王萍[1]2002年在《大豆组织培养体系优化与双价抗虫基因遗传转化的研究》文中指出以55个东北地区主栽和国外引入大豆基因型的未成熟子叶、真叶、子叶节和下胚轴为外植体，用高浓度的生长素诱导大豆体细胞胚胎发生与植株再生，对影响大豆体细胞胚胎发生的因子大豆基因型、外植体种类、生长素种类与浓度、低温预处理时间，以及与大豆体细胞胚胎发生率有关的性状的相关性进行了研究；诱导大豆次生胚产生，探讨了与胚性组织增殖、萌发和再生植株有关的因子，优化了大豆组织培养再生体系。 以大豆未成熟子叶和胚性组织为受体，用农杆菌和基因枪两种方法对大豆进行Bt基因和CpTI基因双价抗虫基因的遗传转化，经PCR和PCR—Southern分析证明双价抗虫基因被转入到大豆中，并对影响遗传转化的因子进行了研究，主要研究结果如下： 1．以未成熟子叶为外植体成功地诱导了54个大豆基因型体细胞胚胎发生，占被诱导基因型的98.18％。在黑龙江、吉林和辽宁叁省主栽的大豆基因型中筛选出体细胞胚胎发生率在50％以上的基因型8个。大豆未成熟子叶是诱导体细胞胚胎发生最好的外植体，以高浓度的2，4-D诱导体细胞胚胎发生效果更好。在诱导大豆体细胞胚胎发生时基因型间存在较大的差异，体细胞胚胎发生率在0～85.83％之间。 2．建立了适合于东北地区大豆品种未成熟子叶体细胞胚胎发生与植株再生的组织培养体系，培养基成份、生长素的种类和浓度、低温预处理时间等因子对大豆不同品种的体细胞胚胎发生率均有影响。MS培养基附加高浓度的2，4-D，加或不加有机物(脯氨酸和腺嘌吟)，在接种前将大豆幼荚在4℃低温预处理3～4d，可提高大豆未成熟子叶体细胞胚胎发生率。接种时大豆未成熟子叶以3～5mm为宜，并与大豆品种的生育期有关，早、中熟品种在大豆开花16～20 d取荚，晚熟品种在大豆开花20～24 d取荚可获得较高的体细胞胚胎发生率。 3．构建了以大豆未成熟子叶为外植体诱导生产上大面积栽培的大豆品种产生次生胚，在固体培养基上增殖胚性组织，并再生结实植株的组织培养新体系，研究中发现胚性组织的增殖与2，4-D浓度和光照条件有关。 4．深入、系统地研究了抗生素对大豆品种生长发育的抑制作用。卡那霉素作为抗性选择标记所需浓度因不同大豆品种、不同外植体(真叶、子叶节、下胚轴、未成熟子叶和胚性组织)、外植体不同发育阶段(体细胞胚胎发生、胚萌发和再生植株)而各异，变化范围为25～100mg／L。不同根癌农杆菌菌株在侵染大豆不同外植体后所需脱菌剂的种类和浓度亦不同，LBA4404的最佳脱菌剂为头孢霉素，浓度依外植体的不同为200～500mg／L。 5．用农杆菌介导法对生产主栽大豆品种吉林35、吉林43和合丰35未成熟子叶进行了遗传转化，诱导体细胞胚胎发生和植株再生，移栽成活15株，12株PCR检测呈阳性反应，用地高辛标记Bt基因探针进行PCR-Southern分析，12株均呈阳性，证明Bt基因已整合到大豆基因组中，转化率依大豆品种、农杆菌菌液浓度、侵染时间和共培养时间不同变化在0～2.00％之间，平均转化率为0.56％。农杆菌介导的大豆遗传转化率主要博士学位论文 大豆组织培养体系优化与双价抗虫基因遗传转化的研究 东北农业大学受大豆基因型、共培养时间的影响，吉林43易于农杆菌介导的遗传转化，共培养时间以1～2 d为宜。胚性组织农杆菌介导的遗传转化得到了 GUS基因的稳定表达，经PCR检测证明，首次将BZ和巾TI双价抗虫基因转入大豆细胞中。 6．基回枪轰击大豆未成熟子叶和胚性组织得到了GUS基因的表达，发现轰击后适当地延长大豆未成熟子叶在后高渗培养基中停留时间可提高基因枪转化效率。
王晓春[2]2003年在《大豆体细胞胚再生体系的优化与双价抗虫基因的遗传转化》文中研究表明本文对东北地区主栽大豆东农L13、合丰25等5个品种的体细胞胚再生体系及遗传转化体系进行了优化研究，并应用农杆菌介导法和基因枪法对其进行了双价抗虫基因(Bt和CPTI)的遗传转化。 对大豆体细胞胚的继代增殖、萌发及再生等进行了研究，优化了大豆体细胞胚基因转化受体体系。结果表明，MS培养基附加10-20mg／L2，4-D可以使大豆体细胞胚继代增殖，扩繁系数为3~n(n为继代次数)。体细胞胚形态正常，体细胞胚干燥处理以及高浓度的蔗糖和活性炭均可以提高大豆体细胞胚的萌发率和再生率。 确定了筛选剂卡那霉素的使用浓度，生根以前100mg／L，生根以后降为25mg／L。也确定了抑菌剂头孢霉素的使用浓度，第一次为300mg／L，以后每继代一次，降低100mg／L，直至降为0。 用农杆菌介导法和基因枪法对大豆体细胞胚进行了遗传转化，并利用大豆抗性体细胞胚筛选频率对转化体系的因子进行了优化。结果表明，用农杆菌介导法转化时，用球形体细胞胚受伤处理作为受体、预培养1.5天、菌液浓度以OD_(600)=0.5-0.7、AS浓度为50-100μmol／L、侵染时间10分钟、共培养时间2-3天，有利于转化；用基因枪轰击时，氯化钙浓度2.5mol／L、氦气压力1100Psi、轰击次数为2次，有利于提高转化率。 应用Gus瞬时表达检测对转化以后3-7天的体细胞胚进行检测，表面有蓝点出现，初步证明目的基因已经转入大豆体内。对移栽成活的抗性植株应用PCR检测，用农杆菌介导法共得到5株阳性植株，其中东农L13阳性植株2株，CH21141和合丰25以及Progress各1株，转化率为0.72％，黑农35和东农40没有得到阳性植株；用基因枪法共得到2株阳性植株，转化率为0.50％。初步证明双价抗虫基因Bt和CPTI已经转入大豆体内。PCR-Southern以及斑点杂交分子检测证实了PCR的结果，进一步证明双价抗虫基因Bt和CPTI已经整合进大豆基因组中。
杨超[3]2009年在《大豆植株再生和遗传转化技术体系的研究》文中进行了进一步梳理大豆[Glycine max (L.) Merr.]起源于我国,在中国已有五千年左右的栽培历史,它也是世界上重要的粮食和油料作物之一,是人类食物中植物蛋白质和油脂的主要来源,与人们的日常生活息息相关。鉴于大豆的重要性,人们一直利用传统育种手段来提高大豆的产量。由于受物种间杂交不亲和性及不良连锁等因素影响,使常规育种方法的应用受到限制。近年来,随着生物技术的飞速发展,尤其是植物基因工程技术的日趋成熟,为大豆的品种改良提供了新的途径,大豆再生和遗传转化技术体系成为当前研究的热点和重点。大豆的组织培养再生主要有器官发生和体细胞胚发生两种诱导途径,两种发生途径具有不同的遗传基础,同时需要与不同的遗传转化方法结合进行转基因工作。本研究拟对大豆器官发生和体细胞胚发生两种再生途径分别进行植株再生技术、再生特性遗传基础以及相应遗传转化方法的研究,由于时间和条件的限制,部分实验未取得成功结果。目前所获的主要内容包括大豆的器官发生、体细胞胚胎发生和植株再生；大豆再生能力相关性状的QTL定位；大豆体细胞胚胎受体蛋白激酶基因的克隆和功能鉴定；农杆菌介导的大豆子叶节遗传转化体系的优化和应用。取得的主要研究结果如下：1.大豆植株再生技术体系方面：(1)以大豆子叶节为外植体对25份资源进行再生能力和丛生芽诱导培养基激素组合进行筛选,结果发现不同品种问再生频率有很大差异,其中N23676、N25277和N00060相对较高,分别是90.35%、86.53%和84.48%；添加不同激素种类(6-BA、2,4-D和TDZ)的丛生芽诱导培养基对大豆子叶节的丛生芽诱导率也不同,只添加1.67mg/L 6-BA就可以得到较高的丛生芽诱导率。(2)以大豆未成熟子叶为外植体对98份中国大豆资源进行了体细胞胚胎发生能力的筛选,同时研究了不同甘露醇浓度、不同ABA浓度和不同外植体大小等叁个因子对大豆体细胞胚胎发生能力和植株再生能力的影响,结果发现不同基因型之间体细胞胚胎发生能力具有明显差异,基因型N25281、N25263和N06499具有较高的体细胞胚发生能力；选取4-5mm大小的外植体,基本培养基添加5mg/L ABA和3.0%甘露醇的组合可以提高大豆的体细胞胚胎发生能力,基因型N25281表现出较高的再生率(82.95%),平均每个外植体出苗数为1.35。2.大豆再生特性的遗传基础：(1)利用国家大豆改良中心提供的重组自交家系群体(NJRIKY),开展了大豆幼胚培养再生能力的QTL遗传定位研究。该群体的遗传图谱该群体的遗传图谱共整合了834个标记,分布在24个连锁群上,覆盖大豆基因组2307.83cM,每个连锁群上平均34.75个标记,标记间的平均距离为2.77cM。选用大豆愈伤组织诱导率和体细胞胚诱导率作为反映大豆幼胚培养再生能力的评价指标,采用复合区间作图法(CIM)进行QTL分析,结果共检测到3个与出愈率有关的QTL,位于B2和D2连锁群上,可解释5.84%-16.60%的表型变异；检测到4个与体细胞胚诱导率有关的QTL,全部位于G连锁群上,对表型性状变异的解释率为7.79%-14.16%。大豆幼胚培养再生性状的QTL定位研究为大豆再生性状的改良提供了标记辅助选择的依据。(2)从大豆中克隆了1个编码体细胞胚发生相关的类受体蛋白激酶(GmSERK1)基因,该基因编码624个氨基酸,与其它的SERK蛋白具有很高的同源性,其中包括有SP、ZIP、SPP、TM、LRR、胞内激酶活性结构域以及C端结构域,同时该基因也具有与其它SERK家族基因相似的内含子/外显子结构特征。系统发育分析表明植物SERK蛋白有叁个分支,GmSERK1蛋白所在的分支主要由双子叶植物组成,该蛋白与豆科模式植物蒺藜苜蓿中的MtSERK1蛋白亲缘关系最近。Southern blot分析表明GmSERK1基因在大豆基因组中有1个拷贝。组织表达谱分析表明GmSERK1基因在叶、花芽和未成熟子叶中有表达,但是在根和茎中基本上不表达。在体细胞胚发生过程中,GmSERK1基因在早期培养时就有表达,在15天时达到最高点,15天后该基因的表达量反而开始降低,同时该基因在胚状物中有很高的表达量,而在非胚状物中检测不到表达。诱导表达分析表明在受到甘露醇、ABA.JA和SA等处理后,GmSERK1基因的表达方式不尽相同。采用Gateway技术构建了GmSERK1基因与GFP融合的过量表达载体并利用洋葱表皮细胞瞬时表达方法对GmSERK1蛋白进行了的定位研究,结果表明该蛋白被定位到细胞膜上,属于膜结合蛋白。3.大豆遗传转化技术体系：对影响农杆菌介导大豆子叶节遗传转化体系的主要因素进行了研究,包括外植体侵染时间、共培养时间、超声波处理以及AgNO3处理等,结果表明30分钟侵染时间、共培养3天和10秒超声波处理可以提高转化效率,在丛生芽诱导培养基中加入2mg/LAgNO3可以提高丛生芽诱导率；利用该遗传转化方法,将编码逆向转运蛋白的小麦TaNHX2基因导入大豆,PCR检测结果显示TaNHX2基因已经整合到了大豆基因组中,在250mmol/L NaCl溶液处理下发现非转化大豆植株表现出叶片变黄迹象逐渐死亡,而转基因植株则生长正常,以上结果表明TaNHX2基因可以提高了大豆的耐盐性。同时,利用Gateway技术构建了GmFAD2-3基因的RNAi表达载体,为利用转基因技术改良大豆脂肪酸品质奠定了基础。
马晓红[4]2008年在《大豆高效整个子叶节再生体系的建立及根癌农杆菌介导的双价抗虫基因在大豆上的转化》文中研究指明大豆是世界上重要的油料作物以及植物蛋白来源之一,因此大豆基因工程育种具有重要的意义。实验采用一种新的技术方法即大豆整个子叶节为外植体,利用直接芽再生方式建立了一种新的快速有效的再生体系,并在此平台上用双价抗虫基因对大豆进行了遗传转化。成熟大豆种子消毒后在添加BA 0.4 mg L-1的MSB5培养基中培养了5~7 d得到无菌苗,切取整个子叶节外植体,将外植体转入不同芽诱导培养基中培养14 d后,转入MSB5培养基上进行芽伸长培养,至芽伸长到3~4 cm,转至含有IBA 0.5 mg L-1的MSB5培养基上进行生根培养,炼苗并移栽到温室得到可育植株。实验中,对芽的形态发生过程以及细胞内淀粉和蛋白质含量的相对变化进行了观察分析,发现分生细胞内蛋白质含量随着芽发育的不同阶段呈周期性变化;研究了BA或CPPU对大豆整个子叶节芽诱导的作用,确定了BA在整个子叶节芽诱导过程中效果好于CPPU;利用正交设计方法对叁种植物激素以及大豆基因型对芽诱导的影响进行研究,结果表明,BA、KT、IBA对芽诱导效果都有极显着影响,其中BA的影响最大,大豆品种合丰25在MSB5 + BA 3.0 mg L-1 + IBA 0.2 mg L-1 +KT 0.5 mg L-1的培养基中诱导出芽效果最好,每个外植体可以得到30~35个芽,并且大部分芽都可以伸长并生根。为了验证新建立的再生体系的效果,将此再生体系与传统的大豆子叶节再生体系、近几年应用较多的大豆胚尖再生体系在再生频率、出芽数目、芽伸长情况以及再生周期等方面进行研究比较,结果表明,大豆整个子叶节再生体系在外植体再生频率以及出芽数量上优于其它两种体系。本实验尝试采用大豆整个子叶节为外植体建立了一种快速有效的再生体系,与子叶节、胚尖再生体系相比较,提高了再生效率和不定芽的数量,减小了品种特异性对大豆再生体系的影响,并且大大缩短了再生周期。研究结果表明,使用这个再生平台,再生效率达到95%以上,可以在60天内获得大量的再生小苗。利用根癌农杆菌介导的转化方法对叁个大豆品种的整个子叶节外植体进行双价抗虫基因的遗传转化,并对转化体系中几个因素进行优化,建立了基于整个子叶节再生平台的大豆遗传转化体系。结果表明,不同农杆菌菌株对大豆的转化效率不同,EHA105的转化效率高于LBA4404和GV3101;不同大豆品种对农杆菌浸染的敏感性存在差异,其中合丰48的效果较好;转化过程中采用Cef 300 mg L-1 + Cb 200 mg L-1和PPT 5.0 mg L-1进行除菌和筛选,效果较好。应用这个转化体系,转化频率在5.50%~12.07%之间。经过分子验证以及抗除草剂、抗蚜虫实验证明,外源基因已经整合到大豆基因组中,T1代遗传分析结果表明外源基因在后代中可以稳定遗传和表达,并对大豆蚜虫具有较强的抗性。实验证明,大豆整个子叶节再生体系可以有效地用于农杆菌介导的遗传转化并得到稳定表达的转基因植株。
高耸巍[5]2007年在《农杆菌介导的双价抗虫基因转入大豆的研究》文中认为大豆生育期间受害虫侵害严重,常给大豆生产造成巨大损失。大量喷施化学杀虫剂,不仅会增强害虫的抗药性,使益虫及其它生态区系遭受破坏,而且严重污染环境,提高生产成本,破坏生态平衡。常规育种及栽培技术由于育种年限长,遗传资源有限,抗虫机制不甚明了,以及害虫新生物型的发展导致抗性不稳定等原因已有一定的局限性,收效不大。因此利用植物基因工程技术使大豆达到抗虫的目的受到密切关注。本文利用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导法将含有豇豆胰蛋白酶抑制剂基因(CpTI)和人工合成的GFM CryIA B.t杀虫基因的双价抗虫基因植物表达载体pGBI121S 4ABC用于栽培大豆品种“吉林20号”、“吉林27号”的转化。未成熟子叶诱导的体细胞胚经与农杆菌共培养,在筛选培养基上获得抗性胚体并萌发成可育转化植株。经PCR鉴定,GUS酶活性检测证实,外源抗虫基因存在于再生植株的细胞中。
倪萌[6]2008年在《农杆菌介导法转hpalxoo基因棉花再生植株建立及转hpalxoo基因棉细胞组织抗病表型鉴定》文中指出棉花黄、枯萎病是危害棉花维管组织的两种真菌类病害,在全国棉区均有分布,它们通过病原真菌堵塞导管、产生毒素等多种形式危害棉株。在棉花生长前期可造成死苗,中后期引起蕾铃脱落,导致产量、品质严重下降。培育和推广转基因抗病品种是防治棉花黄、枯萎病简单易行且行之有效的方法。Harpin蛋白是由植物病原细菌产生的富含甘氨酸、对热稳定但对蛋白酶K敏感的一类蛋白。它在非寄主植物上能够引起过敏反应,而且很可能是植物病原细菌的一个重要的致病因子。另外,harpin蛋白还能够诱导植物产生病虫抗性以及提高作物的产量与品质。农杆菌介导法转hpa1xoo基因棉花再生植株的建立。本实验以中棉所35号为转化受体品种,采用农杆菌介导法将来自水稻白叶枯病菌(Xanthomonas. oryzae pv. oryzae)的hpalxoo基因全长hpalxoo和其缺失片断CD转化棉花茎尖外植体及下胚轴外植体。通过对影响组织培养和转化的相关因素的研究,建立起了适宜农杆菌介导的茎尖、下胚轴遗传转化体系。主要研究结果如下:建立了以棉花茎尖为受体的转化体系。通过对影响转化频率相关因子的研究,以及对头孢霉素(Cef)抑菌浓度、卡那霉素(Km)筛选浓度、农杆菌菌株的比较筛选,获得了hpalxoo的转化株,PCR扩增到了目的基因,证明了棉花茎尖可做为良好的受体材料并且获得了根癌农杆菌介导的茎尖转化体系:未经预培养的带下胚轴0.5cm的茎尖在OD600=0.3-0.35的根癌农杆菌菌液中浸染15-20min,共培养48-56h;选择培养以500mg/LCef为抑菌浓度,150mg/LKm为最高筛选浓度;两种菌株比较结果hpa1xoo的侵染转化率高于CD。采用农杆菌转化胚性愈伤,只要选择的细胞分裂状态比较适当,能获得大量独立的转化子,且经过2～4次筛选便可进入分化培养,仅需5～6个月便可获得再生植株,大大缩短了棉花转基因周期。本研究依据此方法进行试验,但是没有获得转基因再生植株,其中诸多影响因素如:基因型、植物激素配比、培养基的选择、Km选择压、农杆菌浓度等。转hpa1xoo基因棉细胞组织抗病表型鉴定。本实验还进行了已获得的转hpa1xoo基因棉悬浮细胞抗病性鉴定及棉花黄萎病菌诱导转hpa1xoo基因棉花产生微过敏防御反应的试验。主要研究结果如下:棉花细胞悬浮培养可产生基因型相对一致、快速分裂的细胞群,且容易加入诱导物质,同时还能使病原菌与寄主互作的过敏反应得以简化。通过棉花悬浮细胞与黄、枯萎菌共培养,分别在3h、6h、9h、12h、24h显微观察验证了棉花悬浮细胞的存活率,导入Harpin蛋白的转基因棉花T-33、T-34的抗病性较好,在相同条件下与受体中35(Z35)相比死亡率低近10个百分点。利用针刺叶片接菌法,通过已获得的转编码HarpinXoo的基因hpa1xoo的棉花材料、其出发品种与棉花黄萎病菌互作,采用细胞学染色等方法显微观测棉花叶片组织细胞是否会对棉花黄萎病菌产生microHR等细胞学抗病反应表型。实验结果证明,导入Harpin蛋白的转基因棉花,氧化带与伤口间细胞具有明显的microHR,非转基因棉花无此现象,表明棉花黄萎病菌激发了转基因棉花基本的抗病防卫反应。
张朝军[7]2008年在《棉花叶柄高效再生体系的建立与遗传分析》文中指出利用遗传工程技术改良棉花品种已经取得了巨大的经济效益和社会效益。农杆菌介导遗传转化法是棉花的主要遗传转化方法之一,然而目前棉花的生物技术的发展仍然存在着很多障碍,在棉花转基因技术中存在体细胞胚胎发生的基因型依赖性、棉花组织培养的低效性(耗时,耗工)、基因转化技术的复杂性(难重复,转化率低)和转基因棉花的农艺性状的变异等等,这些问题已经成为棉花生物技术、棉花功能基因的验证和棉花相关基因克隆等研究领域的障碍和瓶颈。本研究针对棉花组织培养中涉及的主要问题,从棉花组织培养外植体的选择、基因型限制的遗传规律、适合组织培养的特种棉花材料选育等方面进行初步研究,同时把棉花农杆菌介导法的遗传转化效率提高了2~3倍,转基因周期缩短到6个月,转化效率稳定在30%,为棉花功能基因的快速鉴定与转基因材料的创造提供了技术支撑。取得的主要研究结果如下:大田叶柄组织培养体系的建立:通过大田棉株叶柄愈伤组织的诱导、胚性愈伤组织的分化、胚状体的萌发等试验,建立了CCRI24的叶柄组织培养体系,与常用的无菌苗下胚轴组织培养体系相比,该体系培养周期和分化率均无显着差异,其分化率稳定在30%左右。同时解决了叶柄组织培养过程中愈伤组织难以分化为胚性愈伤组织、胚性愈伤组织比来源于无菌苗下胚轴的胚性愈伤组织更容易褐化的问题。①激素对褐化有一定的影响,调节激素的用量,也可以达到早出胚状体的目的KT/6-BA组合中,6-BA的用量应介于0.08～0.16 mg·L-1之间较好,KT的用量在0.08～0.12 mg·L-1效果较好;在KT/IAA组合中,KT在0.08~0.12mg·L-1时,IAA用量在0.08~0.12mg·L-1正常胚状体的比例较高②培养基中氮源的配比是棉花新分化的胚性愈伤组织在继代中出现褐化的主要原因,将MS培养基大量元素中KNO3的用量增加到3.04g·L-1,NH4NO3减少到0.66g·L-1有利于防止褐化。棉花叶柄愈伤组织分化率的遗传分析:通过研究发现,叶柄分化率分布符合正态分布,说明叶柄分化率受数量基因控制。利用主-多基因模型分析发现:大田棉花叶柄的分化率主要受2对主基因控制。基因间存在加性、显性、上位性,该性状主基因遗传率在74.68%~83.22%。说明利用育种手段可以选育出高分化率的材料。在控制分化率的基因中,也存在多基因效应,多基因解释的遗传变异低,仅有10.47-16.78%。叶柄分化率相关基因的QTLs定位:通过W10×TM-1组合的F2群体分子标记,找到了27个多态性标记,采用Mapmaker/Exp(Version3.0)数据分析软件构建连锁群,进行分子标记的连锁群分析与位点排序,对检测到的19个位点进行分析,有12个位点进入2个连锁群(LOD≥3.0),两连锁群分别包含5个和7个分子标记。根据连锁群长度从大到小顺序对各连锁群进行命名为LG1、LG2,LG1连锁群长度为194.3cM,LG2连锁群长度为109.1cM,标记间的最小遗传距离为12.7cM,最大的遗传距离为43.3cM。应用复合区间作图法共检测到3个与分化率相关性状的QTL(LOD≥2.5),分布在2个连锁群上,解析8.4%~58.1%的表型变异。其中,1个贡献率达到58.1%。另两个贡献率分别为14.4%和8.4%。棉花叶柄组织培养特性:棉花不同部位的叶柄细胞在脱分化形成愈伤组织方面无显着差异;在棉花植株生长发育的旺盛时期,即蕾期、盛蕾期、开花期、盛花期,植株不同部位、不同发育时期的叶柄愈伤组织的生长速度有一定的差异;胚性愈伤组织分化率没有显着差异。到了棉花生长发育的后期,随着叶柄的衰老程度增加,诱导出的愈伤组织状态发生改变,生长缓慢,但仍有42.8%的分化率。说明叶柄是比较适合组织培养的外植体。棉花叶柄遗传转化体系的建立:叶柄和无菌苗下胚轴对卡那霉素的耐受性不同,在用作遗传转化外植体时抗生素筛选浓度不同,农杆菌浸染和适宜抗生素筛选条件下,抗性愈伤组织的诱导率分别是84.3%和46.7%,而两者抗性愈伤组织分化率分别是65.1%和71.8%,因此叶柄转化率是51.8%,无菌苗下胚轴的转化率是33.5%,利用叶柄作外植体的转化效率是无菌苗下胚轴的1.55倍。叶柄抗性愈伤组织诱导率高的原因也可能与叶柄横截面面积大,与农杆菌接触的细胞多有关。棉花高分化率材料的选育体系的建立与遗传转化:应用叶柄组织培养体系,从CCRI24、冀合312、中394中选育出叶柄分化率≥80%的株系10个,其中有6株系的无菌苗下胚轴分化率也高达100%。选育的株系分化能力可以稳定的遗传给后代,解决了棉花组织培养研究中由于分化率不稳定而使培养体系不稳定的现象。从而建成了一套稳定的棉花组织培养体系。初步利用选育的材料研究发现,棉花愈伤组织诱导培养基可以显着的影响愈伤组织的分化。不同基因型材料对愈伤诱导与分化培养基的激素要求不一样。利用选育的株系及其培养体系进行棉花农杆菌遗传转化,转化效率可以稳定在30~40%之间,比CCRI24转化效率提高1.88倍。
邓德旺[8]1999年在《论植物生殖系统基因转化》文中进行了进一步梳理本文从植物基因转化原理的角度，在简要评述多种转化系统基因导入机制、转化受体再生和遗传机制等方面的基础上，重点分析了植物生殖系统基因转化。运用植物生殖生物学和分子细胞生物学的研究成果，讨论了生殖系统基因转化方法的技术原理；在消除自发荧光等克服多种技术难点的基础上，采用激光共聚焦显微术等实验生物学方法研究与评价了棉花花粉介导法和花粉通道法转基因的技术原理。在实验研究的基础上，对外源基因沿棉花花粉管通道运动的动力，给予了理论分析推导。主要结果如下：1、植物生殖系统基因转化，是利用植物有性生殖过程中的有性细胞或组织为受体，采用基因工程的手段改良植物的技术领域。在已建立的技术路线中，花粉介导法和花粉管通道法是不依赖于受体基因型限制的技术路线，是植物基因工程产业化的实用技术路线，已引起国内外的普遍关注。2、成熟花粉既可在液相介质转化，也可在气相介质中转化。基因枪可穿透花粉外壁，并使花粉保持活力。外源基因沿生长的花粉管内通道运动，随雄性生殖单位进入无外壁的雌性生殖单位，参与精卵核融合过程。外源基因可在融合过程中进入核内，亦可待合子分裂时再入其中。对于二核花粉植物，外源基因还可在花粉管内进入处于分裂状态的生殖细胞核中。因此该方法为外源基因在一个细胞体系内提供了2～3次进入核的机会。3、通过微注射等方法，可使外源基因沿花粉管外通道，经胎座上部传输组织束中的花粉管外缝隙、胎座表面、珠孔、珠心通道进入胚囊，直接转化无壁的处于融合期的生殖细胞，这就是通常所说的花粉管通道法。把外源基因导入的途径确立为花粉管外通道而非花粉管内通道、珠心孔道等，转化受体确定为融合期的生殖细胞而非受精卵(合子)、早期合子细胞等，明显不同于先前的假说。这不仅更具科学性，且得到了实验结果的支持。花粉管通道法直接把外源基因送入无壁细胞，又不直接触及受体细胞，是该方法的独特之处。该方法同花粉介导法一样，为导入细胞内的外源基因，提供了2次进入核内的机会。利用直接导入法转化植物，跨壁、跨膜是外源基因整合基因组的两大屏障。花粉介导法和花粉管通道法，不仅通过花粉管内、外通道，使外源基因巧妙地通过了这种屏障，而且又巧妙地借助了植物胚胎发育的天然实验体系，克服了多数转化系统转化受体再生难的技术障碍。文章还较详细的评述了生殖系统转化在基因转化系统研究中的地位，展望了植物生殖基因工程学科发展前景。
熊恒硕[9]2006年在《根癌农杆菌介导的Bt和PTA基因转化紫花苜蓿“中苜一号”的初步研究》文中认为紫花苜蓿( Medicago sativa L.)是栽培利用最广泛的豆科牧草,全球种植面积约3500万hm2。苜蓿的大面积种植,也为苜蓿虫害的发生和流行创造了有利的生态条件,近两年来虫害问题日益突出,已成为制约苜蓿产业化发展的主要因素之一。随着生物技术的发展和广泛应用,利用转基因技术改良苜蓿的性状已成为可行的手段。实验选取由本研究室通过常规大田育种技术育成的紫花苜蓿品种“中苜一号”作为基因转化受体,首先,以该品种为对象,选用下胚轴和子叶为外植体,进行组织培养系统学研究,寻找具有相对较高分化率的外植体和适用于该品种的基本培养基等条件;其次,对“中苜一号”进行了除草剂草丁膦(ppt)的敏感性实验,并具体探讨了转化过程中,菌液浓度(OD600),侵染时间,共培养时间等影响转化效率的环节。摸索出转化最佳条件为:以“中苜一号”子叶作为外植体,UM为基本培养基,以OD600为0.6的菌液侵染10分钟,转到加盖有一层灭菌滤纸的培养基上共培养3天后转到筛选培养基上筛选,筛选培养基附加ppt8mg/l及Carb400mg/l。在此基础上以根癌农杆菌菌株EHA105介导,将双基因Bt和PTA转入到紫花苜蓿品种“中苜一号”,最终获得除草剂草丁膦(ppt)抗性的植株,并进行了初步的PCR及RT-PCR分子生物学检测,待进一步的杂交鉴定及昆虫抗性实验。
林霞[10]2012年在《玉米幼胚再生体系的建立及抗虫bt-s1m基因转化玉米的初探》文中研究表明玉米是重要的粮食、饲料及经济作物,建立高效、稳定的遗传转化体系对玉米种质资源的改良具有十分重要的意义,而良好的受体及植株再生体系是遗传转化的前提。本研究以自交系A188、综31、B73及Mo17的幼胚为外植体,系统研究了玉米幼胚组织培养体系和农杆菌遗传转化体系的影响因素,并将抗虫基因bt-slm转入玉米中,获得了转基因植株。主要研究结论如下：1.幼胚组织培养体系的建立研究发现：A188、综31、Mo17的胚性愈伤组织诱导率较高、植株再生能力较强,适宜作转化受体,且NB培养基较适宜作A188、综31、Mo17的诱导培养基,MB较适合B73的愈伤组织诱导。雌穗授粉后9-12d,取长度为1.0-2.0mm的幼胚作为外植体,在诱导培养基中添加2.0-3.0mg/L2,4-D,参试材料的愈伤组织不仅得率最高,并且多为胚性愈伤组织。在诱导期间, AgNO3采用隔代添加法有利于提高胚性愈伤组织的诱导率,其最佳浓度为10.0mg/L。0.25mg/L烯效唑对胚芽发生的抑制作用达到极显着水平,对胚性愈伤组织诱导率没有显着影响。2,4-D浓度在第叁次继代减低到1.0mg/L时,对愈伤组织胚性的维持和芽状结构的形成有促进作用。蔗糖浓度为50.0g/L,6-BA为0.5mg/L时愈伤组织分化率最高且有利于苗的分化。IBA浓度在0.6mg/L时,再生苗生根效果较好。2.在前人的研究基础上,对影响农杆菌介导玉米转化的各种因素进行了优化,建立了以自交系A188、综31、Mo17以及A188杂交幼胚为转化受体的遗传转化体系。研究结果表明：1.0-2.0mm的幼胚是最适宜的转化受体,在感染液和共培养基中加入100μtmol/L乙酰丁香酮时抗性愈伤组织诱导率最高；适合的菌液浓度为OD600=0.5,侵染时间为10min,共培养时间为3d;感染前将幼胚在侵染液中浸泡2-4h均有利于提高T-DNA转移效率。采用这个转化体系,通过PCR初步检测,共得到抗虫转基因植株32株,其中A18816株、综3114株、Mo174株、B73×A1885株、综31×A1882株、Mo17×A1881株。PCR阳性植株率为0.588-4.160%。通过ELISA检查bt-slm占可溶性蛋白的比例,最高达0.030%,是对照组的11.795倍。本研究初步建立了农杆菌介导玉米遗传转化体系,为进一步将有用价值的基因转入玉米自交系中奠定了基础。
参考文献：
[1]. 大豆组织培养体系优化与双价抗虫基因遗传转化的研究[D]. 王萍. 东北农业大学. 2002
[2]. 大豆体细胞胚再生体系的优化与双价抗虫基因的遗传转化[D]. 王晓春. 中国人民解放军军需大学. 2003
[3]. 大豆植株再生和遗传转化技术体系的研究[D]. 杨超. 南京农业大学. 2009
[4]. 大豆高效整个子叶节再生体系的建立及根癌农杆菌介导的双价抗虫基因在大豆上的转化[D]. 马晓红. 上海交通大学. 2008
[5]. 农杆菌介导的双价抗虫基因转入大豆的研究[D]. 高耸巍. 东北师范大学. 2007
[6]. 农杆菌介导法转hpalxoo基因棉花再生植株建立及转hpalxoo基因棉细胞组织抗病表型鉴定[D]. 倪萌. 新疆农业大学. 2008
[7]. 棉花叶柄高效再生体系的建立与遗传分析[D]. 张朝军. 中国农业科学院. 2008
[8]. 论植物生殖系统基因转化[D]. 邓德旺. 中国农业科学院. 1999
[9]. 根癌农杆菌介导的Bt和PTA基因转化紫花苜蓿“中苜一号”的初步研究[D]. 熊恒硕. 扬州大学. 2006
[10]. 玉米幼胚再生体系的建立及抗虫bt-s1m基因转化玉米的初探[D]. 林霞. 新疆农业大学. 2012
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