（1.成都市龙泉驿区疾病预防控制中心，四川 成都 610100；2.四川省疾病预防控制中心，四川 成都610041）
【中图分类号】 Ｒ378.9 【文献标识码】 A 【文章编号】 1550-1868（2016）6
【摘要】目的：探究分子线性探针技术应用于临床肺结核/耐药肺结核患者快速诊断可行性及可靠性。方法：收集成都市龙泉驿区临床疑似肺结核病患者痰标本，对比分析传统比例法药敏试验和线性探针技术对异烟肼(INH)、利福平(RFP)耐药检测效能。结果：传统比例法药敏实验检测出103份结核分枝杆菌核酸检测阳性标本异烟肼(INH) 耐药14例(13.59%)，利福平(RFP) 耐药5例(4.85%)、耐多药肺结核（MDR-TB）41例(39.81%)；线性探针技术检测出103份结核分枝杆菌核酸检测阳性标本异烟肼(INH)耐药13 例(12.62%)，利福平(RFP)耐药6 例(5.83%)、耐多药肺结核（MDR-TB）41例(39.81%)，两种检测方法差异无统计学意义。结论：线性探针方法适用于临床肺结核患者异烟肼、利福平耐药快速检测。
【关键词】 结核分枝杆菌; 耐多药结核病; 线性探针法; 药敏试验
Molecular line probe technique used in Mycobacterium tuberculosis
and its drug resistance Application study of rapid detection
Abstract：Objective To explore the feasibility and reliability of the molecular line probe technique used in rapid diagnosis ofclinical drug-resistant tuberculosis, or TB patients. Methods Sputum samples of suspected cases which were lodged in Longquanyi District were collected. The detection performance of conventional susceptibility testing proportion method and linear probe technology to isoniazid (INH), rifampicin(RFP) drug were analyzed comparatively. Results The proportion of conventional susceptibility testing method detected 103 parts by Mycobacterium tuberculosis nucleic acid testing positive samples INH resistance 14 cases (13.59%), RFP resistant 5 cases (4.85%), 41 cases of multidrug-resistant tuberculosis (39.81%); linear probe technology detected 103 parts by Mycobacterium tuberculosis nucleic acid testing positive samples INH resistance 13 cases (12.62%), RFP resistant 6 cases (5.83%),41 cases of multidrug-resistant tuberculosis (39.81%) both detection difference was not statistically significant. Conclusion It is applicable for rapid detection by molecular line probe technique in clinical tuberculosis patients with isoniazid-resistance and rifampicin-resistance.
Key words:Mycobacterium tuberculosis; multidrug-resistant tuberculosis; linear probe; susceptibility test
结核病是由结核杆菌侵入人体后引起的一种具有强烈传染性的慢性消耗性疾病，不受年龄、性别、种族、地区的影响，人体多器官、系统均可患结核病，其中以肺结核最为常见。自上世纪80年代以来，结核病再次在世界范围内肆虐，耐药结核病是全世界结核病疫情第三次回升的重要原因。2014年WHO估计全球每年有150万人死于肺结核。近年来国内外学者发现结核分支杆菌耐药的自然变异频率很低, 95%的基因变异是由不合理用药引起的结核杆菌内抗结核药物作用靶基因突变所致。肺结核患者的发现率较低，患者就诊、确诊及时率不高及截留患者现象等成为当前我国结核病防治工作新的难题,在结核病的治疗中最初及时选择有效药物是关键，而现有的结核病实验室诊断“金标准”都不能满足临床早期、快速诊治的需要，可能延误结核病及时诊断及治疗［1］。分枝杆菌分离培养虽然是结核病确诊最可靠的方法，但耗时长，亟需探寻一种快速、准确的检测技术为临床及时、合理用药及疗效评价提供有力的技术支持。本研究通过选取成都市龙泉驿区疑似肺结核病患者痰液标本作为研究对象，对照分析线性探针技术快速筛查耐多药肺结核与传统结核菌培养和药敏试验对耐多药患者的检测效能，以探讨适用于基层医疗机构耐药结核杆菌快速检测方法，现将结果报道如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料连续收集2010年6月至2011年6月成都市龙泉驿区临床疑似肺结核患者痰标本162份。所有结核病患者均居住于成都市龙泉驿区，其中男性 97 例，女性65例，年龄14 ～78岁，平均(57.26± 10.23) 岁。
1.2 主要仪器与试剂改良罗氏 （L-J ）培养基及含药培养基均购自杭州创新生物检控技术有限公司； Geno Type MTBDRplus 试剂盒购自德国Hain Lifescience 公司。
1.3实验方法
1.3.1 痰标本收集嘱患者收集夜间痰、清晨起床后漱口的晨痰和及时痰的痰各一份，分别装于3个无菌痰检盒内送检。将痰标本放在温度为4℃的冰箱内进行保存，并在3天内完成对痰标本的检测。
1.3.2痰涂片采用萋尼染色法，并严格按照《结核病诊断实验室检验规程》要求分级判断镜检结果。
1.3.3分离培养严格按照《结核病诊断实验室检验规程》要求，采用含NaOH的N-乙酰-L-半胱氨酸（NALC）消化，涡旋振荡10～20S，室温静置15min,加磷酸缓冲液(PH6.8)，离心15min（3000g）后弃上清留1 ml，分别接种0.1 ml前处理液至2支中性改良罗氏培养基斜面，剩余前处理液用于线性探针法检测。36±1℃培养，接种后第3天，7天观察培养情况，此后每周观察1次，有菌落生长需经抗酸染色确认，至第 8周末无菌落生长判断为阴性。
1.3.4初步菌型鉴定采用对硝基苯甲酸（PNB）生长试验，接种 10－3mg 菌液至含有PNB（500ug/ml）培养基和空白对照培养基，36±1℃培养，每周观察一次结果，连续4 w（周），PNB培养基上不生长则判定为结核分枝杆菌。
1.3.5药敏试验严格按照《结核病诊断实验室检验规程》要求，采用比例法。在磨菌瓶中加入5%吐温80生理盐水，挑取一份标本多处新鲜菌落研磨配制成1 mg/ ml 菌液( 与标准麦氏比浊管相比)，静置片刻后分别稀释至10－2mg/ml和 10－4mg/mL2个浓度，然后用22SWG 标准接种环分别取1满环( 0.01mL)用划线法均匀接种至对照及购买的含药培养基（INH0. 2ug/ ml、RFP(40ug/ml）。37℃培养4周后报告结果，药敏培养基上菌落数/对照培养基上菌落数的比值大于或等于1%判断耐药，否则为敏感。
1.3.6线性探针（HAIN）检测 按照 Geno Type MTBDRplus 试剂盒说明书进行操作。主要操作步骤包括核酸提取；基因耐药突变区域的PCR扩增，扩增循环为 95℃15min、95℃30s、56℃3min，共10 个循环；然后再95℃25s、53℃40s、70℃40s，共20个循环；最后70℃扩增 8min； PCR扩增产物与探针试纸条在严格条件要求下进行杂交；最后根据杂交显色结果进行耐药性的判读，判读时野生条带都显色，而突变条带不显色判为敏感；而野生条带有缺失，突变条带无论显色或不显色均判为耐药。
1.3.7 质量控制：每批药敏试验及线性探针法均采用结核分枝杆菌标准菌株 H37Rv进行质控。H37Rv结核分枝杆菌标准株由四川省疾病预防控制中心结防所提供。
1．4统计学处理：使用 SPSS 17．0 统计软件进行数据分析。
2.结果
2.1 对162份临床疑似肺结核患者痰标本分别采用痰涂片、传统培养和线性探针方法检测分析。结果显示痰涂片阳性55份，阳性率（33.95%）；传统培养法结核分枝杆菌阳性102份（其中一份原种污染，转种失败），阳性培养率62.96% ；线性探针法结核分枝杆菌核酸检测阳性 103份，阳性符合率达63.58% 。痰涂片与传统培养法及线性探针法对结核分枝杆菌检测灵敏度比较差异具有统计学意义（P<0.05）；传统培养和线性探针方法对结核分枝杆菌检测灵敏度经统计学分析无明显差异（P>0.05）。
2.2 线性探针法与药敏试验结果比较
比例法药敏结果对103份结核分枝杆菌核酸检测阳性标本进行比例法药敏实验，并进行PNB初步菌型鉴定，结果全部为结核分枝杆菌。药敏结果显示，异烟肼(INH)耐药14例(13.59%)，利福平(RFP) 耐药6例(4.85%)、耐多药肺结核（MDR-TB）41例(39.81%)。
线性探针法药敏结果对103份结核分枝杆菌核酸检测阳性标本进行DNA提取并使用线性探针法进行检测，结果显示异烟肼(INH)耐药13 例(12.62%)，利福平(RFP)耐药5例(5.83%)、耐多药肺结核（MDR-TB）41例(39.81%)。见表1
表 1 比例法药敏实验和线性探针方法对 103 份结核分枝杆菌检测阳性标本分析耐药检测效能对比
3.讨论
我国是全球22个结核病高负担国家之一，疫情严重，同时也是全球 27 个耐多药结核病高发国家之一［2］，且近年来我国耐药结核病的发病率呈上升趋势，初诊结核病患者中约 5%为耐药结核病患者，复发结核病患者中约 1/4为耐药结核病患者[3，4]。传统检测方法待诊时间长，耐药结核患者无法得到及时有效的治疗且耐药结核病的传播无法得以控制[5,6]。
Geno Type? MTBDRplus Assay试剂盒运用核酸反向线性探针杂交技术捡测与利福平耐药密切相关的rpo B基因上一段长约81 bp的核心区域—耐利福平决定区（RRDR）以及异烟肼耐药相关的kat G基因第315位密码子和inh A基因启动子区的8、15位氨基酸上的常见突变，可在 6 h 内完成耐多药结核分枝杆菌（MDR-TB）检测。在欧美等发达国家，该试剂盒在临床或科研中应用已得到广泛的评价。2008年，世界卫生组织亦出台政策推荐使用分子线性探针技术。本研究选用临床疑似肺结核患者痰标本为实验标本，分别对痰涂片、传统培养和线性探针法结核分枝杆菌核酸检测灵敏度对比；并对比分析比例法药敏实验和线性探针技术耐药检测效能，结果显示：传统培养和线性探针法结核分枝杆菌核酸检测灵敏度远远高于痰涂片阳性率；传统培养和线性探针方法对结核分枝杆菌检测灵敏度差异无统计学意义。从统计学进行比较，分子线性探针杂交技术与比例法药敏实验在检出结核分枝杆菌对异烟肼、利福平耐药率以及耐多药率差异无统计学意义，且线性探针杂交技术检测耐多药肺结核具有检出时间短，特异度、灵敏度高的特点，从基于培养方法的一个月减少到一天，在基层结核病防治工作中为耐多药肺结核的早发现、早治疗提供了实验室依据，在有效防控肺结核疫情，缩短其传播时间，降低耐药性肺结核发病率，减轻社会、经济负担等方面起到积极作用。但该方法是通过检测INH、RFP耐药抗性决定区核酸突变来确定是否耐药，如果存在检测区域以外的耐药突变，则无法检出，因此线性探针技术在结核病诊断中的可靠性需进一步全面深入研究；同时对实验室硬件设施及专业人员分子生物学知识、操作技能等方面提出更高要求，该方法在基层医疗机构的推广运用有助于推动基层实验室能力建设进一步提升。
综上所述，分子线性探针技术能及时、准确检测结核分枝杆菌及耐药性，为临床及时制定最佳抗痨方案提供有力实验室参考依据，在现阶段可作为结核病快速诊断方法中优选方法在临床开展运用。
参考文献
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论文作者:汤洪萍1，龙波2，杨筠2，何博文1，马建明1，陈娟1
论文发表刊物:《医药界》2016年6月第6期
论文发表时间:2016/9/20
标签：结核论文; 分枝论文; 探针论文; 杆菌论文; 线性论文; 肺结核论文; 结核病论文; 《医药界》2016年6月第6期论文;