关键词：16S rRNA；宏基因组；微生物；多样性
引言：从不同的角度出发，选择多种指数对微生物多样性进行度量分析，可以以系统发生树或者基本可操作分类单元为主，在实际操作过程中，则需要利用树形结构标识不同微生物之间的进化距离。基于此，以16S rRNA和宏基因组高通量测序为基础，以水体微生物、人体舌苔微生物（变量为是否有胃病）为样本，并对微生物多样性展开讨论，结合微生物序列数、不同分类水平的分类单元以及测序深度，实现微生物多样性特征及规律的检验与分析[1]。
116S rRNA基因与宏基因组高通量测序数据分析
在对16S rRNA与宏基因组测序进行分析时，以数据预处理、可操作分类单元划分、物种分类以及丰度信息注释的方式进行处理。一方面，16S rRNA的测序过程是化学反应过程，在试剂或者实验环境等因素的变化， 以DNA测序为基础，在对测序的质量控制进行分析时，提出含有未识别的碱基，根据序列的最低、平均或者类似准则来提出低质量序列。在此基础上，还需要进行双端序列拼接，由于不同物种高变区长度不同，所以需要确定重叠区域的位置，在实际研究的过程中，利用PANDAscp来完成双段序列连接。在预处理的过程中，以混合样本分离为最终目标，而且，以OYU为基础，通过序列比对相似度阈值的16S rRNA基因序列聚类分析，获得序列集合[2]。在利用统计模型的基础上，从序列参数以及物种类分类的角度进行控制，假设有k个OTU时，N为测序数据，则其概率公式如下：
在上述公式中，为k个高斯分布的混合比例，、为高斯分布的均值以及方差参数。此外，物种分类信息以树状结构为基础，其中包含界、门、纲、目、科、属、种等层次，在OTU划分下，则需要进行物种分类信息的注释。另一方面，在对宏基因组测序数据处理流程进行分析时，其数据预处理以测序质量控制以及“污染”序列剔除为中心。测序质量控制方面需要在16S rRNA的基础上，对序列末端质量低的碱基进行裁剪。在测序的过程中也是采用双端测序策略进行控制。利用物种进化树方面，则以“子树”比较及分析为基础，并通过分类水平控制，实现数据统计、微生物序列分析效果的进一步提升[3]。
216S rRNA和宏基因组高通量测序的对比分析
2.116S rRNA基因测序水体微生物
利用16S rRNA基因测序的方式对水体微生物进行研究，由于测序错误等级的影响，则需要对Alpha多样性进行分析，在对OTU划分进行过滤的基础上，选择多样本的方式进行分析，按照采样时间以及地点分组的方式，建立稀疏曲线，具体曲线变化如下：
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图1 Alpha多样性指数稀疏曲线
结合上述对比结果，（a）、（b）的样本是以地点分组为主，（c）、（d）是按照时间分组的方式进行分析。在对变化曲线进行分析的过程中，古细菌群落的Alpha多样性在时间方面有明显的变化，4-6月份呈现上升趋势，8-9月份呈现下降趋势，在9月之后，水华现象得到了有效的环境，微生物群落得到了恢复。在此基础上，还需要对beta的多样性进行分析，在进行分析的过程中，以古细菌、细菌数据的PCoA、UPGMA为主。
同一采样时间的样本在PCoA途中有更近的距离，在利用adonis方法进行计算的过程中，可以通过Permutation的方法检验显著性，在n为9999的条件下，古细菌群落的总差异为22%，细菌群落则为27%，这说明不同地点，两种细菌的差异比较显著，与Alpha多样性的结果保持一致。
2.2基于宏基因组测序的人体舌苔微生物
在对人体舌苔微生物进行检验及分析的过程中，以Metatongue样本与HMP样本进行比较分析的方式进行检验。基于此，在进行研究的过程中，将HMP各种身体位点共690个样本与167个舌苔样本混合，并以genus分类的方式，选择“是否有胃炎”这一变量进行分析，在对BMI值变化以及关系等方面进行检验的基础上，从原点到物种点位置的方向与变量方向夹角逐渐减小，说明两者之间的相关性越大。基于此，对样本特征进行检验时，根据相似度矩阵，实现微生物样本特征分析。
在舌苔样本比较的过程中，龈下、龈上菌斑、颊粘膜的样本差异并不明显，所以，从phylum到species的不同分类水平的角度进行比较分析，可以发现两组样本有显著差别。
由于Metaphlan的方法只是对已知基因组数据的物种进行分析，在此前提下，利用样本物种数、Simpson指数进行检验及分析，在差异评估下，以胃炎病人样本与健康人样本为对比，以此实现舌苔微生物群落变化的影响分析。在进行检验及分析的过程中，以Bonferroni多检验校正为手段，并通过物种分析以及样本数据分析的方式，实现微生物与宿主之间的关系检验与分析。结合上述结果可以发现，胃炎病人样本与健康人样本都是均匀的混合在一起，没有明显的分组痕迹，但是，在对species的显著性进行分析的过程中，性别对于舌苔微生物群落影响较小，胃炎和年龄两个因素产生的影响相对较大。这也说明BMI较低的人极容易得胃炎，此外，也证明了微生物与胃炎之间存在密切关系。
2.3典型对应分析
在对16S rRNA和宏基因组进行分析的过程中，需要考察物种与各个变量的关系。在基因序列对比分析的过程中，测序数据来源与16S rRNA基因序列不同，因此多样性分析存在明显差异。在Metaphlan方法的应用下，可以对物种检测结果进行分析，在胃炎标识物的后补species中，可以通过舌苔微生物诊断胃炎，在利用CCA分析可以对样本之间、物质之间的相似度、环境变化关系等方面进行分析，以此实现宏基因组对微生物多样性的真实检验效果提升。
结语：基于16S rRNA和宏基因组高通量测序的微生物多样性研究，以预处理、OTU划分、分类信息注释为基本流程，并以聚类分析的方式，利用基因数据库，实现微生物数据分析、多样性变化程度等方面的综合分析。在对水体微生物群落多样性变化程度进行分析的基础上，发现微生物群落结构与卫生之间存在相互关系，而且需要从显著差异的角度进行统计分析，以此实现水体微生物的检验分析。
参考文献
[1]许亚昆, 马越, 胡小茜. 基于三代测序技术的微生物组学研究进展[J]. 生物多样性, 2019, 27(5).
[2]刘永鑫, 秦媛, 郭晓璇. 微生物组数据分析方法与应用[J]. 遗传, 2019, 41(9).
论文作者:余敏红
论文发表刊物:《医师在线》2019年21期
论文发表时间:2020/3/24
标签：微生物论文; 宏基论文; 多样性论文; 样本论文; 进行分析论文; 序列论文; 舌苔论文; 《医师在线》2019年21期论文;