1.广西中医药大学基础医学院 南宁 530200;2.广西中医药大学瑶医药学院 南宁 530001
摘要:目的:探讨扶芳藤提取液对肿瘤微环境中BMSCs增殖变化的影响。方法:采用Transwell共培养小室,建立小鼠BMSCs与Hepa1-6肝癌细胞共培养体系,加以最佳浓度扶芳藤提取液进行干预,运用CCK-8法及流式细胞术检测共培养体系中BMSCs细胞的增殖情况,分析扶芳藤提取液对肿瘤微环境中BMSCs保护作用。结果:与对照组比较,模型组BMSCs细胞细胞生长增快,且G1期比例降低,S期比例增加;与模型组比较,干预组BMSCs细胞生长缓慢,且G1期比例增加,S期比例降低,以上差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:扶芳藤提取液可抑制肿瘤微环境中BMSCs细胞的异常增殖,具有一定保护作用。
关键词:扶芳藤提取物;肿瘤微环境;骨髓间充质干细胞
Study on extracts of Euonymus fortunei on proliferation of BMSCs in tumor microenvironment
Zhang Qi1,Zhang Man2*,Xiao Jian1,Yun Chenxia1,Liang liang1,Lan Taijin1(1.School of Basic Medical Sciences,Guangxi University of Chinese Medicine,Nanning,530200,China;2. Faculty of Yao Medicine,Guangxi University of Chinese Medicine,Nanning,530200,China)
Abstract Objective:To study the effects of extracts of euonymus fortunei on proliferation of BMSCs in tumor microenvironment. Methods:This study screened out the effective concentration of extracts of euonymus fortune by CCK-8,and established a co-cultured system of BMSCs and Hepa1-6 cells. CCK-8 also showed that BMSCs cells in lung-cancer cells co-culture system changes in growth and the cell cycle was tested by flow cytometric analysis. Results:Compared with control group,model group growed faster,and the proportion of cells in G1 phase was significant decreased,while the proportion of cells in S phase was increased. Compared with model group,interfered group growed slower,and the proportion of cells in G1 phase was increased,but the proportion of cells in S phase was significant decreased(P<0.05),with statistical significance. Conclusion:The extracts of euonymus fortune could inhibit the abnormal proliferation and have a protective effect on BMSCs in tumor microenvironment.
Key words extracts of Euonymus fortunei;tumor microenvironment;bone marrow-derived mesenchymal stem cells
骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymalstem cells,BMSCs),是一种具有易于体外分离、扩增,多向分化等潜能的非造血干细胞[1,2]。凭借其独特的肿瘤趋向性和低免疫源性等优良特征,BMSCs不仅成为现代众学者热门研究的课题之一,亦被认为是用于临床细胞学治疗的最佳干细胞之一。但近期研究显示,BMSCs于肿瘤微环境中可出现形态及染色体等异常改变,进而发生恶性转化[3]。因此,寻找提高BMSCs临床应用安全性的有效措施已成为当务之急。扶芳藤,为卫矛科卫矛属植物,近代药理学认为其提取物具有抗氧化、提高免疫力及改善血流变等功效[4,5],笔者欲通过体外模拟肿瘤微环境,并加以扶芳藤提取液进行干预,检测肿瘤微环境中BMSCs增殖变化情况,以期观察该提取物对肿瘤微环境中BMSCs的保护作用。
1.材料与方法
1.1细胞 小鼠BMSCs细胞株(广州赛业生物科技有限公司,Catalog Number:MUBMX-01001);小鼠Hepa1-6肝癌细胞株(中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心,Catalog Number:TCM39)。
1.2药物[6]取1 kg扶芳藤,加入10倍量水(相比于干药材),不锈钢锅内蒸煮1 h后过滤,留取过滤液;药渣加入8倍量水(相比于生药量),煮开后文火煎30 min,过滤除渣,合并两次过滤液,浓缩至1000ml时,冷却;加入95%食用乙醇,混匀至乙醇浓度为80%,室温静置48 h(前24 h内需搅拌3~5次),过滤除渣,滤液于旋转回收器中回收乙醇至无醇,将无醇液体加热,浓缩为2.0 g/ml药物,4 ℃保存备用,使用时双蒸水稀释即可。
1.3 主要试剂与仪器 胎牛血清(Wisent公司,086-150),DMEM/F12培养基(Hyclone公司,SH30023),CCK-8试剂盒(上海碧云天公司,C0038)PI染液(美国SIGMA公司,P4170);研究级显微镜(日本奥林巴斯,IX81),流式细胞仪(美国Becton Dickinson,XL-100),酶标仪(美国BIO-RAD,IMARK)等。
1.4 细胞培养 小鼠BMSCs、小鼠Hepa1-6细胞培养及共培养体系均使用DMEM/F12完全培养基(含10%胎牛血清及100 U/mL青霉素+100 U/mL链霉素双抗),置于5% CO2、37℃饱和湿度培养箱中培养,待细胞汇合度约达75~80%时,0.25%胰蛋白酶消化,传代或冻存,本实验细胞分别选取第三代细胞作为共培养细胞。
1.5实验方法
1.5.1 CCK-8法筛选最适药物浓度[7]按照CCK-8试剂盒说明书,铺板,调整细胞至1×103个/孔,实验浓度设置为100、200、400、800 μg/mL扶芳藤提取液,每浓度预设6个复孔,分别于24 h、48 h、72 h终止培养,并于450 nm波长下分别测各组细胞OD值。
1.5.2共培养法模型建立 采用悬挂式非接触共培养小室-Transwell-3450,取对数生长期的BMSCs细胞,消化、调整浓度为2.5×103个/孔种植于Transwell下室内;同样取对数生长期的Hepa1-6细胞,消化、调整浓度为2.5×104个/孔种植于放有Transwell上室内,置于5% CO2、37 ℃饱和湿度孵箱中培养,3天换液一次,共培养7天。
1.5.3 实验分组 实验分为对照组(单独培养与模型组相同细胞密度BMSCs细胞);模型组(采用Transwell小室将BMSCs与Hepa1-6细胞共培养);干预组(最佳浓度扶芳藤提取液干预共培养模型)。共培养7天后,收集各组细胞,继续培养、扩增,指标检测。
1.5.4 CCK-8检测各组BMSCs细胞生长曲线变化[7] 按照CCK-8试剂盒说明书,铺板,整细胞密度至2×103个/孔,每天于450 nm波长下测各组BMSCs细胞OD值,测至第7天。
1.5.5 流式细胞术检测各组BMSCs细胞周期变化[8] 收集各组BMSCs,调整密度至2×106个/mL;磷酸盐缓冲液离心冲洗2~3次;弃上清,加入预冷70%乙醇,混匀后,4℃过夜固定;次日,低速离心,弃上清,磷酸盐缓冲液冲洗后重悬于50 μg/mL的PI染液,室温避光孵育30 min;流式细胞仪分析各组BMSCs细胞DNA含量,计算G1期及S期细胞比例。
2 结果
2.1不同浓度扶芳藤提取液对BMSCs、Hepa1-6细胞增殖的影响
由表1和表2可知,200 μg/mL 扶芳藤提取液对BMSCs增殖有促进作用,且能抑制Hepa1-6细胞增殖。本实验依据可促进BMSCs增殖且可抑制Hepa1-6增殖的最小药物浓度为最佳药物浓度,故选用200 μg/mL 扶芳藤提取液作为最佳浓度。
表1. 不同浓度扶芳藤提取液对BMSCs细胞增殖的影响( ,n=6)
☆表示与对照组比较,P<0.05;★表示与模型组比较,P<0.05
2.3扶芳藤提取液对各组BMSCs细胞周期的影响
由表4可知,模型组处于G1期的BMSCs细胞比例低于对照组,而S期比例增高;干预组处于G1期的BMSCs细胞比例高于模型组,S期细胞比例则降低。
表4. 扶芳藤提取液对各组BMSCs细胞周期的影响(%)
各周期对照组 模型组 干预组
G0/G1 73.5 42.1 61.0
S 25.4 56.1 32.7
3.讨论
由于BMSCs具有强大的增殖和多向分化的潜能,曾一度被称之为组织工程学理想的种子。然而,研究显示,BMSCs与肿瘤细胞可通过分泌细胞因子与信号分子等途径相互作用,导致BMSCs形态结构、生长、染色体等发生改变,进而诱导其发生异常转化[9,10]。其原因可能与体内外物理、化学等因素的影响有关,如何避免或减少物理、化学等因素对正常BMSCs的影响,成为了BMSCs安全应用临床的一道屏障。
扶芳藤,我国西南地区盛产,侗族、瑶族、哈尼族等多使用,最早记载于《本草拾遗》:“扶芳藤,味苦,小温,无毒,主一切血、一切气、一切冷,去百病……变白不老”。部分药理学证实扶芳藤提取液中含有卫矛醇、黄酮类、儿茶素类等成分,其用途广泛,效果明显[5]。肖艳芬[11]等研究证实扶芳藤提取液可提高免疫抑制小鼠免疫功能;肖健[12]等学者在建立大鼠脑缺血模型后,予以扶芳藤提取液进行治疗,发现该提取物对模型大鼠脑组织具有一定保护作用,且该作用可能与抑制白介素-6表达相关。鉴于扶芳藤提取液药理作用,笔者试通过细胞毒理试验筛选其最佳浓度干预体外模拟肿瘤微环境,观察该提取物是否对肿瘤微环境中BMSCs具有保护作用。
本实验通过细胞毒理实验筛选出200 μg/mL扶芳藤提取液作为药物最佳浓度,采用Transwell共培养小室,成功建立小鼠BMSCs与Hepa1-6肝癌细胞的共培养体系,结果发现与对照组相比,模型组 BMSCs细胞生长速度明显增快,且处于G1期的BMSCs细胞比例降低,S期比例增加,说明模型组BMSCs合成前期滞后,DNA合成期活跃,也就是RNA合成减少,DNA合成增加,细胞增殖旺盛;而经200 μg/mL扶芳藤提取液干预过模型后BMSCs细胞生长缓慢,处于G1期比例增加,S期细胞比例降低,说明200 μg/mL扶芳藤提取液可抑制促进RNA的合成,抑制DNA过度合成。
综上所述,扶芳藤提取液对肿瘤微环境中BMSCs异常增殖起到抑制作用,具有一定保护作用,然而扶芳藤提取液起到该作用的具体成份尚未明了,且体内、体外肿瘤微环境成分均较为复杂,细胞因子的含量变化、信号通路的异常表达等因素均可能引起肿瘤微环境中BMSCs增殖的异常。因此扶芳藤提取液抑制BMSCs异常增殖的作用机制仍需进一步深入研究。
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注:基金项目:广西中医药民族医药传承创新课题(GZLC16-24);广西中医药民族医药自筹经费科研课题,GZZC15-14;2016年度广西壮族自治区中青年教师基础能力提升项目(KY2016YB214)
*通讯作者:张曼,博士,讲师,中医药、民族医药防治情志病症研究
论文作者:张齐1,张曼2*(通讯作者),肖健1,运晨霞1,梁亮
论文发表刊物:《中国误诊学杂志》2017年第5期
论文发表时间:2017/6/26
标签:细胞论文; 肿瘤论文; 提取液论文; 浓度论文; 模型论文; 小鼠论文; 环境论文; 《中国误诊学杂志》2017年第5期论文;