（湖北科技学院药学院 湖北 咸宁 437100）
【摘要】目的：建立荧光光度法测定七叶一枝花地上茎、叶中总黄酮含量。方法：用超声法提取样品中总黄酮，以芦丁为对照品、利用黄酮类化合物能和Al3+形成稳定荧光络合物的性质，选择激发波长430nm、发射波长483nm测定样品中总黄酮含量，对所建立的荧光法进行方法学验证，并考察乙醇体积分数、溶液PH等对荧光测定的影响。结果：以90%乙醇为溶剂，25mL体系中加入10%Al(NO3)3溶液1.6mL及PH=3.6HAC-Nac缓冲溶液0.8mL，室温测定时，芦丁浓度在0.004～0.03g·L-1的范围内与荧光强度有良好的线性关系，线性回归方程：Y=33573X-13.715，相关系数r2=0.9991，平均回收率为96.55%。结论：本法操作简便，准确，可作为七叶一枝花中总黄酮含量的测定方法。
【关键词】七叶一枝花；总黄酮；荧光分光光度法
【中图分类号】R284 【文献标识码】B 【文章编号】2095-1752（2018）32-0345-02
七叶一枝花(Paris polyphylla)为重楼属多年生草本植被，属十分珍贵的药材，有悠久的药用历史，具有抗菌抑菌、止血消炎、抗动脉粥样硬化等药理作用[1]。包括七叶一枝花在内的重楼属植物，其药用成分主要为皂苷、黄酮类等物质[2]。黄酮类化合物具有抗病毒、抗氧化、预防心脑血管疾病、抗肿瘤、清除自由基等多方面的功用[3]。由于目前七叶一枝花常用根部入药，而其地上的茎、叶部分常被丢弃，为更充分利用七叶一枝花的现有资源，测定其茎、叶不同部位总黄酮，给合理利用整株七叶一枝花提供理论依据。本文参考相关文献[4-6]，选用芦丁为对照，利用芦丁和铝的络合物产生荧光的原理来测定七叶一枝花中总黄酮的含量，结果满意。
1.材料与仪器
1.1 材料
七叶一枝花地上茎、叶，采购于长阳泽昊中药材种植基地。芦丁对照品（批号161223，购自上海圻明生物科技有限公司），硝酸铝、乙酸钠、甲醇、无水乙醇、乙酸等均为分析纯。
1.2 仪器
RF-5301型荧光分光光度计(日本岛津)；KQ3200DB型数控超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司）；万分之一电子天平（上海越平科学仪器有限公司）；DHG-9140B电热恒温鼓风干燥箱（上海培因实验仪器有限公司）；FW177型高速万能粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）；LDZ4-0.8低速自动离心机（北京医用离心机厂）、PHS-3C型PH计（上海雷磁精密科学仪器有限公司）；RE-5299旋转蒸发仪（郑州市亚荣仪器有限公司）。
2.方法与结果
2.1 七叶一枝花总黄酮的提取方法
将七叶一枝花地上茎、叶分开，除杂洗净，烘干粉碎。按照文献[7]方法，精密称取茎、叶样品粉末各一定量加石油醚脱脂脱色后挥干，按液料比15：1加入90%乙醇超声提取30min，重复提取2次，合并提取液，以90%乙醇定容至50mL。
2.2 测定条件的选择
精密称取芦丁对照品，用90%乙醇配成0.5g·L-1的标准溶液，移取该溶液液0.8mL至25mL容量瓶，加入10% Al（NO3）3溶液1.6mL、不同PH（2.7、3.6、4.5、5.4）的HAC-NaAC缓冲溶液0.8mL，用不同体积分数（50%，70%，90%，100%）乙醇定容，摇匀。考察乙醇体积分数、溶液PH对荧光测定的影响。在激发、发射狭缝宽度均为5nm条件下扫描，测得激发波长=430nm，发射波长=483nm。
不同体积分数（50%，70%，90%，100%）乙醇的影响结果见图1。图1表明，配合物的荧光强度基本随着乙醇体积分数增加而增强，且乙醇体积分数变大后，最大峰位略微向右移动。当乙醇浓度为90%时，荧光强度明显强于其它浓度。所以，本实验选定90%乙醇为测定溶剂。
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图2 不同PH的影响
2.3 标准曲线的绘制
分别吸取0.5g·L-1芦丁标准溶液0、0.2、0.4、0.6、1.0、1.5mL于6只25ml容量瓶中，依次加入10%Al（NO3）3溶液1.6mL及PH=3.6HAC-NaAC缓冲溶液0.8mL，最后用90%乙醇定容，即得芦丁标准工作溶液。以试剂空白为参比，测定各芦丁标准工作溶液的荧光强度，绘制标准曲线。结果表明，芦丁浓度在0.004～0.03g·L-1的范围内与荧光强度呈良好线性关系，回归方程为Y=33573X-13.715，Y表示荧光强度，X表示芦丁浓度，相关系数r2为0.9991。
2.4 精密度试验
取同一份样品溶液平行测定6次，测得溶液中总黄酮浓度分别为18.742、18.695、18.377、18.421、18.869、18.471ug·L-1，RSD为0.19%，表明方法精密度良好。
2.5 加标回收试验
为了验证本法测定的准确性，在样品溶液中加入芦丁对照品进行考察。准确称取样品6份，再加入不同量芦丁标准溶液，按样品测定方法提取、测定，结果见表。该方法平均回收率为 96.55%，说明该方法准确可行。
表 七叶一枝花总黄酮回收率试验
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2.6 样品测定
精密量取“2.1”项下茎、叶提取液各一定量，分别加入10%Al（NO3）3溶液1.6mL及PH=3.6HAC-NaAC缓冲溶液0.8mL，用90%乙醇定容至25mL，测定各溶液荧光强度，代入回归方程，求得茎、叶中总黄酮含量分别为4.86、6.12mg·g-1。
3.讨论
本文采用荧光分光光度法测定七叶一枝花总黄酮含量，考察了乙醇溶剂体积分数、溶液PH等对荧光强度的影响。实验表明，在本文实验条件下，芦丁浓度在0.004～0.03g·L-1范围内与荧光强度有良好的线性关系，平均回收率为96.55%。荧光法对比传统的紫外分光光度法灵敏度更高，且操作简单，可以作为测定七叶一枝花总黄酮含量的方法。样品测定结果表明，七叶一枝花地上的茎、叶中含有丰富的黄酮类化合物，可以充分利用。
【参考文献】
[1]李小莉,陈红琳,牟光敏.七叶一枝花软膏抗炎镇痛作用研究[J].医药导报,2007,26(2)：139-140.
[2]袁宏伟.中药重楼的药理作用及临床应用进展[J].中国社区医师：医学专业,2007,9(21)：32-32.
[3]卢红梅，彭丽华，郭方遒，等.鱼腥草中黄酮类成分的高效液相色谱指纹图谱分析[J].色谱，2010，28（10）：965-970.
[4]高生平,吴晓红,张雅欣,等.荧光法测定蒲公英中总黄酮的含量[J].食品研究与开发,2018(1)：117-121.
[5]马登磊,邵建群,何深知,等.荧光分析法测定元宝枫叶中总黄酮含量的研究[J].首都医科大学学报,2014,35(1)：113-117.
[6]穆宏磊，郜海燕，陈杭君，等.荧光光度法测定芦笋中总黄酮含量[J].中国食品学报，2010，10（2）：201-205.
[7]王岚,吴定军,鲁道旺.梵净山七叶一枝花总黄酮提取工艺的优化[J].南方农业学报,2014,45(4)：634-638.
基金项目：湖北省教育厅科学技术研究项目（B2017176）
湖北省教育厅科学技术研究项目（Q20152802）
湖北科技学院2017年度药学重点学科专项科研项目资助（2018-19XZY10）
作者简介：张玉霖（1979-），女（汉族），湖北襄阳人，讲师，硕士学位，主要从事药物分析研究工作。
通讯作者：张又枝（1979-），女（汉族），湖北浠水人，副教授，博士学位，主要从事中西药学研究工作。
论文作者:张玉霖,余海峰,周亮,张又枝（通讯作者）,陈锦红
论文发表刊物:《医药前沿》2018年32期
论文发表时间:2018/12/12
标签：溶液论文; 芦丁论文; 荧光论文; 乙醇论文; 黄酮论文; 样品论文; 含量论文; 《医药前沿》2018年32期论文;