湖南省岳阳市湘阴县第三人民医院检验科 414600
【摘 要】目的：对血吸虫病肝纤维化中Th17及相关细胞因子的表达进行探讨。方法：应用FCM（流式细胞计数）对血吸虫病肝纤维化患者外周血Th17在CD4+T细胞比例进行检测，应用间接血凝法检测IgE、IgG、IgM水平，应用ELISA（酶联免疫吸附测定法）对转化生长因子TGF-β1和IL-17（白细胞介素）的表达水平进行检测，并和健康人群检测结果进行对比。结果：实验组IgE、IgG、IgM水平均显著高于常规组（P<0.05）。实验组外周血CD4+T细胞中Th17比率显著高于常规组（P<0.05）。实验组血清IL-17、TGF-β1水平显著高于常规组；血吸虫肝纤维化患者血清IL-17含量和TGF-β1水平呈正相关（P<0.05）。结论：血吸虫病患者会出现IgE、IgG、IgM上升，合并肝纤维化患者中Th17、IL-17、TGF-β1呈高表达，提示在血吸虫病肝纤维化免疫病理损害及肝虫卵肉芽肿形成中Th17级相关细胞因子可能有所参与。
【关键词】肝纤维化；血吸虫病；Th17；转化生长因子β；白细胞介素
[Abstract] objective：to investigate the expression of Th17 and related cytokines in liver fibrosis of schistosomiasis. Methods：application of FCM（flow cytometry）peripheral blood in patients with schistosomiasis liver fibrosis Th17 in the proportion of CD4 + T cells to detect，by the method of indirect hemagglutination test IgE，IgG and IgM level，application of ELISA（enzyme linked immunosorbent assay method）of TGF - transforming growth factor beta 1 and IL - 17（interleukins）expression level，and were compared with testing results of healthy people. Results：IgE，IgG and IgM levels were significantly higher in the experimental group than in the conventional group（P<0.05）. The ratio of Th17 in peripheral blood CD4+T cells in the experimental group was significantly higher than that in the conventional group（P<0.05）. The levels of serum il-17 and TGF- g1 in the experimental group were significantly higher than those in the conventional group. There was a positive correlation between serum il-17 content and TGF- scaffold 1 level（P<0.05）. Conclusion：in patients with schistosomiasis，IgE，IgG and IgM are increased，and Th17，il-17 and TGF- 1 are highly expressed in patients with hepatic fibrosis，suggesting that Th17 related cytokines may be involved in the immunopathological damage of hepatic fibrosis and the formation of granuloma of liver worm eggs.
[Keywords] hepatic fibrosis；Schistosomiasis；Th17；Transforming growth factor heart；interleukin
相关研究显示，在血吸虫病引起免疫病理损害中Th17及相关细胞因子白细胞介素17发挥重要作用，作为一种新型效应性CD4+T细胞亚群，Th17细胞主要是转化生长因子TGF-β和细胞因子白介素-6启动初始T淋巴细胞分化形成，通过相关细胞因子发挥功能特异性效能。作为重要致纤维化生长因子，TGF-β可对肝脏星状细胞激活或增值产生影响，在细胞外基质过度沉淀的基础上促进肝纤维化进展[1]。本研究将对血吸虫病肝纤维化患者外周血CD4+T细胞中Th17比例及血清细胞因子TGF-β1、IL-17及IgE、IgG、IgM水平进行检测，以探讨血吸虫病肝纤维化中Th17、相关细胞因子、血吸虫病抗体的表达和意义，现总结报告如下。
1资料与方法
1.1一般资料
选择我院2015年6月致2018年5月收治的血吸虫病肝纤维化患者40例，所有患者均满足肝纤维化诊断标准，并且不存在病毒性、药物性、酒精性肝纤维化。其中包括女15例、男25例；年龄范围43~76岁，平均（61.7±7.7）岁。选择同期健康体检者40例，其中包括女14例、男26例；年龄范围43~73岁，平均（61.5±8.2）岁。两组一般临床资料对比差异无统计学意义，具有可比性（P>0.05）。
1.2仪器与试剂
选择美国Bec-ton-Dickinson公司提供FCM检测抗体和试剂、美国Bec-ton-Dickinson公司提供FACScan流式细胞仪、美国Bec-ton-Dickinson公司提供CELLQUEST分析软件。应用美国RD Systems公司人TGF-β1和IL-17酶联免疫诊断试剂盒进行ELISA检测。应用BIO-TEK宝特生产ELx800全自动酶标仪，美国伯乐生产Bio-rad1575全自动洗板机。选择日本血吸虫抗体检验试剂盒。
1.3实验方法
1.3.1应用间接血凝法检测IgE、IgG、IgM 应用采血管采集血液100ul，以2500转/分钟速度离心处理5分钟，进行血清分离并检测。阴、阳对照冻干品加100ug稀释液并混匀，从左至右标1~n号，横向放平96孔V型反应板，加稀释液100ul于血凝反应板第1排第1孔，分别加25ul稀释液于血凝反应板纵向第3~4孔，第2孔不加。加25ul1号待测样本于第1排第1孔，充分混匀。从第1孔吸出25ul于第2孔（纵向），在从第1孔吸出25ul于第3孔（纵向），总分混匀后吸出25ul于第4孔（纵向），充分混匀吸出25ul弃之。第2~n样本操作同上，阳性对照、阴性对照倍比稀释，操作时一个样本一个吸头，血凝反应纵向4孔血清稀释度分别为1：5、1：5、1：10、1：20。加1ml稀释液于每支动干致敏红细胞中并混匀。除第1排血清稀释孔外，加25ul致命红细胞悬液于其余每孔，在微量振荡器中放置反应板振摇2分钟，30分钟后观察结果。
1.3.2应用FCM技术检测Th17细胞比率 于清晨空腹状态下抽取受检者3~5毫升静脉血，立即进行血液标本处理。CD4+T细胞检测：选择100ul未刺激肝素抗凝全血，加20ul鼠抗人PerCP-抗CD3和FITC-抗CD4/PE-抗CD8抗体，4摄氏度孵育30分钟，加溶血剂溶血后，2次PBS洗涤重悬上机检测CD4+T细胞水平。检测Th17细胞比率；按照1：1比例混匀肝素钠抗凝血和RPMI1640，在37摄氏度CO2培养箱中培养4小时，收集细胞等分测定管和同型对照管，加入FITC-抗CD4抗体和PerCP-抗CD3抗体，4摄氏度孵育30分钟，2次PBS洗涤，室温下固定液避光反应15分钟，将上清液去除，2次PBS洗涤，加入FITC标记抗人IL-17单抗和破膜剂进行细胞内染色，2次PBS洗涤后上机检测。常规应用FCM技术，以CD3-SSC细胞群设门，进行CD4+T细胞中Th17细胞比例测定。
1.3.3应用酶联免疫吸附试验检测细胞因子TGF-β1和IL-17 于清晨空腹状态下抽取患者3~5毫升静脉血，离心分离血清，并于零下20摄氏度冰箱中冻存待测，严格按照试剂盒说明书步骤进行酶联免疫吸附试验检测。
1.4统计学处理
本次研究所得数据使用SPSS19.0统计学软件分析，计量资料行t检验，计数资料行χ2检验，P<0.05表示有统计学意义。
2结果
2.1两组IgE、IgG、IgM水平对比
实验组IgE、IgG、IgM水平均显著高于常规组（P<0.05）。见表1。
表1：两组IgE、IgG、IgM水平对比
3讨论
血吸虫病肝纤维化为慢性免疫性疾病，主要是虫卵肉芽肿引起的，机体对血吸虫虫卵抗原免疫应答进一步引起纤维化[2]。血吸虫病诊断中，IgE、IgG、IgM水平具有重要意义，该疾病患者在抗原刺激下首先产生IgM，随后IgM被新产生的IgG替代，所以IgM在疾病初期就能够被检测出，IgE、IgG、IgM是评价和诊断血吸虫病重要依据。在炎症损伤和免疫调节中CD4+T细胞处于重要地位，免疫反应中CD4+T通过辅助其他细胞，在免疫病理损害、抗感染免疫应答中发挥作用[3]。相关研究显示，Th17在血吸虫病肝纤维化发生中具有重要作用，其可增加下游炎症因子，并引导产生抗微生物肽，进而在炎症免疫损伤中发挥促炎作用[4]。转化生长因子IL-6和TGF-β1共同诱导初始CD4+T细胞分化为Th17细胞，同时TGF-β1可对HSC增殖和激活产生影响，并进一步引起ECM过度沉淀，最终形成局部纤维病灶[5]。 本研究中，实验组IgE、IgG、IgM水平均显著高于常规组（P<0.05）。实验组外周血CD4+T细胞中Th17比率显著高于常规组（P<0.05）。实验组血清IL-17、TGF-β1水平显著高于常规组；血吸虫肝纤维化患者血清IL-17含量和TGF-β1水平呈正相关（P<0.05）。提示血吸虫病患者会出现IgE、IgG、IgM上升，血吸虫病肝纤维化免疫病理损害及肝虫卵肉芽肿形成中Th17级相关细胞因子可能有所参与。
综上所述，作为新的CD4+T细胞亚群，Th17在血吸虫病肝纤维化发生发展中发挥可能发挥作用。
参考文献：
[1]杨莹莹，杨俊齐.Treg和Th17细胞在寄生虫感染和卫生假说中的免疫调节[J].中国血吸虫病防治杂志，2017，29（1）：116-121.
[2]周永华，杨莹莹，范小琳.Th17/Treg免疫失衡在血吸虫病肝纤维化中的作用[J].中国寄生虫学与寄生虫病杂志，2017，35（1）：89-92.
[3]夏国新，刘燕婕.Th17及相关细胞因子在血吸虫病肝纤维化中的表达及意义[J].公共卫生与预防医学，2015，26（4）：29-31.
[4]夏国新，胡玲娟，刘燕婕.晚期血吸虫病肝纤维化中Th17/Treg失衡及其作用[J].公共卫生与预防医学，2015，26（5）：64-66.
[5]温小云，迟莹，贺蕾.IL-17对日本血吸虫感染抗体及Th应答的影响[J].中国血吸虫病防治杂志，2017，21（5）：373-377.
论文作者:陈亚南
论文发表刊物:《中国结合医学杂志》2018年8期
论文发表时间:2018/11/29
标签：细胞论文; 细胞因子论文; 肝纤维化论文; 血吸虫病论文; 血吸虫论文; 免疫论文; 实验组论文; 《中国结合医学杂志》2018年8期论文;