金晓露[1]2016年在《白藜芦醇抵御奶牛乳腺上皮细胞氧化应激的作用机制研究》文中认为乳腺上皮细胞是乳汁合成的主要场所,与乳产量和乳品质密切相关。乳腺上皮细胞在生理及病理阶段,易发生氧化应激。抵御乳腺上皮细胞的氧化应激和增强其抗氧化能力是维持乳腺健康和高效泌乳的有效手段。白藜芦醇是一种高效的抗氧化剂,大量研究发现了它的保健和治疗功效,然尚无研究将其用于健康的乳腺抗氧化研究。本研究首先采用H2O2刺激MAC-T细胞构建了奶牛乳腺上皮细胞氧化应激模型,评价了白藜芦醇抵御乳腺上皮细胞氧化应激的效果。然后利用分子生物学手段探索了白藜芦醇通过Nrf2-ARE信号通路、MAPK及PI3K/AKT等信号通路对乳腺上皮细胞抵御氧化应激的保护作用机理。最后通过向哺乳期ICR小鼠日粮中添加低剂量及高剂量的白藜芦醇检测白藜芦醇在哺乳期饲喂的安全性,并明确其对乳腺的氧化还原平衡及对Nrf2-ARE信号通路的调控作用。主要研究结果如下：1.白藜芦醇保护奶牛乳腺上皮细胞抵御H2O2诱导的氧化损伤1.1构建H2O2诱导的奶牛乳腺上皮细胞氧化应激模型。采用了不同浓度不同时间的H2O2刺激MAC-T检测细胞增殖、细胞死亡率、ROS蓄积情况、细胞的氧化平衡情况、细胞内线粒体损伤(BAX和BCL2)和内质网损伤指标(GPR78和CHOP)基因的表达变化,结果发现500μM H2O2处理MAC-T细胞24 h可以引起显着地细胞活力损失,导致细胞凋亡发生,处理MAC-T细胞12 h引起显着地ROS过量产生,并伴随着总抗氧能力和超氧化物歧化酶活性的下降,500μM H2O2处理导致GPR78和CHOP基因表达在4h达到最大,BAX/BCL2最大值则在24h出现。由此确定500μM以上H2O2处理MAC-T细胞引起细胞氧化损伤,主要表现为细胞活力损伤、细胞死亡加剧、氧化还原平衡被破坏,并伴随着线粒体及内质网损伤,并在后续研究中采用500μM H2O2处理MAC-T细胞构建氧化应激损伤模型。1.2明确白藜芦醇对H2O2诱导的奶牛乳腺上皮细胞氧化损伤的保护效果。采用不同浓度白藜芦醇处理MAC-T细胞确定MAC-T 24 h内能够耐受的白藜芦醇的最高浓度是S0μM。接着基于前期构建的氧化应激模型,采用50μM以下不同浓度的白藜芦醇或溶剂对照预处理2h而后加入H2O2或PBS的处理特定时间来检测细胞增殖、细胞死亡率、ROS蓄积情况、细胞的氧化平衡情况、细胞内线粒体损伤(BAX和BCL2)和内质网损伤指标(GPR78和CHOP)基因的表达变化。结果发现,较之H2O2处理,白藜芦醇预处理后再加入H2O2的细胞活力损失、细胞凋亡率、细胞内的ROS蓄积程度随白藜芦醇的浓度的增加而下降。而且白藜芦醇的添加增加了细胞的总抗氧化能力。50μM白藜芦醇削弱了H2O2诱导的线粒体损伤和内质网损伤。结果显示白藜芦醇可以保护乳腺上皮细胞抵御H2O2诱导的氧化损伤2.白藜芦醇保护乳腺上皮细胞抵御H2O2诱导的氧化损伤的作用机制2.1检测白藜芦醇及H2O2处理对奶牛乳腺上皮细胞中Nrf2-ARE-抗氧化酶链的作用。首先检测白藜芦醇和H2O2单独/组合处理MAC-T后细胞内的抗氧化关键基因XNRD1、 HO-1、XCT、NQO-1的表达丰度变化,发现白藜芦醇预处理后无论是否有H2O2刺激,细胞内的抗氧化关键基因表达在特定的时间内均被激活表达,且较之H2O2单独处理组,白藜芦醇+H2O2处理的抗氧化基因均在8h显着增强。采用不同浓度白藜芦醇处理细胞后加入H2O2刺激发现白藜芦醇对于抗氧化基因的表达具有剂量依赖性,有报道证实这些基因是Nrf2-ARE信号通路的靶基因。接着我们检测发现白藜芦醇促进了H202处理下Nrf2蛋白的核转移程度,并促进了细胞内的ARE原件的激活。由此证实白藜芦醇激活了细胞内的Nrf2-ARE-抗氧化链。2.2明确白藜芦醇依赖Nrf2发挥奶牛乳腺细胞保护作用。通过siRNA沉默Nrf2基因表达后重新评估白藜芦醇的保护效果,研究发现细胞内的Nrf2-ARE-抗氧化链的关键靶基因表达在H2O2和白藜芦醇+H2O2处理中均被抑制。而且siRNA沉默Nrf2基因表达后白藜芦醇预处理不能保护细胞免受H2O2诱导的细胞活力损失,甚至siRNA沉默Nrf2基因表达后H2O2处理导致的内质网应激加剧。由此得出白藜芦醇是通过Nrf2-ARE信号通路实现保护乳腺上皮细胞的作用的。2.3探索白藜芦醇通过MAPK、PI3K/AKT信号通路对Nrf2-ARE信号通路激活的作用。检测白藜芦醇及H2O2单独/组合处理MAC-T后细胞内AKT、ERK1/2、JNK1/2、p38的磷酸化水平的时间剂量作用,结果发现H202单独处理激活了所有上述信号转导关键蛋白的活化,而白藜芦醇预处理则延长了AKT及ERK1/2的磷酸化时间。后期采用抑制剂预处理抑制细胞内PI3K/AKT、ERK1/2、JNK1/2、p38信号通路的激活,再采用白藜芦醇及H2O2单独/组合处理发现白藜芦醇可能是通过EKR、PI3K/AKT信号通路激活Nrf2-ARE信号通路实现保护乳腺上皮细胞的作用,而p38信号通路则抑制了白藜芦醇对Nrf2-ARE信号通路的激活作用及细胞保护作用的发挥。3.日粮添加白藜芦醇对哺乳期小鼠乳腺氧化损伤及生产性能的影响该部分采用单因素多水平试验探索了日粮中添加白藜芦醇对哺乳期ICR小鼠乳腺的抗氧化作用,白藜芦醇的添加剂量为0、0.02%、0.2%。通过母鼠采食量、体重、器官分数、乳腺重量变化发现白藜芦醇的添加不会对母鼠这些指标造成负面影响,通过间接法评估乳产量也未发现白藜芦醇具有促进乳产量的作用。对仔鼠的窝重,日增重及器官发育分数检测发现白藜芦醇不会对仔鼠以上发育指标产生负面作用,提示哺乳期食入一定剂量白藜芦醇是安全的。通过采集母鼠的乳腺、肝脏、肾脏等器官检测器官总抗氧化能力、脂质过氧化物、超氧化物歧化酶酶活力,发现白藜芦醇的添加显着降低了泌乳期ICR小鼠乳腺中的脂质过氧化程度,减少氧化损伤,而对肝脏和肾脏则无上述效果。同时对乳腺的抗氧化基因mRNA表达的检测发现,0.2%白藜芦醇添加的小鼠乳腺中SOD2、GPX1、PRX1、TXNRD1的基因表达显着上调,而0.02%以上的白藜芦醇添加小鼠乳腺中TXNRD1、HO1、Nrf2蛋白表达均显着上调,提示日粮添加白藜芦醇可以减少哺乳期小鼠乳腺氧化损伤,促进Nrf2-ARE-抗氧化链信号通路。综上所述,本研究成功构建了奶牛乳腺上皮细胞氧化应激模型,利用此模型研究了白藜芦醇在乳腺上皮细胞中的抗氧化损伤作用及其机制,并采用在体实验证实了白藜芦醇的乳腺保护作用及其对Nrf2-ARE-抗氧化链的调节作用。其中Nrf2-ARE-抗氧化链在乳腺抗氧化应激和细胞存活中发挥重要作用,白藜芦醇可能通过PI3K/AKT、ERK通路影响Nrf2-ARE-抗氧化链从而调控乳腺中的氧化还原平衡。本研究也为白藜芦醇在奶牛乳腺保护中的应用提供研究基础及提示。
冯苗[2]2016年在《白藜芦醇抑制人结肠癌细胞增殖和诱导凋亡及与COX-2关系的研究》文中认为结肠癌是严重危害人类健康的主要恶性肿瘤之一,多数病人发现时已属晚期,早期患者接受根治性手术联合辅助治疗,但约半数病人术后仍死于转移和(或)复发。以5FU、伊立替康、奥沙利铂、卡培他滨等为基础的化疗药物疗效达到平台,化疗药天然不敏感或很快耐受,且毒副作用大引起大家关注。因此,寻求低毒高效的天然植物成分成为近几年来结肠癌抗肿瘤药物开发的热点。白藜芦醇(resveratrol)是一种重要的植物抗毒素,广泛存在于葡萄、花生、桑葚中。各项研究显示,白藜芦醇存在抗炎、抗氧化、抗血栓、抗突变等生物活性剂药理作用。同时人们发现白藜芦醇还具有显着的抗肿瘤作用,主要表现为抗细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡、干预细胞信号转录、增强抑癌基因活性及抑制癌基因表达。环氧合酶(COX)是催化花生四烯酸生成前列腺素过程中重要的限速酶,其主要产物是前列腺素PGE2,PGD2等。它包含两种亚型:COX-1和COX-2。近年来很多研究围绕COX-2在肿瘤发生发展过程中的作用机制进行,并取得重大进展。研究发现,COX-2与人类上皮来源的恶性肿瘤尤其是消化系统恶性肿瘤有密切的联系,研究表明COX-2在结肠肿瘤中表达增高。在肝癌、乳腺癌等研究中发现白藜芦醇具有较强的抑制COX-2的药理作用,且白藜芦醇能通过抑制COX的环氧合酶活性和氢过氧化物酶活性而在肿瘤促进阶段起抑制作用。目前白藜芦醇抗肿瘤作用在多种肿瘤包括肝癌、乳腺癌、胃癌等体外细胞实验及动物模型上得到证实,但目前白藜芦醇的抗肿瘤作用机制尚不十分明确。因此,有必要研究白藜芦醇对结肠癌的抗肿瘤活性及其相关机制。本研究以人结肠癌SW480细胞株为实验对象,研究白藜芦醇对结肠癌细胞增殖及凋亡的影响及机制,并探讨其抗肿瘤作用与COX-2的关系,以期为其在结肠癌治疗方面提供新的基础理论依据。第一部分白藜芦醇对人肠癌细胞增殖、凋亡的影响及其作用机制探讨目的:体外观察白藜芦醇对SW480肠癌细胞株增殖及细胞周期的影响,并探讨白藜芦醇促进肠癌凋亡的可能相关分子机制。方法:将SW480人肠癌细胞株于37℃、5%CO2条件下进行培养。1、待细胞呈对数生长,接种于96孔培养板,设实验组、空白组、阴性对照组,经不同浓度白藜芦醇(0,10,20,30,50ug/ml)作用不同时间(24h,48h,72h)后应用MTT法检测白藜芦醇对细胞增殖的影响,并计算IC50;2、将细胞接种于6孔板,设置空白对照组、不同浓度给药组,应用流式细胞术检测细胞凋亡周期。3、以RT-PCR法检测不同浓度白藜芦醇作用48h后,细胞凋亡相关基因bcl-2、bcaspase-9和caspase-3 m RNA表达水平的变化。结果:1、MTT比色结果显示:白藜芦醇能明显抑制SW480人肠癌细胞增殖,随着药物浓度(0-50ug/ml)递增及作用时间的延长(24h、48h及72h),其抑制率明显延长,范围为17.4-57.1%,呈显着浓度-时间依赖性。低浓度时(≤10ug/ml),肿瘤抑制作用不显着。相同浓度白藜芦醇作用48h及72h抑制率均比24h高,具有统计学意义(P<0.05)。相同浓度白藜芦醇作用72h抑制率比48h高,无统计学意义。白藜芦醇作用于SW480人肠癌细胞24h、48h及72h的IC50值分别为91.19±0.017ug/ml,32.58±0.022ug/ml及29.49±0.024ug/ml。2、流式细胞术分析结果提示:(1)随着白藜芦醇浓度(0,20,30,50ug/ml)逐渐增大,早期凋亡比例从3.8至15.7%,晚期凋亡所占比例为0.9-32.2%,凋亡细胞总比例从4.7增加至47.9%,呈明显浓度依耐性。(2)不同浓度白藜芦醇作用SW480人肠癌细胞株,S期细胞比例增加,G1期的细胞比例减少,提示白藜芦醇能诱导SW480细胞S期阻滞。3、RT-PCR检测结果显示:随着白藜芦醇浓度(0,20,30,50ug/ml)逐渐增大,bcl-2/GAPDH光密度积分值的比值呈降低的趋势(p﹤0.001);caspase-9/GAPDH及caspase-3/GAPDH各浓度组光密度积分值的比值呈增高的趋势(p﹤0.001)。结论:(1)一定浓度的白藜芦醇作用于对人肠癌SW480细胞具有增殖抑制和促进凋亡的作用,且成时间-浓度依耐性。(2)白藜芦醇诱导SW480细胞S期阻滞,进而诱导细胞凋亡。(3)白藜芦醇作用于肠癌SW480细胞,通过下调Bcl-2基因表达,上调caspase-9及caspase-3基因表达,从而引发细胞色素C-Apaf-1-caspase-9-caspase-3凋亡通路的激活可能是其诱导细胞凋亡的机制之一。第二部分白藜芦醇抗肿瘤作用与COX-2的关系目的:探讨白藜芦醇对SW480肠癌细胞株的抗肿瘤作用与COX-2之间的关系。方法:1、设计叁条COX-2 siRNA引物转染SW480人肠癌细胞,采用RT-PCR筛选出最佳的靶向COX-2 si RNA进行后续转染,利用MTT法检测COX-2表达被抑制后细胞增殖的情况。2、Western-Blotting实验:将CCD-18Co正常人结肠细胞及SW480、HT29人肠癌细胞株细胞株于37℃、5%CO2条件下进行培养。呈对数生长后接种到96孔板,利用Western-Blotting检测正常人肠细胞及肠癌细胞COX-2蛋白表达的区别。同一条件下培养SW480人肠癌细胞24h,分别加入不同浓度白藜芦醇(10、20、30及50ug/ml)作用48h,设空白组对照组。利用Western-Blotting检测不同浓度白藜芦醇对肠癌细胞COX-2及PGE2蛋白表达的影响。靶向COX-2 si RNA转染SW480细胞后72h,加入30ug/ml浓度白藜芦醇作用48h。设阴性对照组、药物作用组、单纯转染组及转染后药物作用组。利用Western-Blotting检测白藜芦醇作用于转染后SW480细胞的COX-2蛋白表达的变化。结果:1、经光密度扫描分析显示:COX-2 siRNA转染72 h后,1号、2号及3号COX-2si RNA转染组和空白对照及阴性对照组相比,COX-2/GAPDH光密度积分值的比值均显着降低(P﹤0.05),提示COX-2 si RNA转染后,COX-2m RNA表达受到抑制。其中2号COX-2 si RNA抑制COX-2 m RNA表达作用更强,故以2号序列作为COX-2 RNAi设计作为后续转录实验。2、MTT实验结果提示:与空白对照组及阴性si RNA转染对照组相比,2号COX-2si RNA转染SW480细胞后48h后细胞增殖开始受到抑制,72h细胞增殖抑制明显(P<0.05)。提示COX-2si RNA转染后,SW480细胞增殖受到抑制。3、Western-Blotting实验结果提示:(1)正常人结肠细胞CCD-18Co及人结肠癌细胞SW480、HT29中均表达COX-2蛋白。正常人结肠细胞CCD-18Co的COX-2/β-actin光密度积分值比值低于人结肠癌细胞SW480、HT29,差异具有统计学意义(P<0.05)。提示COX-2蛋白在结肠癌中的表达高于正常人结肠细胞。(2)随着白藜芦醇浓度递增(0-50ug/ml),COX-2及PGE2与β-actin光密度积分值的比值均逐渐降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。提示随着白藜芦醇作用浓度的提高,SW480细胞COX-2表达及PGE2表达下降,且呈浓度依赖性的。(3)COX-2 si RNA转染组与β-actin光密度积分值的比值较阴性对照组降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。提示COX-2 si RNA转染后可降低COX-2蛋白的表达。白藜芦醇30ug/ml作用于COX-2 si RNA转染组后,其COX-2与β-actin光密度积分值的比值与单纯转染组比较,下降更明显(P<0.05)。进一步提示白藜芦醇作用后能降低SW480细胞COX-2蛋白的表达。结论:(1)结肠癌中COX-2蛋白的表达高于正常人结肠细胞。(2)COX-2与结肠癌细胞的生长密切相关,抑制结肠癌细胞中COX-2表达可抑制结肠癌细胞生长。(3)白藜芦醇对肠癌SW480细胞的生长抑制作用可能与其抑制COX-2及PGE2表达有关。
王东[3]2017年在《间充质干细胞联合白藜芦醇治疗实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠的作用与机制研究》文中提出多发性硬化是以中枢神经系统炎性脱髓鞘为特点的自身免疫性疾病,目前尚无安全有效的治疗方法。实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠是研究多发性硬化常用的动物模型。白藜芦醇是一种天然多酚类化合物,具有抗炎抗氧化特性,研究显示其对多种自身免疫性疾病有治疗作用。间充质干细胞具有多向分化潜能、免疫调控和自我复制等特点,对多发性硬化有潜在的治疗作用。我们通过探讨间充质干细胞联合白藜芦醇治疗实验性自身免疫性脑脊髓炎的作用和机制,为治疗多发性硬化提供新的思路。本研究分叁部分,现将各部分内容概述如下。第一部分白藜芦醇对实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠血脑屏障完整性的影响目的:研究白藜芦醇对于实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)小鼠的疾病进程缓解的机制,探究白藜芦醇对EAE小鼠的血脑屏障完整性的影响。方法:使用8-10周龄的C57BL/6雌鼠实验,将抗原MOG35-55用生理盐水稀释成5mg/ml,并按1:1等体积加入完全弗氏佐剂(其中结核杆菌H37Ra终浓度为4mg/ml)混合,乳化后按每只0.1ml于小鼠脊柱两侧分四点皮下注射,第0h及第48h腹腔注射500ng 0.5ml百日咳毒素(PTX),建立EAE小鼠模型。免疫在乙醚麻醉和充分固定下进行。采用Knoz 5分评分法对实验小鼠临床评分。通过50天观察小鼠的临床评分,来判断EAE小鼠使用或者不使用不同剂量白藜芦醇处理前后临床评分情况。在免疫后21天通过小鼠尾静脉注射伊文思蓝染液后将小鼠脑组织速冻,切片拍照观察脑部的完整性;通过免疫印迹技术检测白藜芦醇处理后跨膜紧密连接蛋白ZO-1,occludin和claudin-5的表达情况。并同时检测细胞间粘连分子ICAM-1和血管粘附蛋白VCAM-1的表达变化。利用实时定量PCR检测促炎基因i NOS和IL-1、抗炎基因arginase 1及NADPH氧化酶的表达;ELISA法检测血清细胞因子IL-10水平。利用lucigenin实验检测NADPH氧化酶的活性,从而观察白藜芦醇对氧化压力的缓解作用。结果:1白藜芦醇治疗能够降低EAE小鼠的疾病严重性。在50天的观察期内,使用10 mg/kg的白藜芦醇并不能抑制疾病的发生进程,高剂量25mg/kg和50 mg/kg均能显着的降低EAE的疾病严重性,使用25mg/kg和50 mg/kg的白藜芦醇相对于PBS组的平均和最大临床评分都显着降低。2使用25mg/kg或是50mg/kg白藜芦醇处理EAE小鼠与对照组相比,可以显着的防止伊文思蓝染液进入脑部的量。而10mg/kg的白藜芦醇效果与对照组没有显着差异。3白藜芦醇处理可以显着改善EAE诱导的紧密连接蛋白的丢失。通过免疫印迹技术检测发现ZO-1、occludin和claudin-5的表达在EAE小鼠中显着降低,而使用25mg/kg或是50mg/kg白藜芦醇可以显着抑制ZO-1,occludin和claudin-5蛋白的丢失。4白藜芦醇能够抑制EAE小鼠脑组织中ICAM-1和VCAM-1蛋白的上调。免疫印迹结果显示在EAE小鼠脑组织中ICAM-1和VCAM-1蛋白表达显着升高。而使用25mg/kg或是50mg/kg白藜芦醇处理可以降低ICAM-1和VCAM-1蛋白的表达。5在EAE小鼠中促炎基因i NOS和IL-1显着的升高,25mg/kg或是50mg/kg白藜芦醇可以显着抑制两者的水平,而同样在EAE小鼠中,局部的抗炎基因arginase 1和细胞因子IL-10的表达轻微的上调,使用25mg/kg或是50mg/kg白藜芦醇后可以显着上调两者的表达,而10mg/kg白藜芦醇并不影响这两种分子的表达。6白藜芦醇可以显着抑制EAE小鼠NADPH氧化酶(NOX)的表达量和活性。EAE小鼠表达有升高的NOX1、NOX2和NOX4。白藜芦醇的处理并不影响NOX1的表达,但是可以显着抑制NOX2和NOX4的上调,用25mg/kg或是50mg/kg白藜芦醇同样也可以抑制EAE小鼠中NADPH氧化酶的活性。第二部分白藜芦醇对间充质干细胞在氧化应激和炎症环境的保护作用目的:小鼠来源的间充质干细胞已经被证明对实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠有一定的神经保护作用,但是由于脑脊髓炎小鼠体内的氧化应激环境和炎症环境容易影响间充质干细胞的生物活性,进而影响干细胞的治疗效果。我们通过体外实验探讨白黎芦醇对间充质干细胞在这两种环境下的保护作用。方法:从6-8周龄的C57BL/6的腿骨中取出骨髓细胞,进行传代培养,取第4代培养细胞用于实验研究。使用抗Sca-1,CD14,CD34,CD44和CD45的抗体标记,通过流式细胞术鉴定从小鼠体内提取的间充质干细胞。骨髓间充质干细胞(m BM-MSCs)分别经过20ng/ml的肿瘤坏死因子-α(TNF-α)或500m M的过氧化氢(H_2O_2)的处理,TNF在培养环境中持续存在;过氧化氢处理4小时。在体外培养的第1,3和5天MTT法测定细胞增殖和上清液乳酸脱氢酶(LDH)测定细胞损伤;应用不同浓度的白藜芦醇(0.1、1、10μmol/L)预处理m BM-MSCs,重复上述培养过程。结果:1采用贴壁持续培养的小鼠骨髓细胞经流式抗体标记,鉴定后确实带有间充质干细胞的表面标记蛋白。使用抗Sca-1,CD14,CD34,CD44和CD45的抗体标记,通过流式细胞术鉴定出从小鼠体内提取出的骨髓细胞经体外培养6周后,分离出带有间充质干细胞表型的一群细胞亚群,而这群细胞主要是小鼠来源的间充质干细胞。2白藜芦醇能够降低H_2O_2和TNF-α诱导的细胞毒性。通过MTT检测细胞活性并检测上清液LDH的泄漏表明,H_2O_2(500 m M)或是TNF-α(20 ng/m L)能够显着降低细胞生存并升高LDH的泄漏。而白藜芦醇能够降低这种细胞毒性。第叁部分间充质干细胞联合白藜芦醇对实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠炎症的影响目的:研究间充质干细胞联合白藜芦醇治疗缓解EAE小鼠疾病进程的机制,探究联合治疗对EAE小鼠炎症的作用。方法:通过观察小鼠的临床评分,来判断EAE小鼠使用间充质干细胞联合白藜芦醇处理的效果。通过H&E染色和抗CD4的免疫组化检测单核细胞和T淋巴细胞对于脊髓组织的浸润。利用ELISA检测白藜芦醇和间充质干细胞处理后EAE小鼠血清中Th1型细胞因子IFN-γ/TNF-α和Th2型细胞因子IL-4/IL-10的表达量。结果:1间充质干细胞联合白藜芦醇治疗能够显着降低EAE小鼠的疾病严重程度。使用白藜芦醇联合间充质干细胞可以显着的延缓EAE疾病进程。间充质干细胞或是白藜芦醇治疗后能够显着降低平均的临床评分(PBS处理组中平均临床评分为2.63±0.42;m BM-MSCs处理组1.34±0.31;白藜芦醇处理组1.44±0.38;PBS组与m BM-MSCs相比P<0.01;PBS组与白藜芦醇处理组相比P<0.01)和最大临床评分(PBS组3.76±0.32;m BM-MSCs处理组1.83±0.27;白藜芦醇处理组1.74±0.31;PBS组与m BM-MSCs组相比P<0.01;PBS与白藜芦醇组相比P<0.01)。而两者联用比单独使用效果更好(联用的平均临床评分0.64±0.27;m BM-MSCs组与联用相比P<0.01;白藜芦醇组与联用相比P<0.01;联用最大临床评分0.91±0.22;m BM-MSCs组与联用组相比P<0.01;白藜芦醇处理组与联用组相比P<0.01)。2间充质干细胞和白藜芦醇联合使用可以降低EAE小鼠脊髓中的炎症细胞数目。使用H&E染色和抗CD4的免疫组化检测发现EAE小鼠脊髓中的炎性单核细胞和T细胞的浸润显着升高,而单独使用间充质干细胞或是白藜芦醇与PBS组对比可以显着降低浸润细胞的数目(PBS组与m BM-MSCs处理组相比P<0.05;PBS组与白藜芦醇处理组相比P<0.01),而间充质干细胞联合白藜芦醇可以更加显着的降低炎性细胞的浸润(m BM-MSCs处理组与联合治疗组相比P<0.01;白藜芦醇处理组与联合治疗组相比P<0.01)。3间充质干细胞联合白藜芦醇能够促进EAE小鼠中Th1型向Th2型细胞因子的转变。在单独使用间充质干细胞或是白藜芦醇处理的EAE小鼠中Th1型细胞因子IFN-γ/TNF-α显著的降低,而Th2型细胞因子IL-4/IL-10的表达量显着升高(IFN-γ:PBS处理组与m BM-MSCs处理组P<0.01;PBS处理组与白藜芦醇处理组相比P<0.01;TNF-α:PBS处理组与m BM-MSCs处理组相比P<0.01;PBS处理组与白藜芦醇处理组相比P<0.01;IL-4:PBS处理组与m BM-MSCs处理组相比P<0.01;PBS处理组与白藜芦醇处理组相比P<0.01;IL-10:PBS处理组与m BM-MSCs处理组相比P<0.01;PBS处理组与白藜芦醇处理组相比P<0.01)。而间充质干细胞联合白藜芦醇治疗后这种细胞因子转换效果更加显着。(IFN-γ:m BM-MSCs处理组与联合治疗组相比P<0.01;白藜芦醇处理组与联合治疗组相比P<0.05;TNF-α:m BM-MSCs处理组与联合治疗组相比P<0.05;白藜芦醇处理组与联合治疗组相比P<0.05;IL-4:m BM-MSCs处理组与联合治疗组相比P<0.05;白藜芦醇处理组与联合治疗组相比P<0.05;IL-10:m BM-MSCs处理组与联合治疗组相比P<0.01;白藜芦醇处理组与联合治疗组相比P<0.01)。结论:1白藜芦醇可以显着保护EAE小鼠的血脑屏障完整性。白藜芦醇单独使用可以有效降低EAE疾病的严重性,可以显着的防止伊文思蓝染液进入脑部的量。可能是通过抑制紧密连接蛋白ZO-1、occludin和claudin-5的丢失,抑制EAE小鼠脑组织中上调的粘附因子ICAM-1和VCAM-1蛋白,抑制EAE小鼠促炎基因i NOS和IL-1的表达,上调抗炎基因arginase 1和细胞因子IL-10的表达,抑制EAE小鼠NADPH氧化酶的表达量和活性来实现。2 H_2O_2或是TNF-α模拟的氧化应激和炎症环境能够显著降低间充质干细胞生存并升高LDH的泄漏。白藜芦醇能够降低H_2O_2和TNF-α诱导的对间充质干细胞的细胞毒性作用。3间充质干细胞联合白藜芦醇治疗可以显着的延缓EAE疾病进程,同时联合治疗能够显着降低小鼠EAE模型的疾病严重性,从而改善EAE疾病的临床评分。可以降低EAE小鼠脊髓中的炎症细胞数目,并且间充质干细胞和白藜芦醇能够促进EAE小鼠中Th1型向Th2型细胞因子的转变。
丁大法[4]2016年在《Db/db小鼠肾脏足细胞自噬与凋亡变化及白藜芦醇干预影响及机制研究》文中研究表明背景:糖尿病患者约30%可合并糖尿病肾病(DN),缓慢进展引起尿毒症;在欧美、日本等发达国家,糖尿病肾病已经是慢性肾病(CKD)及尿毒症的最主要病因。所以探索糖尿病肾病的发病机制,为治疗糖尿病肾病提供新靶点具有重要意义。近年来研究发现,肾小球脏层上皮细胞,即足细胞(podocyte)在糖尿病肾病蛋白尿产生及发展过程中起重要作用,因此,保护足细胞免受损伤是阻断DN发生和进展的关键所在。但目前对导致足细胞损伤的确切细胞内信号机制尚不清楚。而且,目前治疗糖尿病肾病的手段还很有限,更缺乏保护足细胞、减少其凋亡的有效治疗药物。自噬是细胞对多种应激的适应性反应,能够降解受损的细胞器和蛋白质,从而维持细胞内环境的稳定。自噬对肾脏有保护作用,正常情况下,体内肾脏足细胞保持高水平的基础自噬,而糖尿病肾病时足细胞自噬活性下降。白藜芦醇(Resveratrol),化学名为芪叁酚(3',5',4'-trihydroxystibene),属于非黄酮类多酚化合物,具有清除自由基、抗炎症、抗肿瘤等多种药理作用。在链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠、db/db小鼠的研究中白藜芦醇干预能减轻蛋白尿、改善肾功能,但白藜芦醇作用的靶点和作用的机制均未完全明确。截止目前,白藜芦醇对糖尿病肾病蛋白尿形成的关键机制足细胞凋亡的影响、白藜芦醇如何影响高糖状态下足细胞凋亡的作用机制,如调控足细胞自噬及信号机制等目前均未见报道。本研究观察白藜芦醇是否能够通过激活足细胞自噬,减少高糖状态下足细胞凋亡,降低糖尿病小鼠蛋白尿产生,延缓糖尿病肾病的进展。研究目的:白藜芦醇通过自噬减轻db/db小鼠肾脏足细胞凋亡,降低蛋白尿产生,延缓糖尿病肾病进展。研究方法:第一部分:白藜芦醇改善dbd/db小鼠肾功能,降低蛋白尿产生。8周龄的雌性小鼠共18只,其中C57BL/KsJ db/db小鼠12只,C57BL/KsJ db/m小鼠6只,适应性喂养1周后开始实验。将12只db/db小鼠随机分为模型组、白藜芦醇治疗组,每组6只;6只db/m小鼠为正常对照组。治疗组小鼠采用白藜芦醇10mg/(kg·d)的剂量灌胃,连续给药12周。给药结束后,处死叁组小鼠,称体重、肾重,用代谢笼收集24h尿标本检测尿微量白蛋白量,采血检测血糖、尿素氮和肌酐,血压检测。第二部分:白藜芦醇对db/db小鼠足细胞自噬和凋亡的影响;1.体内动物模型观察肾小球足细胞自噬和凋亡:db/m小鼠为正常对照组、db/db小鼠、db/db小鼠+白藜芦醇治疗组叁组观察就12周结束后,留取肾组织,透射电镜观察小鼠足细胞自噬变化,免疫组化和免疫荧光法检测小鼠肾脏足细胞标记蛋白synaptopodin、自噬标记蛋白LC3Ⅱ变化。留取肾组织行HE、PAS染色,透射电镜观察肾脏足细胞和基底膜的改变,免疫组化和免疫荧光法法检测小鼠肾脏足细胞标记蛋白nephrin和synaptopodin、凋亡蛋白cleavedcaspase-3蛋白的表达水平的变化。2.体外细胞培养观察足细胞自噬和凋亡:体外培养人足细胞,37℃C分化成熟后不同糖浓度(5.6、11.1、20、30 mmol/L)刺激 24h,western blot 检测Cleavedcaspase-3、Bax 的表达变化。30 mmol/L 高糖干预 0、6、12、24、36、48 h,western blot 检测 Cleavedcaspase-3、Bax、Atg5、P62 和 LC3-Ⅱ 的表达情况,明确高糖对体外培养的足细胞自噬和凋亡的影响。(2)白藜芦醇(0、5、10、15μmol/L)和高糖(30 mmol/L)共同刺激足细胞48h,western blot检测上述蛋白的表达情况。分对照组、高糖组(30mmol/L)、高糖(30mmol/L)加白藜芦醇(15 μmol/L)组、高糖(30mmol/L)加白藜芦醇(15 μmol/L)+巴伐洛霉素 A1(bafilomycin A,10nM)组干预足细胞 48h,运用 Annexin V-FITC/PI双染流式细胞技术检测细胞凋亡率,透射电镜观察自噬体的形成变化,细胞免疫荧光技术检测Cleaved caspase-3、Atg5、P62和LC3-Ⅱ的表达情况。体外培养人足细胞,转染GFP-LC3后分为对照组、高糖组(30 mmol/L)、高糖(30mmol/L)加白藜芦醇(15 μmol/L)组,高糖(30mmol/L)加白藜芦醇(15 μmol/L)+巴伐洛霉素A1(bafilomycin A,10nM)组刺激48h后应用荧光显微镜观察GFP-LC3蛋白荧光的变化,明确白藜芦醇对高糖状态下体外培养的足细胞自噬和凋亡的影响。第叁部分:白藜芦醇可能通过增加足细胞自噬通路,降低高糖诱导足细胞凋亡。体外培养人足细胞,3-MA预刺激2h后分组予以高糖及白藜芦醇干预,western blot检测LC3Ⅱ、Cleaved caspase-3、Bax蛋白的表达变化。足细胞转染Atg5 shRNA后予以高糖和白藜芦醇干预,western blot技术检测上述蛋白的表达变化,Annexin V-FITC/PI双染流式细胞技术检测细胞凋亡率,透射电镜观察自噬体的变化,明确抑制足细胞自噬后白藜芦醇干预及高糖状态下足细胞凋亡的影响。结果:第一部分:(1)db/db模型组和白藜芦醇治疗组小鼠初始体重无差异,白藜芦醇治疗后有下降趋势但仍高于正常组;db/db模型组和白藜芦醇治疗组小鼠肾重/体重指数无显着差异。(2)db/db模型组和白藜芦醇治疗组小鼠血糖和血压水平无显着差异,但较正常组小鼠有明显升高;与正常组小鼠相比,db/db小鼠血尿素氮和肌酐、24小时尿微量白蛋白水平均明显升高,白藜芦醇治疗后较模型组有明显下降。第二部分:白藜芦醇对db/db小鼠足细胞自噬和凋亡的影响;(1)与正常组小鼠相比,db/db小鼠肾小球组织足细胞nephrin表达量明显减少,白藜芦醇治疗后肾小球足细胞nephrind蛋白的表达量较前增加。(2)与正常组小鼠相比,db/db小鼠肾小球足细胞LC3 Ⅱ、synaptopodin蛋白表达明显减少,cleaved caspase-3蛋白表达增多;白藜芦醇治疗后,LC3Ⅱ、synaptopodin蛋白表达增加,cleaved caspase-3蛋白表达减少。(3)与正常组小鼠相比,肾脏HE和PAS染色结果示db/db模型组小鼠肾小球肥大,毛细血管基底膜增厚,系膜区增宽,经过白藜芦醇治疗后病变程度减轻。(4)与正常组小鼠相比,透射电镜示db/db模型组小鼠肾小球基底膜增厚,足细胞数量减少,足突增宽、融合,白藜芦醇治疗组与模型组比较足突病变减轻。(5)高糖处理足细胞36h,Atg5和LC3-Ⅱ蛋白的表达有所下降,至48h出现明显下降,但是P62蛋白增加。加入白藜芦醇后Atg5和LC3-Ⅱ蛋白的表达上调,P62蛋白表达降低,自噬小体数量增多,GFP-LC3绿色荧光颗粒数目增多,LC3-Ⅱ蛋白(红色荧光)的阳性表达升高。高糖组同时加入白藜芦醇和巴伐洛霉素A1时候,自噬流受阻,P62增加,Atg5和LC3-Ⅱ蛋白的表达上调。(6)高糖刺激足细胞后Cleaved caspase-3和Bax的表达呈现浓度和时间依赖性增高,加入白藜芦醇后Cleaved caspase-3和Bax的表达降低,细胞凋亡率下降,Cleaved caspase-3蛋白(红色荧光)减少。第叁部分:白藜芦醇降低高糖诱导足细胞凋亡的部分机制通过增加足细胞自噬通路。3-MA抑制自噬后LC3-Ⅱ蛋白表达下降,p62增加,Cleaved caspase-3、Bax蛋白表达增高。转染Atg5 shRNA后LC3-Ⅱ蛋白表达下降,Cleaved caspase-3、Bax蛋白表达增高,自噬体数目明显减少,早期凋亡率增加。提示足细胞自噬增加是白藜芦醇降低高糖诱导足细胞凋亡的机制之一。结论:第一部分:白藜芦醇改善db/db小鼠肾脏肾功能,降低蛋白尿,延缓糖尿病肾病进展;第二部分:在高糖培养的足细胞中,我们实验观察到自噬体逐渐增加,到24小时高峰,随后48小时降低;而在db/db小鼠肾脏模型中,自噬一直是降低的;白藜芦醇干预后增加db/db小鼠肾脏足细胞自噬,降低高糖诱导足细胞凋亡。第叁部分:分析了白藜芦醇可以通过增加足细胞自噬,降低足细胞凋亡,明确了足细胞自噬增加是白藜芦醇降低高糖诱导足细胞凋亡的机制之一。
殷向静[5]2016年在《山葡萄果实转录组分析及白藜芦醇调控机理研究》文中研究说明葡萄是世界上重要的果树之一,具有很高的经济价值。白藜芦醇是一种二乙烯苯类化合物,在植物抗病过程中发挥重要作用。葡萄属植物富含白藜芦醇,在近些年得到了广泛的研究。葡萄中白藜芦醇的合成能够受到许多生物和非生物胁迫因素的诱导,如葡萄白粉菌的侵染、紫外胁迫和激素处理等,其中紫外照射已成为人工诱导葡萄快速合成白藜芦醇的有效手段之一。目前对于白藜芦醇在葡萄中积累的调控机理等研究尚未深入。中国野生葡萄中的一些株系具有高含白藜芦醇的特质,因此探究其调控机理能够为利用中国野生葡萄优质基因资源进行葡萄品种遗传改良奠定基础。本研究首先测定了中国野生葡萄不同种及株系间白藜芦醇含量,挑选不同发育时期中国野生葡萄通化3号和塘尾果实为研究材料,运用转录组测序技术进行葡萄白藜芦醇含量差异的分子机理研究;其次以中国野生山葡萄通化3号果实为研究材料进行紫外处理并测定白藜芦醇含量,选取紫外处理后不同时间果实进行转录组测序分析,从转录水平分析了葡萄果实受紫外辐射后基因的表达变化,初步探讨了紫外线与果实中白藜芦醇生成和积累的可能原因;后期本研究在分析芪合成酶基因表达模式的基础上筛选出可能与果实中白藜芦醇含量相关的芪合成酶基因,获得转基因番茄植株并对相关启动子活性进行了研究,可为后期葡萄品种改良提供基因资源。取得的主要结果如下:1.通过测定不同葡萄株系/品种中白藜芦醇的含量,发现山葡萄通化3号从绿果期到成熟期白藜芦醇变化较大,绿果期未检测到而成熟期白藜芦醇含量为2.19μg/g,刺葡萄塘尾在叁个发育时期都未检测到白藜芦醇。根据白藜芦醇含量高低挑选通化3号和塘尾果实绿果期和成熟期进行转录组分析,两个材料不同时期对比分别得到差异基因1861和2234个,其中下调表达差异基因较多,得到了136个差异表达的转录因子;富集途径差异分析表明塘尾的富集代谢途径数量高于通化3号;激素途径分析表明在葡萄果实通化3号发育时期JA途径及其相关的调控基因上调表达较多,而SA途径基因多下调表达;苯丙氨酸途径中通化3号上调基因数量高于塘尾,而塘尾中白藜芦醇氧葡萄糖基转移酶表达高于通化3号。以上研究揭示葡萄果实发育过程有较多生理途径参与,诱导葡萄产生白藜芦醇的机理也较复杂,其中不同激素之间的调控作用、转录因子调控以及芪合成酶基因及其上下游基因等均可能参与了相关的调控表达。2.采用HPLC对中国野生山葡萄通化3号成熟葡萄果实紫外处理后测定其白藜芦醇含量并选取4 h和24 h的葡萄果实采用I11umina HiSeq 2000技术进行测序,从转录组水平上比对分析了紫外处理后基因的表达差异,在4 h和24 h分别获得882和1058个差异基因,且上调表达基因较多;通过不同代谢途径的富集分析发现紫外处理后苯丙氨酸途径,JA,Eth和SA激素途径等变化显着;通过对关键途径差异基因分析发现紫外处理在强烈诱导苯丙氨酸途径相关基因的表达的同时,也会抑制花色素苷途径基因的表达。初步分析了紫外处理诱导生成和积累白藜芦醇的可能原因。3.采用RT-PCR技术克隆得到1570bp中国野生山葡萄通化3号芪合成酶基因启动子序列,命名为PVaSTS36,Genbank登录号为KU376402。通过中国野生山葡萄通化3号芪合成酶基因启动子序列元件预测分析发现该启动子上有多个光诱导响应元件;将该启动子与GUS基因融合后在烟草中进行瞬时表达,测定其对紫外照射的响应活性并用实时荧光定量技术检测GUS基因的表达模式,结果表明紫外照射对芪合成酶基因启动子的活性具有正调控的作用。4.利用半定量技术对葡萄芪合成酶基因家族在不同组织中的表达模式进行研究,发现STS基因在不同组织中表达存在差异;同时在通化3号和塘尾果实发育时期分析葡萄芪合成酶基因的表达模式,结果显示大多数芪合成酶基因在果实中随着果实发育呈现出渐强的表达趋势。综合前期结果筛选出可能与白藜芦醇含量高低相关的芪合成酶基因VaSTS19和VdSTS19,利用同源克隆法得到两个基因序列,ORF长度均为1179bp,编码392个氨基酸;随后利用农杆菌介导法将VaSTS19和VdSTS19转入番茄中后测定转基因植株白藜芦醇的含量,结果显示在两个基因的转基因番茄植株的果实转色期和成熟期都能检测到白藜芦醇且含量差异较小,说明芪合成酶基因的表达模式和白藜芦醇的产生规律可能与上游启动子类型和调控有关。5.通过同源克隆法得到1461bp的山葡萄通化3号和1457bp的刺葡萄塘尾芪合成酶基因启动子PVaSTS19和PVdSTS19,序列比对发现VaSTS19启动子序列与中国野生华东葡萄白河35-1芪合成酶基因启动子序列同源性为48%,与欧洲葡萄Optima的芪合成酶启动子PVst-2的序列在整体上同源性达到了60%;随后对这两个启动子进行了5’端缺失分析,将该启动子及其缺失体与GUS基因融合后在烟草中进行瞬时表达,测定其对不同激素处理的响应活性,结果表明PVaSTS19和PVdSTS19及其缺失体对水杨酸和茉莉酸甲酯诱导响应明显,但对乙烯诱导响应不明显;PVaSTS19受水杨酸诱导活性最高缺失体区域为-1197bp,而PVaSTS19受茉莉酸甲酯诱导活性最高的区域为-1384bp;PVdSTS19受水杨酸诱导活性最高缺失体区域为-868bp,而PVdSTS19受茉莉酸甲酯诱导活性最高的区域为-1194bp。表明不同芪合成酶基因启动子中含有的顺式作用元件的种类和分布不同,对不同激素处理的响应也有差别,最终导致芪合成酶基因产生有差异的表达模式。
吴春福, 杨静玉, 王芳, 王笑笑[6]2013年在《白藜芦醇的植物来源、药理活性及应用(英文)》文中认为在过去的数十年中,白藜芦醇作为一种广为人知的化合物,表现出多种生物活性。大量的研究表明,白藜芦醇作为一种天然产物,不仅具有潜在的应用价值,而且对多种人类疾病有治疗作用且副作用较小。本文综述了白藜芦醇的生物来源、药理作用及临床应用现状。
孙希岚[7]2008年在《白藜芦醇的分离纯化和溶解度的测定与关联》文中指出白藜芦醇是一种具有多酚结构的植物抗毒素,广泛存在于葡萄、花生、虎杖等常见的植物资源中。白藜芦醇具有抗癌、抗菌、抗炎、抗氧化、调节激素、防治心血管疾病等多种有益于人类健康的生物药理活性。由于白藜芦醇具有广泛的保健功能和较高的经济价值,近年来,从植物资源中提取和纯化白藜芦醇的工艺研究已成为人们关注的热点。从天然产物中提取分离及纯化活性成分的工艺研究,涉及到提取与纯化过程中所用溶剂的选择以及混和溶剂的配比问题。深入研究天然活性物质在各种溶剂体系中的固液相平衡,则可以为优化工艺提供理论依据与指导,具有重要的现实意义。本论文第一章为文献综述部分,主要介绍了白藜芦醇的研究历史、物化性质、药理作用、生物来源以及合成方法,并在此基础上阐述了本论文研究的主要内容。本论文第二章建立了一种简单、准确度和灵敏度高、重现性好的分析白藜芦醇的HPLC方法,并依此方法进行白藜芦醇对光的稳定性研究。本章还通过研究不同配比的丙酮—水溶液对白藜芦醇的洗脱能力,优化大孔吸附树脂提取分离白藜芦醇的条件。并且进行了重结晶正交实验,得到最优的乙醇—水溶液配比、用量以及结晶次数。本论文第叁章用平衡法研究了白藜芦醇的固液相平衡,依靠HPLC分析方法测定了不同温度下白藜芦醇在十一种纯溶剂、乙醇+水和丙酮+水混合溶剂体系中的溶解度。本论文第四章用叁参数简化方程对各种体系中白藜芦醇的溶解度数据进行简单的关联拟合,结果理想。利用NRTL方程和UNIQUAC方程关联拟合了白藜芦醇在纯溶剂体系中的溶解度数据,得到白藜芦醇和溶剂之间的相互作用参数,相比NRTL方程而言,UNIQUAC方程在此处略显优势。在乙醇+水和丙酮+水混合溶剂体系中,用UNIQUAC方程拟合溶解度数据得到相互作用参数,比较计算值与实验值之间的差异,讨论用该方程关联拟合白藜芦醇在叁元体系中溶解度的可行性。本论文第五章中,我们整理了本文的工作并作出总结,提出欠缺之处,明确了后续的研究方向。
GE, Jiao, LIU, Yan, LI, Qiang, GUO, Xia, GU, Ling[8]2013年在《Resveratrol Induces Apoptosis and Autophagy in T-cell Acute Lymphoblastic Leukemia Cells by Inhibiting Akt/mTOR and Activating p38-MAPK》文中指出白藜芦醇合酶基因转化草莓的研究
刘亭亭[9]2017年在《白藜芦醇通过SIRT1介导的翻译后修饰抑制假鳃鳉肝脏肿瘤发生的机理》文中进行了进一步梳理肝癌是世界上致死率较高的疾病之一。肝癌的发生是一个多分子介导的过程。现阶段,多项研究致力于探究肝癌发生的分子机理。除了体外不同的癌细胞系之外,在体内水平上常用来研究肝脏肿瘤发生的动物模型有大鼠、小鼠和斑马鱼等等。科研工作者在药物诱导的大鼠、异种移植癌细胞的裸鼠及转基因的小鼠和斑马鱼中探究肝癌发生的分子机理。然而,由于这些动物寿命较长,利用它们进行自发肿瘤方面的研究还比较少。贡氏假鳃鳉(Nothobranchius guentheri)的平均寿命为12个月,是一种常用来研究衰老的短寿命的脊椎动物模型。我们之前的研究揭示贡氏假鳃鳉肌肉中氧化损伤的水平和皮肤中β半乳糖苷酶的活性随老化逐渐升高。近些年来在贡氏、弗氏和高氏假鳃鳉中的研究表明假鳃鳉正在成为一种研究自发肿瘤的动物模型。但是这些研究只是探究了不同组织器官在不同发育时期的肿瘤发生率,具体的分子机理尚不清楚。因此本文将利用贡氏假鳃鳉探究肝脏自发肿瘤发生的分子机理。白藜芦醇是一种存在于多种植物中的多酚类化合物。在不同细胞和生物体中,白藜芦醇均可发挥抗氧化、抗炎症、抗衰老和抗肿瘤的作用。SIRT1是一种组蛋白依赖的去乙酰化酶,作为SIRT1的活化剂,白藜芦醇可通过SIRT1发挥其抗氧化、抗衰老和抗肿瘤的作用。然而,有关白藜芦醇抗癌症的研究主要是在体外癌细胞、药物诱导癌症的大鼠、异种移植癌细胞的裸鼠或转基因的动物模型中进行的,利用它对自发肿瘤发生机理的研究还比较少见。因此,本文中利用一年生的贡氏假鳃鳉作为实验对象,总共362条鱼(对照组和处理组各181条鱼),用来探究白藜芦醇对老化诱导的肝脏自发肿瘤的影响及其分子机理。由于贡氏假鳃鳉的平均寿命是12个月,这里我们分别选取6、9和12月龄的鱼代表青年、中年和老年。待贡氏假鳃鳉生长至性成熟时,我们随机地将其分为白藜芦醇处理组和对照组。实验组的鱼从4月龄开始喂食白藜芦醇,每天每条鱼约进食25μg的白藜芦醇,直至这些鱼生长至6、9和12月龄。在此叁个不同的年龄阶段,我们分别通过实时定量PCR、免疫印迹、免疫组化和免疫共沉淀等方法检测各组鱼的相对肝重、血清肝脏标志酶的活性、肝脏肿瘤的发生率、自发肿瘤的大小和恶化程度、细胞增殖和细胞凋亡以及SIRT1、PCNA、K-Ras、PI3K、p-AKT、Fox O1、Fox O3a、Ac-Fox O1、p-Fox O3a、DLC1、Bcl-2、Bax和cleaved caspase-3/7/9等蛋白的表达。我们的研究结果表明:1.白藜芦醇长期处理降低了相对肝重和血清肝脏标志酶的活性。与6月龄相比,贡氏假鳃鳉的肝重和相对肝重在9和12月龄显着升高;白藜芦醇在这两个阶段降低了肝重和相对肝重;白藜芦醇对两组鱼的体重并没有显着性的影响。与6月龄相比,9和12月龄血清中AST和ALT的活性显着升高,白藜芦醇缓解了这两种肝脏血清标志酶随老化的升高趋势。2.白藜芦醇降低了肝脏自发肿瘤的形成和生长。6月龄的贡氏假鳃鳉肝脏组织结构正常,并未出现自发肿瘤。贡氏假鳃鳉生长至9月龄时出现自发肿瘤。通过对30条9月龄和20条12月龄贡氏假鳃鳉肝脏组织进行切片,我们发现随着老化的进程,自发肿瘤的发生率逐渐升高,9月龄对照组的肿瘤发生率为86.67%,12月龄时接近100%;白藜芦醇处理后显着降低了肿瘤发生,9和12月龄肝脏中肿瘤的发生率分别降至60%和80%。白藜芦醇还抑制了自发肿瘤的生长,减小了肿瘤的体积,延缓了肿瘤的恶化程度。在肝脏自发肿瘤中,突变p53染色呈阳性,这表明贡氏假鳃鳉肝脏中的这些肿瘤结节为恶性肿瘤;白藜芦醇长期处理降低了突变p53的蛋白水平。3.白藜芦醇提高了肝脏中SIRT1的表达。利用叁个不同发育阶段的贡氏假鳃鳉,我们首次发现,肝脏中SIRT1的表达在老化的过程中逐渐下降。白藜芦醇处理会缓解年龄诱导的SIRT1的下降趋势,在6、9和12月龄时都显着提高了SIRT1的表达水平。对照组鱼的肝脏部分肿瘤结节中SIRT1表达水平下降;而白藜芦醇处理后,肿瘤结节中SIRT1的表达有所提升。这表明在贡氏假鳃鳉中SIRT1可以作为一种抑癌因子。4.白藜芦醇通过SIRT1介导的翻译后修饰抑制K-Ras/PI3K/AKT途径降低肝脏肿瘤中的细胞增殖。在9和12月龄时,通过对增殖标志PCNA的检测,我们发现白藜芦醇抑制了贡氏假鳃鳉肝脏自发肿瘤中的细胞增殖。在此两个阶段,白藜芦醇还降低了K-Ras、PI3K和p-AKT的蛋白水平。贡氏假鳃鳉肝脏中两种内源性蛋白SIRT1和K-Ras相互作用,形成蛋白复合体。在12月龄时,白藜芦醇还通过SIRT1去乙酰化酶降低肝脏中K-Ras的乙酰化水平。因此我们推测,白藜芦醇是通过上调SIRT1的表达来降低K-Ras的乙酰化水平,下调K-Ras/PI3K/AKT信号通路,进而抑制肝脏自发肿瘤中的细胞增殖。白藜芦醇通过SIRT1及其介导的翻译后修饰抑制细胞增殖来降低自发肿瘤的形成和生长。5.白藜芦醇通过SIRT1调节Fox Os和DLC1介导的信号通路促进肝脏自发肿瘤中的细胞凋亡。在6月龄时,两组鱼的肝细胞基本不发生凋亡。在9和12月龄时,对照组细胞凋亡比率分别是0.216%和1.497%,处理组凋亡细胞的比率分别是1.630%和3.965%;在9和12月龄时,白藜芦醇显着提高了肝脏组织中细胞凋亡的比率。在12月龄时,白藜芦醇处理组肝脏细胞的凋亡主要发生在自发肿瘤处;而在对照组中,肿瘤部位的肝细胞并未发生细胞凋亡。在12月龄时,白藜芦醇降低了贡氏假鳃鳉肝脏中Fox O1和Fox O3a的表达,也降低了Fox Os的翻译后修饰(Ac-Fox O1和p-Fox O3a)水平。在9和12月龄时,白藜芦醇显着提高了DLC1的表达。在贡氏假鳃鳉肝脏中,内源性的DLC1与SIRT1相互结合形成蛋白复合体,而且白藜芦醇促进这两种蛋白的结合。在9月龄时,白藜芦醇降低了DLC1的磷酸化水平。在12月龄时,白藜芦醇显着上调了促凋亡蛋白(Bax和cleaved caspase-3,7,9)的表达,下调了抗凋亡蛋白Bcl-2的水平。我们推测在贡氏假鳃鳉中,白藜芦醇可通过SIRT1介导的翻译后修饰调节Ac-Fox O1和p-Fox O3a的表达水平,通过提高DLC1的表达及其与SIRT1的相互作用,上调促凋亡蛋白的水平,进而诱导肝脏自发肿瘤中的细胞凋亡。总之,在6月龄时贡氏假鳃鳉的肝脏中并未出现自发肿瘤,而我们在9月龄的贡氏假鳃鳉肝脏中发现了自发肿瘤,且此发生率在12月龄接近100%。贡氏假鳃鳉中年龄依赖的肿瘤发生率的升高趋势,可能是由于SIRT1表达随年龄下降导致的。白藜芦醇长期处理提高了SIRT1的表达并降低了肝脏中自发肿瘤生长。白藜芦醇通过SIRT1介导的翻译后修饰调节K-Ras/PI3K/AKT信号途径进而抑制肝脏自发肿瘤的增殖。白藜芦醇通过SIRT1调节Fox Os的翻译后修饰,上调SIRT1与DLC1的相互结合,改变Bcl-2家族蛋白的表达水平,进而在贡氏假鳃鳉的肝脏自发肿瘤中促进细胞凋亡。在贡氏假鳃鳉中,白藜芦醇长期喂食处理通过SIRT1介导的翻译后修饰抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡来降低肝脏中自发肿瘤的形成和生长。我们的这些结果表明SIRT1在抑制自发肿瘤形成和发展过程中的重要作用,也证实了一年生的贡氏假鳃鳉的确是一种可用于自发肿瘤相关研究的良好的脊椎动物模型以及白藜芦醇可以作为一种潜在的天然药物来治疗肝脏自发肿瘤。
李珍[10]2017年在《白藜芦醇对局灶性脑缺血/再灌注大鼠海马神经元损伤的影响及其分子机制》文中研究指明随着人口老龄化的加剧,脑血管疾病的发病率明显上升,而且发病趋势有逐渐年轻化的迹象。缺血性神经元损伤是威胁人类健康的重要原因之一,但目前仍缺乏切实有效的防治措施。不同于其他组织细胞,神经元更容易因受到各种有害刺激而死亡。海马是与空间学习记忆功能密切相关的一个重要的脑区,其中CA1区锥体神经元对缺氧、缺血特别敏感,受到的损伤也最为严重,而且成年大脑海马CA1区的再生能力非常低。因此,如何预防和保护缺血性神经元损伤一直是脑卒中、脑创伤等疾病的主要治疗策略。白藜芦醇(Resveratrol,Res),非黄酮类多酚化合物,化学名称为3,4,5-叁羟基二苯乙烯,在虎杖、葡萄、黎芦、决明、花生等植物中含量较为丰富。研究表明,Res能抑制N-甲基-D-天门冬氨酸(NMDA)受体介导的Ca2+内流,促进突触的形成及突触的生长。目前普遍认为,缺血性脑损伤时神经元死亡可因NMDA受体过度激活引起,推测Res有可能是通过调控脑缺血引起的由NMDA受体介导的细胞内钙超载,阻断凋亡信号的转导。作为经典的MAPK信号转导途径,ERK1/2信号通路激活后,能明显抑制因脑缺血/再灌注损伤的NMDA受体活性,减少Ca2+内流,进而对缺血神经元发挥保护作用。CREB是受ERK1/2调节的一种重要的核转录因子,在神经系统中发挥着十分重要的作用,激活CREB可促进神经元的存活,而抑制CREB则促进神经元的凋亡。大量研究表明,磷酸化肌醇磷脂3位羟基的激酶(phosphoinositide 3-kinase,PI3K)和其主要下游靶目标Akt共同构成一条重要的PI3K-Akt抗凋亡信号转导通路,很多神经营养因子、中药均能通过激活PI3K-Akt信号通路发挥神经保护作用。缺血性脑损伤亦有凋亡相关基因Bcl-2、Bax的参与,Bcl-2与Bax的比值能决定细胞是否凋亡。虽然目前已有文献报道了Res对缺血性脑损伤具有保护作用,但有关Res对缺血再灌注脑损伤预防和保护作用的有效时间窗以及Res作用的具体分子机制目前鲜有报道。本研究分以下两部分来阐明Res对缺血诱导的神经元损伤的调控作用:(1)NMDA受体介导的ERK1/2-CREB信号转导通路在Res预处理对大鼠缺血性海马CA1区神经元损伤保护中的作用;(2)Res慢性给药对脑缺血再灌注后海马区pAkt及凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax表达的影响。通过本课题的研究,可以为缺血性脑损伤的药物治疗提供新的靶点,为临床治疗提供一定的理论依据。1.白藜芦醇预处理通过ERK1/2-CREB信号转导通路,阻止局灶性脑缺血/再灌注诱导的大鼠海马CA1区神经元损伤在本研究中我们发现,(1)90 min MCAO引起大鼠缺血侧脑梗死体积及海马CA1区锥体神经元死亡数量显着增加;在缺血前1 h、4 h进行Res(30 mg/kg)预处理明显缩小了脑梗死体积,海马CA1区锥体神经元死亡数量亦明显降低;(2)90 min MCAO导致大鼠空间学习记忆功能减退,逃避潜伏期明显延长;在缺血前1 h、4 h进行Res预处理,均明显改善了大鼠的空间学习记忆功能;(3)探讨在脑缺血前30 min侧脑室注射MK-801(NMDA受体阻断剂)对Res作用的影响。结果显示,在MCAO前30 min侧脑室注射MK-801,能明显减少缺血引起的海马CA1区神经元死亡;对于在缺血前1 h Res预处理的大鼠,Res给药前30 min侧脑室注射MK801,阻断了Res的神经保护作用;而对于在缺血前24 h进行Res预处理的大鼠,Res给药前30 min侧脑室注射MK801则无效;(4)进一步探讨对于在缺血前1 h或24 h进行Res预处理的大鼠,在Res给药前30 min侧脑室注射U0126(ERK1/2抑制剂)对Res作用的影响。结果显示,在缺血前30 min侧脑室注射U0126,加重了缺血导致的海马CA1区神经元死亡;对于在缺血前1 h进行Res预处理的大鼠,侧脑室注射U0126阻断了Res的神经保护作用,而对于在MCAO前24 h进行Res预处理的大鼠,U0126则无效;(5)在缺血再灌注第5天,与MCAO组相比,在缺血前1 h进行Res预处理使缺血侧海马CA1区pERK1/2及pCREB的表达明显增加,而在Res给药前30 min侧脑室注射U0126则降低了pERK1/2及pCREB的表达。提示ERK1/2-CREB信号转导通路参与了Res对缺血性脑损伤的神经保护作用。2.再灌注后白藜芦醇慢性给药通过上调海马pAkt及Bcl-2的表达、下调Bax的表达减轻缺血性脑损伤本研究中继续使用90 min MCAO法制备局灶性脑缺血大鼠模型,从缺血再灌注3 h后开始连续4 d对大鼠腹腔注射Res(30 mg/kg),(1)HE染色结果显示,90 min MCAO导致海马CA1区大约82%的神经元死亡,Res慢性给药能明显减少MCAO引起的海马CA1区神经元死亡;TUNEL染色结果显示,MCAO导致海马CA1区大约87%的神经元凋亡,Res慢性给药使海马CA1区神经元凋亡数量明显减少;(2)90 min MCAO导致海马CA1区LTP诱导障碍,Res慢性给药可以恢复LTP的诱导;(3)局灶性脑缺血导致海马CA3-CA1区基础的突触传递功能障碍,但是突触前的功能没有受到影响。Res慢性给药可以改善脑缺血所致的突触传递功能障碍;(4)Western blot结果显示Res慢性给药使Res+MCAO组大鼠海马区pAkt表达明显升高,但对Res+Sham组大鼠pAkt的表达没有明显影响;(5)与Sham组相比,MCAO组大鼠海马区Bcl-2表达下降、Bax表达升高,Bcl-2/Bax比值下降;而Res慢性给药使Res+MCAO组大鼠海马区Bcl-2表达上调、Bax表达下调,Bcl-2/Bax比值增加。结论:本研究发现,在缺血前1 h Res预处理通过激活NMDA受体介导的ERK1/2-CREB信号转导通路阻止海马CA1区神经元损伤;在缺血后的一定时间内进行慢性Res给药通过上调pAkt、Bcl-2的表达、下调Bax的表达,对海马CA1区神经元发挥保护作用。
参考文献：
[1]. 白藜芦醇抵御奶牛乳腺上皮细胞氧化应激的作用机制研究[D]. 金晓露. 浙江大学. 2016
[2]. 白藜芦醇抑制人结肠癌细胞增殖和诱导凋亡及与COX-2关系的研究[D]. 冯苗. 南昌大学. 2016
[3]. 间充质干细胞联合白藜芦醇治疗实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠的作用与机制研究[D]. 王东. 河北医科大学. 2017
[4]. Db/db小鼠肾脏足细胞自噬与凋亡变化及白藜芦醇干预影响及机制研究[D]. 丁大法. 南京医科大学. 2016
[5]. 山葡萄果实转录组分析及白藜芦醇调控机理研究[D]. 殷向静. 西北农林科技大学. 2016
[6]. 白藜芦醇的植物来源、药理活性及应用(英文)[J]. 吴春福, 杨静玉, 王芳, 王笑笑. 中国天然药物. 2013
[7]. 白藜芦醇的分离纯化和溶解度的测定与关联[D]. 孙希岚. 浙江大学. 2008
[8]. Resveratrol Induces Apoptosis and Autophagy in T-cell Acute Lymphoblastic Leukemia Cells by Inhibiting Akt/mTOR and Activating p38-MAPK[J]. GE, Jiao, LIU, Yan, LI, Qiang, GUO, Xia, GU, Ling. Biomedical and Environmental Sciences. 2013
[9]. 白藜芦醇通过SIRT1介导的翻译后修饰抑制假鳃鳉肝脏肿瘤发生的机理[D]. 刘亭亭. 山东师范大学. 2017
[10]. 白藜芦醇对局灶性脑缺血/再灌注大鼠海马神经元损伤的影响及其分子机制[D]. 李珍. 安徽医科大学. 2017