（黑龙江中医药大学佳木斯学院，154007）
【摘要】不饱和脂肪酸10－羟基－2－癸烯酸又名蜂王酸（10-HDA），是蜂王浆的主要成分，由于其具有抗肿瘤、抗菌活性和刺激胶原蛋白产生的作用，吸引了世界各地对10-HDA药理特性的研究。然而，10-HDA对紫外线(UVB)诱导的皮肤光老化影响却罕有报道。本研究通过测量I型前胶原蛋白(PIP)，转化生长因子β1（TGF-β1）和基质金属蛋白酶-1(MMP-1)的变化,检测10-HDA对UVB诱导人正常皮肤成纤维细胞光老化的影响。结果：10-HAD使I型前胶原蛋白和TGF-β1含量增加，但是金属蛋白酶- 1的水平并没有改变。因此，10-HDA可能是通过增强胶原蛋白的合成而对UVB诱导的皮肤光老化进行保护。
【关键词】10-HAD；MMP-1；光老化；I型前胶原蛋白；TGF-β1
中途分类号：R285 文献标识码：A
前言
皮肤老化可以分为内源性老化和外源性老化。外源性老化主要是由紫外线(UV)照射引起的光损伤。UV照射是引起人类皮肤急、慢性疾病的一个主要环境因素，长期暴露在紫外线下导致皮肤过早衰老即光老化，其主要临床表现为皮肤增厚、粗糙、褶皱和斑点色素沉着。
研究表明：10-HDA呈剂量依赖性诱导正常人体皮肤成纤维细胞中胶原蛋白含量增加。然而，10-HDA对UV诱导的皮肤光老化的影响尚未见到报道。在本研究中我们以UVB照射正常人体皮肤成纤维细胞，以I型前胶原蛋白和MMP1、TGF-β1的含量为检测指标，旨在研究10-HDA对UVB诱导正常人体皮肤成纤维细胞光老化的影响。
1材料与方法
1.1 药品与细胞
10-HAD(购于上海超研生物科技有限公司)，人皮肤成纤维细胞HSF（购于上海博谷生物科技有限公司）。
1.2 细胞培养
HSF细胞培养于37℃，5%CO2的细胞陪养箱，培养基为10%胎牛血清加1%双抗DMEM培养基，用5-9代细胞做实验。
1.3 紫外线照射和细胞处理
10-HDA用DMSO溶解-20保存备用，HSF接种于40mm培养皿中(2×105细胞/皿)含10%胎牛血清和抗生素DMEM培养基。24小时后，吸出培养基，预热磷酸缓冲盐溶液清洗单层贴壁细胞，加入1ml磷酸盐缓冲液，UVB(144mj /cm2)辐照40秒。UVB灯管5根辐射距离辐射距离7.5厘米。UVB(290 - 320 nm，峰值312nm) 灯管辐射能量与辐射计测量用辐射计测量。辐照后，细胞用预热的磷酸缓冲盐溶液清洗，每皿添加无血DMEM培养基各20ul。10-HAD浓度为是1、10和100 uM，培养72小时后收集细胞和上清液。
1.4 形态学变化
人工培养的真皮成纤维细胞72小时后形态的变化，使用倒置显微镜(100倍放大)观察细胞形态。
1.5 MTT分析。
MTT分析是一种常用的、敏感、定量、可靠的测定细胞活力的方法。96孔板加入不同浓度10-HAD（1、10和100 uM），UVB紫外照射后孵育72小时，加入MTT(0.1 mg/mL)，继续在37℃5%CO2培养箱中培养2小时，清除培养基加入100微升的二甲亚砜溶解结晶紫甲臢。室温下摇床震荡30分钟之后使用酶标波长为570 nm测量。
1.6 I型前胶原蛋白、金属蛋白酶- 1和TGF-β1测定
培养基中I型前胶原蛋白、金属蛋白酶- 1和TGF-β1的浓度用酶联免疫吸附试剂盒测定,按照试剂盒说明操作并设复孔重复试验三次。
1.7 统计分析
实验数据用SPSS19.0软件进行单因素方差分析（ANOVA），用L-S-D法对数据进行两两比较。P<0.05有统计学意义。
2结果
2.1 UVB照射和10-HAD对人皮肤成纤维细形态变化影响
如光学显微镜图所示，UVB照射和治疗10-HDA细胞形态如图，未辐射的细胞如图1所示，辐照40秒细胞如图2所示。UVB辐照后10-HDA治疗组浓度为1、10和100 uM, 培养72小时光学显微镜分析显示(图3-5)，可以看出不同浓度的10-HAD都可以预防紫外损伤。
2.2 10-HDA 对UVB辐射人皮肤成纤维细胞活力的影响
探讨10-HDA 对UVB防护作用,我们测量I型前胶原的浓度, I型前胶原是人皮肤成纤维细胞中主要胶原蛋白，UVB（144 mJ/cm2）辐射人类皮肤成纤维细胞培养。使用MTT法测定细胞活力(图6),未辐射组细胞活力为100%。UVB144 mJ/cm2辐照的成纤维细胞在细胞活力比未照射的细胞活力下降大约23%。不同浓度10-HAD对细胞活性具有弱的促进作用，10-HAD对细胞无毒性作用。
图6 UVB144 mJ/cm2 10-HAD浓度（1、10和100 uM）
2.3 10-HDA 对UVB辐射人皮肤成纤维I型前胶原的影响
图7 UVB144 mJ/cm2 10-HAD浓度（1、10和100 uM）
从图7可以看出UVB辐射后成纤维细胞中I型前胶原蛋白表达量明显降低。不同浓度10-HAD组与UVB组比较，10-HAD呈浓度梯度依赖性增加I型前胶原蛋白表达，10、100uM具有显著性差异，具有统计学意义p<0.05。
2.4 10-HDA 对UVB辐射人皮肤成纤维细胞MMP-1的影响
如图8所示，UVB辐射后成纤维细胞中MMP-1的表达量明显增高，不同浓度10-HDA 后UVB照射后MMP-1的表达量没有与正常成纤维细胞比较显著升高，与UVB照射组比较没有显著性差异，说明10-HDA不明显抑制金属蛋白酶- 1的分泌。
图8 UVB144 mJ/cm2 10-HAD浓度（1、10和100 uM）
2.5 10-HDA对UVB辐射人皮肤成纤维细胞TGF-β1的影响
图9 UVB144 mJ/cm2 10-HAD浓度（1、10和100 uM）
TGF-β1的含量由Duoset酶联免疫吸附试剂盒测定。UVB照射后TGF-β1含量比正常组增加了约15%以上，10-HAD预防组中TGF-β1含量明显高于的辐照细胞(图9)，其中低浓度1、10 uM具有显著性差异（p<0.05），这些结果证10-HAD可以诱导TGF-β1的产生。
3 讨论
皮肤长期暴露在紫外线下导致的皮肤临床和组织学变化与皮肤内源性老化一致,另一方面是降低前胶原蛋白的表达，尤其是降低细胞外基质的主要组成部分—I型前胶原蛋白的表达。
目前预防光老化主要研究策略集中在减少MMP的生产和增加前胶原蛋白的合成，因此我们研究10-HAD对UVB辐射人正常皮肤成纤维细胞中I型前胶原蛋白和基质金属蛋白酶- 1的影响。在本实验研究中10-HAD对成纤维细胞活力具有保护作用，促进UVB辐射人皮肤成纤维细胞中I型前胶原蛋白和TGF-β1的表达(图7、9),而金属蛋白酶- 1含量没有改变(图8)。基质金属蛋白酶- 1(胶原酶)对人类皮肤成纤维细胞胶原蛋白降解中起着重要的作用[1]。从而得出结论，10-HAD对UVB照射皮肤光老化具有保护作用，这种保护作用可能是通过上调TGF-β1表达式促进胶原蛋白生产来实现的。
参考文献：
[1]Dong KK, Damaghi N, Picart SD, Markova NG, Obayashi K,Okano Y,Masaki H, Grether-Beck S, Krutmann J, Smiles KA, Yarosh DB: UV-induced DNA damage initiates release of MMP-1 in human skin. Exp Dermatol 2008;17:1037–1044.
作者简介：
赵旭，1980年8月出生；民族：汉；籍贯：天津；职务：教师，团委书记；职称：讲师；研究方向：主要从事医学教育和大学生思想政治教育
论文作者:赵旭, 李续博, 通讯作者：李续博
论文发表刊物:《中国耳鼻咽喉头颈外科》2015年6月第6期供稿
论文发表时间:2015/8/5
标签：细胞论文; 纤维论文; 胶原蛋白论文; 皮肤论文; 浓度论文; 蛋白酶论文; 培养基论文; 《中国耳鼻咽喉头颈外科》2015年6月第6期供稿论文;