有液液分配、固相萃取、柱层析、或使用免疫亲和层析柱、多功能净化柱Ｍｙｃｏｓｅｐ２２５。对检测有干扰作用的醋在必要的情况下可通过用己烷、石油醚或非极性溶剂在净化前脱脂。３．２．１液液分配常在装有互不相溶的２种液体的分液漏斗中加人样品提取物振荡而使之得以净化。这种情况下水相支持物为柱中固体亲水基质，加人有机溶剂让其随柱体流下即可将净化的毒素洗脱下来。３．２．２固相萃取这是使用最为广泛的真菌毒素净化方法。目前，专用于霉菌毒素分离纯化的固相萃取产品有两类：一是多功能净化柱（ＭＦＣ），它是一种特殊的ＳＰＥ柱，以极性、非极性及离子交换等几类基团组成填充剂，可选择性吸附样液中的脂类、蛋白类等杂质，而ＤＯＮ不被吸附而直接通过。其最大优势是操作更为简便，无需固相提取中耗时的活化、淋洗和洗脱操作过程，直接上样，一次性净化。市售的多功能净化柱有多种型号，其中Ｍｙｃｏｓｅｐ１１３，Ｍｙｃｏｓｅｐ２２５和Ｍｙｃｏｓｅｐ２２７柱均适用于ＤＯＮ等单端抱霉烯族真菌毒素的净化处理［６－７］。ＭＦＣ常与ＨＰＬＣ或ＧＣ联用，回收率大于８０％。二是免疫亲和柱（ＩＡＣ），它是将特异性的毒素抗体与适当的固定相结合填柱而成，特异性强，灵敏度较高，但价格较贵。美国ＶＩＣＡＭ（维康）公司等最新开发了一系列以单克隆免疫亲和柱为分离手段，用荧光计、紫外灯作为检测工具的分析方法。该法的、最大优势是分析速度快，灵敏度高，分离效率和回收率高，不需要剧毒的真菌毒素标准物来标定，安全可靠。３．３ＤＯＮ的检测技术ＤＯＮ的分离检测可用多种不同的方法，如薄层色谱法、酶联免疫吸附试验、气相色谱、高效液相色谱、超临界流体色谱法和毛细管电泳色谱等。ＤＯＮ的检测可用多种不同的方法，如薄层色谱法、酶联免疫吸附试验、气相色谱、液相色谱等。近年来有些学者把近红外光谱分析、荧光极性免疫分析用于ＤＯＮ的检测，但存在一定的问题，有待进一步的研究优化。３．３．１薄层色谱法（ｔｈｉｎｌａｙｅｒｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，ＴＬＣ） ＴＬＣ是最早建立的一种检测方法，具有简便、经济、对设备和检验人员要求不高等特点。随着高效薄层色谱法（ｈｉｇｈｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｔｈｉｎｌａｙｅｒｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ， ＨＰＴＬＣ）以及薄层扫描仪的应用，ＴＬＣ的分离效率和精确度都得到提高，由此拓宽了ＴＬＣ技术在检测真菌毒素领域中的应用，该法目前仍是除北美和欧洲以外其他国家，尤其是发展中国家检测食品和饲料中真菌毒素的常规方法。３．３．２酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ） ＥＬＩＳＡ是以免疫抗体为基础的免疫检测技术，具有高选择性、灵敏、快速、方便等特点。另外，采用ＥＬＩＳＡ检测的样品通常不需要净化，即使要净化也是最低程度的。因此克服了仪器分析样品处理繁复、仪器使用成本高的局限，是一类快速、灵敏且操作简单的分析方法，在毒素和有毒化合物等小分子化合物的检测中应用已十分广泛，目前已建立多种分析各类农产品和食品中真菌毒素的ＥＬＩＳＡ方法。
目前快速检测ＤＯＮ等霉菌毒素的商品化ＥＬＩＳＡ试剂盒已被广泛用于实际工作中，从而优化了检测手段，但价格较高。ＥＬＩＳＡ的主要缺点是由于存在所用抗体与ＤＯＮ的乙酰化类似物的交叉反应致使其检出值偏高，较易出现假阳性。３．３．３气相色谱法（ｇａｓｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｙＧＣ）运用气相色谱检测ＤＯＮ需要通过ＤＯＮ上的三个羟基使之衍生成为七氟丁酞（ｈｅｐｔａｆｌｕｏｒｏｂｕｔｙｒｙｌ，ＨＦＢ）、三氟乙酞（ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｙｌ，ＴＦＡ）或三甲基硅烷（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｙｌ，ＴＭＳ）化衍生物。ＤＯＮ要形成三甲基硅烷衍生物可用以下的试剂：Ｎ， Ｏ一双三甲基硅烷乙酞胺（Ｎ，Ｏ－ｂｉｓ－（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｙｌ）ａｃｅｔａｍｉｄｅ，ＢＳＡ）、三甲基氯化硅烷（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｃｈｌｏｒｏｓｉｌａｎｅ，ＴＭＣＳ）或三甲基硅咪哇（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｅ， ＴＭＳＩ），但用单一的试剂由于不完全衍生会产生两个峰，这可以通过使用他们的混合物如Ｔｒｉ－ｓｉｌＴＢＴ或ＳｙｌｏｎＢＴＺ［含（４０士５）％的ＴＭＳＩ、（３５土５）％的ＢＳＡ和（２５土５）％的ＴＭＣＳ〕避免。比较实验表明，ＴＭＳ衍生比氟酰化衍生对ＤＯＮ专一性强，背景干扰更少［８］；但ＤＯＮ经氟酰基化后进行ＧＣ－ＥＣＤ分析比经三甲基化的效果好；氟酰基化试剂中七氟丁酸酐（ｈｅｐｔａｆｌｏｒｏｂｕｔｙｒｉｃａｎｈｙｄｒｉｄｅ，ＨＦＢＡ）能提供最低的最低检出限——— ３．５ｎｇ／ｇ［５］，但ＨＦＢＡ不仅价格昂贵，而且易挥发。ＧＣ具有灵敏、高选择性、准确性和精确性等优点。另外，用ＧＣ还能实现对８种真菌毒素（单端抱霉烯族化合物和玉米赤霉菌烯醇）的同时检测。但Ｐｅｔｔｅｒｓｓｏｎ的研究表明［４］色谱中存在如下问题：标准曲线线性关系不好、响应漂移、上一次进样样品的滞留和记忆效应、ＭＳ检测时重复进样变异系数大以及存在基质干扰等问题。所以说，虽然自１９８６年以来ＡＯＡＣ就有一种ＧＣ方法能在大于３５０ｎｇ／ｇ的水平上检测小麦中的ＤＯＮ含量，但应用ＧＣ方法分析ＤＯＮ有待标准化以减少ＧＣ分析中出现的问题。３．３．４高效液相色谱法ＨＰＬＣ具有ＧＣ所具有的灵敏、高选择性、准确性和精确性等优点，同时能克服ＧＣ中难以解决的问题，近年来越来越广泛的被使用。１９９８年Ｔｒｕｃｋｓｅｓｓ的一种用乙睛－水提取、Ｍｙｃｏｓｅｐ２２５净化、紫外光下在于２２０ｎｍ处检测小麦、面粉、麸皮中ＤＯＮ的ＨＰＬＣ方法，经ＡＯＡＣ的三个实验室验证而被采用。德国农业调查与研究部署协会（ＶｅｒｂａｎｄＤｅｕｔｓｃｈｅｒＬａｎｄｗｉｒｔｓｃｈａｆｔｌｉｃｈｅｒｔＵｎｔｅｒｓｕｃｈｕｎｇｓａｎｄＦｏｒｓｃｈｕｎｇｓａｎｓｔａｌｔｅｎ，ＶＤＬＵＦＡ）分析ＤＯＮ的标准方法也是采用ＨＰＬＣ。ＤＯＮ经ＨＰＬＣ分离后可用荧光检测器（ｆｌｕｏｅｒｓｃｅｎｃｅｄｅｔｅｃｔｏｒ，ＦＬＤ），紫外拉测器（ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔｄｅｔｅｃｔｏｒ，ＵＶ）、二极管阵列检测仪（ｄｉｏｄｅａｒｒａｙｄｅｔｅｃｔｏｒ，ＤＡＤ）检测。实验证明［５］，ＤＡＤ比ＦＬＤ的效果好，不需衍生；ＤＡＤ最低检出限比ＦＬＤ要低；ＤＡＤ检测比ＦＬＤ响应强。
随着ＬＣ－ＭＳ和ＬＣ－串联ＭＳ仪价格下降，这种技术已越来越广泛的用于样品中ＤＯＮ含量的检测，特别是使用气压流化学电离介面（ａｔｍｏｓｐｈｅｒｉｃｐｒｅｓｓｕｒｅｃｈｅｍｉｃａｌｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ，ＡＰＣＩ）的ＬＣ－ＭＳ已用于包括ＤＯＮ在内的单端孢酶烯族化合物的检测和鉴定［９］。４展望就提取而言，８４：１６的乙睛一水溶液提取较其他方法提取回收率高；ＳＦＥ能实现提取与净化的同步化，但此法用于天然污染的样品回收率较低。净化方法中用Ｍｙｃｏｓｅｐ２２５或免疫亲和层析作净化处理回收率较高，净化后再用ＧＣＥＣＤ或ＭＳ测定是一种很灵敏的分析方法，适合于谷物，甚至成分更复杂食品和饲料中ｎｇ／ｇ级ＤＯＮ的测定。由于目前最广泛应用于ＤＯＮ检测的ＧＣ法存在变异系数大等问题，因而ＨＰＬＣ特别是与柱后衍生联用的ＨＰＬＣ有望替代ＧＣ。对于设备不够齐全的实验室，ＴＬＣ仍是检测谷物中ＤＯＮ的一种简便方法。虽然市售ＥＬＩＳＡ试剂盒相当昂贵，但它仍不失为一种检测ＤＯＮ的好方法。随着色谱联用技术的迅速发展，气相色谱一质谱联用仪（ＧＣ－ＭＳ），特别是分析速度更快和相对简单的样品前处理的液相色谱－质谱联用仪（ＬＣ－ＭＳ）等一些多功能商品化的精密分析仪器的问世，可以将真菌毒素的分离、定量检测和确证整合起来，实现联机、在线的快速准确检测。虽然目前色谱－质谱联用技术还存在样品中化学基质和生物学基质干扰等问题，但作者认为这应该是真菌毒素检测技术发展的主要方向。ＤＯＮ毒素因其在世界范围内具有较高的污染率而引起人们的普遍关注，人们对谷物中的ＤＯＮ检测进行了各种尝试，方法各异，每一种方法都有其优缺点，许多方法尚有待于标准化，这对建立与国际接轨的相关国家标准及有效执法等方面都有重要的意义。
参考文献［１］孟昭赫．食品卫生学检验方法注解，微生物学部分．北京：人民卫生出版社， １９９０，２８。
［２］ＴｉｅｍａｎｎＵ，ＶｉｅｒｇｕｔｚＴ，ＪｏｎａｓＬ，ｅｔａｌ．Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｏｆｔｈｅｍｙｃｏｔｏｘｉｎｓａｌｐｈａ－ａｎｄｂｅｔａ－ｚｅａｒａｌｅｎｏｌａｎｄｄｅｏｘｙｎｉｖａｌｅｎｏｌｏｎｔｈｅｃｅｌｌｃｙｃｌｅｏｆｃｕｌｔｕｒｅｄｐｏｒｃｉｎｅｅｎｄｏｍｅｔｒｉａｌｃｅｌｌｓ．ＲｅｐｒｏｄＴｏｘｉｃｏｌ，２００３，７：２０９一２１８．［３］李月红，张祥宏，王俊灵，等．脱氧雪腐镰刀菌烯醇对小鼠胸腺细胞凋亡和增殖的影响．中国病理生理杂志，２００２，１８：７７８一７８１．［４］ＭａｔｅｏＪＪ，ＬｌｏｒｅｎｓＡ，ＭａｔｅｏＲ，ｅｔａｌ．ＣｒｉｔｉｃａｌｓｔｕｄｙｏｆａｎｄｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔｓｉｎｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃｍｅｔｈｏｄｓｆｏｒｔｈｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｙｐｅＢｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｅｎｅｓ．ＪＣｈｒｏｍａｔｏｇｒＡ，２００１，９１８：９９－１１２．［５］ＪｏｓｅｐｈｓＲＤ，ＫｒｓｋａＲ，ＧｒａｓｓｅｒａｕｅｒＭ．Ｂｒｏｅｒｋｅｒｔ，Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｅｎｅｍｙｃｏｔｏｘｉｎｓｉｎｗｈｅａｔｂｙｕｓｅｏｆｓｕｐｅｒｃｒｉｔｉｃａｌｆｌｕｉｄｅｘｔｒａｃｔｉｏｎａｎｄｈｉｇｈ－ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｌｉｑｕｉｄｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙｗｉｔｈｄｉｏｄｅａｒｒａｙｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｒｇａｓｃｈｒｏｍａｇｒａｐｈｙｗｏｔｈｅｌｅｃｔｒｏｎｃａｐｔｕｒｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎ．ＪＣｈｒｏｍａｔｏｇｒＡ，１９９８，７９５：２９７－３０４．［６］隋凯，李军，卫锋，多功能柱净化－高效液相色谱法同时检测小麦中雪腐镰刀菌烯醇和脱氧雪腐镰刀菌烯醇［Ｊ］．分析测试学报．２００６，２５（３）：５６－５９．［７］隋凯，李军，卫锋，赵守成．谷物中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的高效液相色谱检测及质谱确证［Ｊ］．分析化学研究简报，２００５，３３（１１）：１６４３－１６４６．［８］ＫｒｓｋａＲ，ＢａｕｍｇａｒｔｎｅｒＳ，ＪｏｓｅｐｈｓＲ．ＴｈｅＳｔａｔｅ－ｏｆ－ｔｈｅａｒｔｉｎｔｈｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｙｐｅ－Ａａｎｄ－Ｂｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｅｎｄｍｙｃｏｔｏｘｉｎｓｉｎｃｅｒｅａｌｓ．ＦｒｅｓｅｎｉｕｓＪＡｎａｌＣｈｅｍ， ２００１，３７１：２８５－２９９．［９］ＢｅｒｇｅｒＢ，ＯｅｈｍｅＭ，ＫｕｈｎＦ．ＱｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎａｎｄｓｔｒｕｃｔｕｒｅＥｌｕｃｉｄａｔｉｏｎｏｆｔｙｐｅＡ"ａｎｄＢ"ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｅｎｅｓｂｙＨＰＬＣ／ｉｏｎｔｒａｐｍｕｌｔｉｐｌｅｍａｓｓ．ＪＡｇｒｉｃＦｏｏｄＣｈｅｍ，１９９９，４７（１０）：４２４０－４２４５．
论文作者:马晓年 李文廷 张瑞雨
论文发表刊物:《健康必读》2015年第7期供稿
论文发表时间:2015/8/17
标签：毒素论文; 细胞论文; 方法论文; 镰刀论文; 毒性论文; 色谱论文; 免疫论文; 《健康必读》2015年第7期供稿论文;