田发青1 季德兰2 李举亨1 唐玫琴1 李惠卿3 黄映彩3 成小慧1
（1深圳市龙岗区人民医院血液内科 广东 深圳 518172）
（2深圳市龙岗区人民医院中央悦城社康 广东 深圳 518172）
（3深圳市龙岗区人民医院血细胞实验室 广东 深圳 518172）
【摘要】 目的: 研究多种抗原促进树突状细胞（dendritic cells，DCs）成熟作用。方法：外周血单核细胞培养为DC，分别负载卡介苗、肺炎球菌疫苗、麻疹疫苗、K562及RPMI8266冻溶抗原后与T淋巴细胞共培养，以单独加入TNF-a为对照组，再加入相同体积培养基作为空白对照，观察DC形态，流式细胞仪分析DC表型，CCK8法测定混合淋巴细胞反应（MLR）。结果：各组均培养出具有典型形态的DC，其中疫苗各组细胞CD83表达较肿瘤细胞各组明显升高，MLR作用强，而肿瘤组抗原又较对照组和空白对照组为高，同时各实验组CD1a表达较对照组和空白对照组明显降低，P<0.05，但各实验组CD1a表达未见明显差异，P>0.05。结论：卡介苗、肺炎球菌疫苗及麻疹疫苗等微生物抗原促进DC成熟能力较K562及RPMI8266等肿瘤抗原能力强。
【关键词】 抗原；树突状细胞；CD83；混合淋巴细胞反应
【中图分类号】R331.1+44 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2016）08-0385-02
Multiple kinds of antigen induce dendritic cells to maturation 1Tian Faqing, 2Ji Delan 1LI Juheng, 1Tang Meiqin, 3LI Huiqing, 3Huang Yingcai,1Cheng Xiaohui 1Department of Hematology, Longgang District People’s Hospital of Shenzhen; 2Blood Cell Laboratory, Longgang District People’s Hospital of Shenzhen, Guangdong, 518172, China
【Abstract】 Objective To investigate the capability of multiple kinds of antigens(Ags) to promote dendritic cells (DCs) mature.Methods DCs were induced from peripheral blood mononuclear cells loaded different Ags such as BCG, pneumococcal vaccine, measles vaccine, K562 and RPMI8266-freeze-thaw Ags, then to be co-cultured with T lymphocytes. TNF-a only was added as control group, and TNF-a and the same volume of medium as Ag were added as a blank control. DC morphology was observed by inverted microscope, DC phenotype was analyzed by flow cytometry, and mixed lymphocyte reaction (MLR) was determined by CCK8 kits. Results Cells in each group were induced to have the typical morphology of DC, which CD83 expression was significantly higher in vaccine groups than in tumor cell groups, and was higher in tumor cell groups than in control group and blank control group, while CD1a expression was significantly lower in each experimental group than in control group and blank control group, P<0.05, but CD1a expression in each experimental group had still no significant difference, P>0.05.Conclusion Microbial Ags such as BCG, pneumococcal vaccine and measles may better promote DC maturation than tumor cell antigens such as K562 and RPMI8266.
【Key words】 Antigen; Dendritic cell; CD83; Mixed lymphocyte reaction
树突状细胞（dendritic cells，DCs）是目前已知的功能最强大的抗原递呈细胞[1]，DC在人体内所占数量极微，约为外周血单个核细胞总数的0.5～1.0%。目前以GM-CSF、IL-4处理末梢血中的单核细胞或CD34细胞,可诱导培养出大量DC。本课题观察各种不同抗原刺激对DC功能的影响。
1.材料和方法
1.1主要试剂
卡介苗（BCGV）、肺炎球菌疫苗、麻疹疫苗为友情惠赠，rhGM-CSF、rhIL-4、rhTNF-α，抗人CD1a-PE、CD4-FITC、CD11c-PE、CD80-FITC、CD83-FITC、CD86-PE、HLA-DR-FITC单抗为Burlingame公司产品. CCK8试剂盒为Dojindo, Kumamoto, Japan产品，K562细胞和骨髓瘤RPMI8266由中山大学血液病研究所惠赠。
1.2 单个核细胞的分离
所采集标本得到健康志愿者本人自愿同意并签署同意书，实验通过医院伦理委员会批准。采集外周血50ml（40u/ml肝素抗凝）加等体积的PBS液稀释,具体步骤参见文献[2]，收集贴壁细胞，作为单核细胞培养DC。非贴壁细胞作为T淋巴细胞。
1.3 DC培养
调整单核细胞浓度为106/ml，具体步骤参考文献[2]，根据分组分别加入稀释的卡介苗、肺炎球菌疫苗、麻疹疫苗（疫苗各组）及K562细胞、RPMI8266细胞冻溶物（肿瘤细胞组）后培养48小时。单独加入TNF-a作为单纯TNF-a组（对照组），仅仅加入相同体积培养基作为空白对照。
1.4 混合淋巴细胞反应（mixed lymphocyte reaction MLR）
培养成熟DCs用丝裂霉素(25μg／L)处理1h去增殖后作为刺激细胞，调整细胞浓度为106/ml后，分别与外周血分离的T淋巴细胞（2×105个／ml）在96孔平底培养板中混合培养5天 (DC：T细胞分别为1：100，1：50，1：10，1：1)。终体积为每孔200μl，对每个浓度均作4个平行孔。另设T细胞对照孔，并以同样抗原处理后的单核细胞(Mo)与T细胞共培养孔作为DC与T淋巴细胞作用的对照孔。培养第五天以CCK8法测定混合MLR，用酶标仪检测波长450nm时的吸光度(A)值，参比波长为630nm，结果取均值。算增殖指数(PI)。PI = ADC+T cell–ADC/ ATcell–Ablank 。
1.5 流式细胞仪（FCM）检测
DCs培养第7天，FCM测定其膜CD分子表达调节。取细胞悬液100μl/管（细胞浓度为1×106/ml），分别加入相应单克隆抗体各15μl，混匀后置室温下暗室反应30min，离心、洗涤、固定备作FCM测定。Cell Quest软件进行分析。
1.6 统计学分析
采用SPSS16.0软件，所测数据用均数±标准差（x-±s）表示，采用the Students’ T test。P<0.05表示有统计学意义。
2.实验结果
2.1 DCs形态学
新分离的骨髓单个核细胞呈球形散在分布，表面光滑；培养48h后，培养5-7d后细胞均匀分散，进一步变形，体积增大，胞浆丰富，具有典型DC形态。各组形态学在光学显微镜下观察未见明显差异。见图1。
图1 树突状细胞培养。培养第一天（左侧），第5天（右侧）
2.2 DCs免疫表型
各组第7天DC FCM测定免疫表型，HLA-DR、CD80、CD86、CD11c均高表达，未见明显统计学差异，P＞0.05。卡介苗、肺炎球菌及麻疹疫苗组CD83较其他各组明显升高，差异有统计学意义，P＜0.05，K562细胞组、RPMI8266细胞组较单纯TNF-a组及空白对照组CD83表达升高，差异亦有统计学意义，P＜0.05。疫苗各组及肿瘤细胞各组之间比较差异未见统计学意义，P＞0.05。各种抗原刺激组CD1a较单纯TNF-a及空白对照组下降，差异有统计学意义，P＜0.05。表1。
2.3 MLR
DC刺激淋巴细胞增殖指数(PI)能力呈数量依赖性，其中卡介苗、肺炎球菌疫苗及麻疹疫苗组等DC较其他各组MLR增强，差异有统计学意义，P＜0.05。K562及RPMI8266细胞组较单纯TNF-a及空白对照组亦明显增强，差异有统计学意义，P＜0.05，但疫苗各组及肿瘤细胞各组间比较无统计学差异，P＞0.05，见图2。
图2 混合淋巴细胞反应（MLR）。
3.讨论
DC是唯一一类可直接活化静息T细胞的APCs，多种抗原通过DC递呈抗原激活Na?ve T细胞[3]。一般递呈外源性抗原例如微生物抗原通过MHC-II类分子，使Na?ve T细胞向CD4+T细胞方向发展，递呈内源性抗原如肿瘤抗原通过MHC-类分子，使Na?ve T细胞向CD8+T细胞方向发展，发挥CTL（细胞毒性T细胞）效应[2][4]。本研究中以GM-CSF、IL-4、TNF-a等细胞因子联合或不联合各种抗原处理末梢血中的单核细胞,培养5～7d后细胞均具有典型树突状突起细胞形态，FCM证实具有典型的DC免疫学表型，成熟标志CD83阳性，且MLR实验提示T淋巴细胞在DC作用下明显扩增，呈剂量依耐性，提示该DC是有功能的DC。以上实验结果证明各组细胞均被培养为有功能的成熟DC。
成熟DC不具有抗原吞噬和处理作用，但具有很强的抗原提呈能力和与T 细胞相互作用的能力，不需要CD4辅佐细胞就能诱导CD8细胞增殖和CTL反应[5]。目前应用细胞因子成功培养出不同来源(脐血、健康人、慢粒患者外周血)的DC，通过TNF-α等细胞因子及联合多种抗原促进DC成熟。资料显示使用卡介苗等多种疫苗及经CML冻融抗原刺激后的DC能表现出强于未刺激的特异性CTL效应[2]；应用干扰素联合传统细胞因子，可以诱导出CML患者来源DC的成熟。本研究结果提示微生物抗原联合TNF-α促进DC表达CD83最高，其MLR效应最强，提示微生物抗原联合TNF-α促DC成熟作用最强，而K562、RPMI8266肿瘤细胞抗原作用其次，均较单纯TNF-α作用强。不成熟DC诱导免疫耐受，导致抗肿瘤效应无能[6]。因此，在DC肿瘤疫苗研究中，诱导成熟DC是一个重要问题。本研究提示微生物抗原联合肿瘤抗原可能更有效促进DC成熟。
【参考文献】
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[4]Martin K, Schreiner J, Zippelius A. Modulation of APC Function and Anti-Tumor Immunity by Anti-Cancer Drugs[J]. Front Immunol.2015 Sep 29;6:501.
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基金项目：
深圳市科技创新项目科技研发基金No. JCYI20140414123738256；深圳市龙岗区科技发展基金No.YLWS20150514150041453。
论文作者:田发青1,季德兰2,李举亨1,唐玫琴1,李惠卿3,
论文发表刊物:《医药前沿》2016年3月第8期
论文发表时间:2016/5/16
标签：细胞论文; 抗原论文; 疫苗论文; 淋巴细胞论文; 统计学论文; 卡介苗论文; 树突论文; 《医药前沿》2016年3月第8期论文;