董淑禹1 赵娟2 孙君3 于明启4
1胶州市人民医院儿科；2胶州市人民医院儿科；3胶州市人民医院儿科；4胶州市人民医院儿科
摘要：目的探讨巨细胞病毒中枢神经系统感染患儿脑脊液（CSF）中VP1序列分子分型研究的临床价值。方法2010年1月至2013年12月胶州市人民医院和滨州医学院附属医院采用通用引物和VP1段分子分型引物分别对63例无菌性脑膜炎和脑炎患儿急性期和恢复期的CSF标本进行扩增，对VP1分型引物扩增阳性片段进行克隆、测序及分型研究。结果采用通用引物经2次PeR检测急性期患儿的CSF标本共47例（47／63，74．6％）阳性，恢复期仅3例（3／57，5．3％）阳性。采用分型引物经2次PCR检测通用引物扩增阳性的47例急性期的CSF标本共3l例（62．0％）阳性，其中4例脑炎和20例脑膜炎进行了序列测定。测序结果通过BLAST软件进行同源性对比分析，发现同一型别内序列同源性在97％-99％，不同型别之间同源性只有74％～76％，所有CSF进行病毒分离，11例（11／63，17．5％）阳性，阳性率明显低于VPl段分子分型的检测结果，除l例CSF标本病毒分离为ECHO 7的患儿，通用引物扩增阳性而VPl分型引物扩增失败外，其余血清型别与VPI段分子分型研究结果完全一致。结论巨细胞病毒是儿童无菌性脑膜炎和脑炎最重要的病原体；采用通用引物所建的RTPCR是快速检测巨细胞中枢神经系统感染的有效方法；分型引物扩增VPl部分序列并测序，与GENBANK中的巨细胞病毒标准毒株进行对比，根据基因序列的同源性进行巨细胞病毒分型，为巨细胞病毒的分型及巨细胞病毒中枢神经系统感染、临床诊断研究提供了新的方法和思路。
关键词：VPl；RT．PCR；巨细胞病毒；分型
l对象与方法
1．1研究对象为2010年1月至2013年12月胶州市人民医院和滨州医学院附属医院临床诊断为无菌性脑膜炎、脑炎的住院患儿，诊断标准依据第7版诸福棠《实用儿科学》。入院当天及恢复期（症状体征消失）分别收集1．0mL CSF标本。急性期63例，包括7例脑炎和56例脑膜炎，其中男性4l例、女性22例；年龄11日龄至12岁，平均6．7岁；恢复期57例。所有CSF均做细菌培养及常规检查。
1．2实验方法
1．2．1引物的设计与合成通用引物为巨细胞病毒基因组5’端非编码区保守序列，引物1：5 7．TcCGGccccTGAATGcDGCTAAT-3’，弓l物2：5’?CACYGGATGGCCAATCCA-3’，扩增产物为194bp的片段。通过检索基因文库，未发现该引物与自然界经常引起人类感染的巨细胞病毒以外的其他病毒和细菌间有同源序列。
期刊文章分类查询,尽在期刊图书馆为了最多的血清型能够被扩增，分型引物设计了3条简并引物"（02：5’ATGTAYGTICCICCIGGIGG-3’、03：5'-ATGTAYRTICCIMCIGGIGC．3’、01：5'-GCIC．cIGAYTGITGIccRAA_3’），引物02和03分别与引物Ol扩增。引物设计考虑到了VPI氨基酸序列的变异和密码子的简并性，四重密码子简并处设计为脱氧次黄嘌呤核苷。扩增片段为450bp的片段，含VPI区3’端及2A区5 7末端的基因片段。
1．2．2 巨细胞RNA的提取和RT—PCR 巨细胞RNA的提取采用改良的异硫氰酸胍一步法哺J。逆转录合成cDNA及PCR扩增按常规进行。
1．2．3 巨细胞 VPl区序列分析应用分型引物对巨细胞VPl段进行RT—PCR后，产物经上海博亚生物技术有限公司琼脂糖凝胶回收系统回收纯化。由于简并引物产物不能直接进行测序，先将产物构建载体连接人质粒后转染进入巨细胞病毒，然后进行克隆测序，测序引物使用M13R（-48），使用ABl3730型DNA序列自动分析仪。
1．2．4 巨细胞型别确定序列结果输入GENBANK，用BLAST程序进行相序列的比较，分析结果同源性最高的序列即为相同型别。研究中采用的巨细胞参比序列均取自GENBANK数据库。
2结果
2．1 无菌性脑膜炎和脑炎患儿CSF中巨细胞病毒感染的RT．PCR
2．1．1 通用引物1次RT．PCR检测，63例无菌性脑膜炎、脑炎患儿CSF 43例（68．2％）阳性；对1次RT．PCR检测阴性标本进行2次RT．PCR检测又检出阳性结果4例。采用通用引物经2次RT—PCR在急性期共获得阳性结果47例（74．6％），统计结果显示，1次和2次RT—PCR检测无菌性脑膜炎、脑炎患儿急性期CSF中巨细胞RNA的阳性率差异无统计学意义。恢复期57例标本2次扩增后3例阳性。
2．1．2分型引物通用引物扩增阳性的47例脑脊液标本利用分型引物1次RT．PCR扩增检测得到阳性13例，经过2次RT—PCR又检出阳性18例，采用分型引物经2次RTPCR共获得阳性结果3l例（62．O％），其中脑炎4例，脑膜炎27例。1次RT—PCR和2次RT-PCR比较，差异有统计学意义。
2．2 巨细胞临床毒株的分型研究结果3l例VPI段分型引物扩增阳性的巨细胞脑膜炎和脑炎患儿的CSF标本。选择20例脑膜炎和4例脑炎进行了序列测定，测序结果通过BLAST软件进行同源性比对分析，发现同一型别内序列同源性在97％～99％。而不同型别之间同源性只有74％一76％。结果显示，1l例（11／63，17．5％）急性期的CSF阳性，阳性率明显低于VPl段分子分型的检测结果，除l例CSF标本
病毒分离为ECHO 7的患儿，通用引物扩增阳性而VPl分型引物扩增失败外，其余血清型别与VPl段分子分型研究结果完全一致。
3讨论
巨细胞病毒是世界范围内引起病毒性中枢神经系统感染最常见的病原体，RT-PCR方法作为广泛的常规的实验室方法，是巨细胞病毒诊断的金标准。巨细胞病毒（cytomegalovirus，CMV）是一类在自然界普遍存在但又具有严格种属特异性的病毒，属β疱疹病毒亚科，为人巨细胞病毒（HCMV）。人巨细胞病毒在人群中感染非常普遍，大多数呈临床不显性感染或潜伏感染，多数人在儿童或少年期受HCMV感染后获得免疫，但是在免疫能力低下如胎儿和新生儿、先天性免疫缺陷病、器官移植和艾滋病患者则可引起神经系统感染称为巨细胞病毒性脑炎，也称巨细胞包涵体脑炎；
参考文献：
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[4]陈宗波，董永绥，方峰，等．一种从脑脊液中提取病毒RNA和DNA的新方法[J]．中华医学检验杂志，1998，21（2）d08?109．
论文作者:董淑禹1,赵娟2,孙君3,于明启4
论文发表刊物:《健康世界》2015年5期供稿
论文发表时间:2015/10/23
标签：引物论文; 阳性论文; 巨细胞论文; 病毒论文; 脑炎论文; 序列论文; 脑膜炎论文; 《健康世界》2015年5期供稿论文;