方泽强, 李慧增, 王常勇, 孙远[1]2003年在《永生化软骨细胞为基础的工程化软骨修复软骨缺损的实验研究》文中指出目的 探讨用永生化软骨细胞作为种子细胞修复羊关节软骨缺损的可行性。方法 把人端粒酶催化亚基(hTERT)转染羊关节软骨细胞,筛选阳性克隆并通过旋转生物反应器-微载体技术进行大量扩增;将扩增的永生化软骨细胞与β-磷酸叁钙复合并在体外培育后,植入羊前肢肱骨头关节面软骨缺损处;3和6个月取材,进行形态学和免疫组织化学评价。结果 实验组,术后6个月,缺损区被新生的软骨组织所充填,Ⅱ型胶原染色呈强阳性,与对照组差别有显着性差异(P<0.01)。在材料组,缺损区边缘可见部分新生软骨组织;空白对照组,缺损区新生软骨组织形成。结论 永生化软骨细胞在软骨组织工程中具有潜在的应用前景。
方泽强[2]2003年在《永生化软骨细胞修复羊关节软骨缺损的实验研究》文中认为对因外伤和软骨病变所导致的关节软骨退变或功能丧失的治疗，目前临床上尚无有效的方法。近十年发展起来的组织工程科学给解决这一难题带来了希望，其中软骨组织工程是组织工程学科中发展最为迅速的领域，它的发展有望彻底解决这一医学难题。但是制约软骨组织工程发展的困难之一，即如何获得大量具有正常软骨细胞表型的种子细胞(软骨细胞)，到目前为止还没有得到有效的解决。随着克隆技术和转基因技术的发展，许多学者从不同方向对这一问题进行了大量的研究，并取得了一定的进展，其中干细胞(包括ES、MSCs)的体外定向诱导分化，体外延长正常组织细胞寿命被认为是解决这一难题的重要研究领域之一。 本研究通过真核表达载体和脂质体转染的方法，将端粒酶催化亚基hTERT转入羊髁突软骨细胞(mandibular condylar chondrocyte，MCCs)，筛选阳性克隆并进行一系列的生物学特性检测；以转染的软骨细胞为种子细胞，与支架材料β-TCP复合，体外构建工程化软骨，修复软骨缺损并对软骨修复情况进行检测和评价。研究结果如下： 经双酶切和电泳鉴定后，对质粒pCI-hTERT进行大量提取、纯化，采用脂质体转染的方法把hTERT导入羊的MCCs，经G418筛选，有限稀释法进行阳性克隆挑选并扩大培养。MCCs原代培养以多角形为主，在体外培养6-8代后，则大多数变为梭形或纺锤形，出现老化征象，分裂增殖速度降低并最终停止增殖。20株阳性转化软骨细胞传代均超过40代，其中13株传至150代以上仍显示旺盛的分裂增殖趋势，将其称为永生化髁突软骨细胞(immortalized mandibular condylar chondrocyte，IMCC)。IMCCs在培养过程中多数呈现多角形，体积小于MCCs。 MCCs和IMCCs的生长曲线显示，两者的PD分别为22.4h和65.2h。后者是前者的2.9倍。两者在无血清的情况下均不能生长，在低浓度血清中生长速度低于高浓度血清，但在相同的条件下永生化软骨细胞的增殖速度明显快于正常软骨细胞。 组织形态学检测发现，在p4 MCCs和p40、p80 IMCCs中60条染色体分别占92％、83％、75％。流式细胞仪检测显示，IMCCs的S期比例升高，说明IMCCs具有旺盛的分裂增殖能力。IMCCs的平板克隆和软琼脂克隆形成率分别为16％和6.2％，而MCCs则不能在软琼脂中生长；在观察期限内IMCCs在裸鼠体内无致瘤性。 IMCCs功能检测表明，IMCCs端粒酶活性呈阳性表达，而MCCs无端粒酶活性；Ⅱ型胶原原位杂交结果阳性，IMCCs具有软骨细胞的表型和合成Ⅱ型胶原的能力； 博士研究生论文IMCCs的碱性磷酸酶活性显着低于正常软骨细胞和成骨细胞，Von Kossa染色结果为阴性。 软骨缺损修复结果显示，以IMCCs为种子细胞的工程化软骨具有较好的软骨缺损修复能力，缺损区有大量的软骨样组织形成，与单纯材料组和空白对照组有显着差异。 本实验通过导入hTERT使软骨细胞获得永生化。以永生化软骨细胞为种子细胞，采用组织工程技术对关节软骨缺损进行修复，并初步取得成功。本研究不但为端粒酶在组织工程中应用的可行性进行了有益的探索，而且对解决软骨组织工程种子细胞来源的难题进行了重要的尝试，同时也为研究软骨细胞体外的生物学行为和端粒酶的作用机理提供了有用的细胞模型。
王思群[3]2009年在《β-TCP多孔生物陶瓷软骨组织工程支架的研发及应用研究》文中认为【目的】：β-TCP是一种较理想的骨组织工程无机支架材料，传统的β-TCP生物陶瓷制作方法制作的生物陶瓷，其微结构难以控制，应用于软骨组织工程的较少。近年来法国地中海大学成功地研制了微孔结构可控的β-磷酸叁钙多孔陶瓷材料，该材料不仅具有良好的生物相容性和较高的机械强度，而且可调控微结构以适合软骨组织工程构建的需要。我们和上海贝奥路公司合作，通过研究不同微结构的生物陶瓷支架复合软骨细胞体外培养的结果，发现适合软骨组织工程构建的生物陶瓷支架材料微结构。通过对兔解剖结构的测量，建立兔关节软骨缺损模型，进行体内生物陶瓷支架软骨修复动物实验，观察并评估软骨修复效果，从而找到适合体内软骨组织构建的生物陶瓷支架。为β-TCP材料进一步临床应用于关节软骨缺损的修复提供实验依据。【方法】：(一)选取二月龄健康新西兰大白兔，耳缘静脉注射空气栓塞处死，取双侧股骨髁、肱骨及胫骨，剔除周围软组织，分别使用游标卡尺及64排CT重建进行测量，获取各项解剖数据。(二)消化分离成年兔肋软骨细胞及关节软骨细胞进行体外培养，观察两种软骨细胞的细胞获得率、存活率、细胞贴壁率、形态学变化、MTT法测定细胞增殖速度，并且进行甲苯胺兰染色、亮绿-番红花“0”染色、二甲基亚甲基蓝法测定硫酸糖胺多糖。从而优选出适合软骨组织工程研究的合适的软骨细胞及其传代数。(叁)通过对肋软骨细胞复合不同微结构的生物陶瓷材料进行体外培养，计算软骨细胞在支架内增殖生长的不同趋势，优选出适合软骨细胞生长的β-TCP生物陶瓷支架的合适微结构。(四)利用专利技术，在前期研究的基础上，烧结出适合软骨组织工程构建的具有合适微结构的β-TCP生物陶瓷支架材料。(五)将体外实验优选的适合软骨细胞生长的微结构的β-TCP生物陶瓷支架材料复合肋软骨细胞植入兔关节软骨缺损模型中，以验证该微结构修复动物体内关节软骨缺损的可行性。【结果】：(一)解剖测量的结果得到了兔股骨髁、肱骨及胫骨的各项数据，并且进行了CT叁维重建，测量结果显示肱骨头软骨面至骺线距离4．5±0．2mm。胫骨内侧平台宽度为6．1±0．4 mm，外侧平台宽度为6．4±0．3mm，但胫骨平台表面覆盖有半月板组织，无法进行手术显露，这两个部位都无法满足体内试验的需要。股骨内侧髁宽度为5．0±0．2mm，外侧髁宽度为4．0±0．1mm，两侧髁的宽度都较小，并且表面形态较不规整，同样不满足体内试验的需要。股骨滑车宽度为6．5±0．5mm，滑车近髁间窝表面软骨至髓腔距离为9．1±0．6mm，并且表面形态较规整，可以适合体内试验的需要。(二)利用专利技术进行适合软骨组织工程研究的合适微结构β-TCP生物陶瓷支架材料的烧制，并且进行相关理化性能的表征检测。(叁)两种软骨细胞体外培养的结果显示关节软骨：消化时间为6．49±1．87h，细胞获得率为5．79±1．7×10~5／100mg。肋软骨：消化时间为4．14±1．45h，细胞获得率为4．76±1．2×10~5／100mg，肋软骨细胞和关节软骨细胞在细胞获得率、存活率、贴壁率上都不具有统计学意义，而肋软骨细胞的消化时间却低于关节软骨细胞，P值为0．0032。二甲基亚甲基蓝法测定细胞传代培养液中GAG的含量，显示1代软骨细胞及2代软骨细胞分泌GAG的量和原代细胞相似无统计学差异，但从第3代软骨细胞开始则开始具有统计学差异。(四)对软骨细胞复合不同微结构的支架材料培养的结果显示，培养第一周，不同内连接径及孔径的支架材料中种植的肋软骨细胞的生长速度无明显差异，但是从第二周开始，在孔径相同的条件下内连接径120μm的支架材料生长速度明显快于其他内连接径的支架材料，这种情况一直延续到第四周。(五)进行体内动物实验认证，结果证明肋软骨细胞复合β-TCP生物陶瓷材料可以修复兔关节软骨缺损，4月后的2代肋软骨细胞组组织学评分为20．76±2．13，甲苯氨兰、番红及Ⅱ型胶原染色均显示软骨组织修复较为完全。【结论】：兔股骨滑车近髁间窝软骨缺损的动物模型是有效的，适合软骨细胞组织工程研究。软骨种子细胞优选的结果发现肋软骨细胞在体外生长速度较快，分泌糖胺聚糖的量更多，从体外扩增数量的角度出发，2代软骨细胞较适合软骨组织工程构建的需要。微结构不同的生物陶瓷支架材料对肋软骨细胞体外培养的结果是有差异的，孔径为500-630μm，内连接径120 m的生物陶瓷材料体外培养较适合软骨细胞体外生长的需要。体内动物实验的结果发现，不同的复合方式软骨修复结果是有差异的。肋软骨细胞经体外培养至2代后复合生物陶瓷支架材料修复动物关节软骨缺损的结果较原代消化细胞直接复合支架材料修复动物关节软骨缺损效果为好。硬质生物陶瓷材料完全可以作为软骨工程的支架材料。硬质支架材料上层软骨细胞成软骨，下层软骨细胞则未成软骨组织，趋向转化成骨。无编改内容
赵子义[4]2005年在《骨髓间充质干细胞构建组织工程化骨与软骨的实验研究》文中研究表明利用骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,MSCs)构建组织工程化骨与软骨在骨科有极大的应用意义。本研究利用免疫磁珠法分离骨髓神经生长因子受体(nerve growth factor receptor, NGFR)阳性细胞,获得同质性原始MSCs。并应用自体骨髓MSCs 与β-磷酸叁钙(beta tricalcium phosphate,β-TCP)陶瓷构建组织工程化软骨与骨,然后分别植入羊关节全层软骨缺损以及羊跖骨节段性骨缺损处,观察自体骨髓MSCs 修复骨与软骨缺损的效果。结果发现,利用免疫磁珠细胞分选方法可以获得纯度为(90.4±4.7)%,具备更强增殖能力和多向分化潜能的原始均质MSCs;自体MSCs 构建的组织工程化骨与软骨可以完全修复骨与软骨不可自发修复缺损。β-TCP 是MSCs 构建组织工程化骨与软骨的良好载体材料。另外将同种异体MSCs 与β-TCP 的复合物植入正常羊关节腔后,关节腔微环境诱导MSCs 分化形成软骨,且不引起免疫排斥反应。此研究为将骨髓MSCs 应用于骨与软骨缺损的临床治疗提供了实验基础。
夏扬[5]2008年在《海藻酸钠—明胶共混体系为载体的可注射式组织工程骨的研究》文中研究说明目的:探讨海藻酸钠—明胶共混体系为载体的可注射式组织工程骨的理化性能、生物相容性及其在临床上的应用前景。方法:从兔骨髓中分离骨髓间充质干细胞,进行体外培养、分离和扩增,诱导向成骨细胞分化并进行检测和观察。探讨了不同浓度的氯化钙溶液对成骨细胞的影响作用。研究不同配比共混体系的理化性能和不同消毒方法对其的影响作用和成骨细胞在体系中的生物学行为。在从细胞遗传学角度考察了共混体系安全性的基础上,进行动物实验,观察材料的组织相容性和不同时间段新骨的形成。结果:骨髓间充质干细胞经诱导培养后分化为成骨细胞,Ca~(2+)浓度对成骨细胞的代谢活性有影响作用。共混体系理化性能随不同配比的浓度、温度有所变化。各种消毒方法对其理化性能均有影响,其中,以高压蒸汽法对海藻酸钠粉末的影响最小。成骨细胞在共混体系中,呈悬浮状生长并增殖。植入共混体系/成骨细胞凝胶的动物,未见到有染色体型畸变。凝胶注射植入实验兔皮下后有软骨样组织和骨组织形成,并以软骨化骨的形式修复了实验动物的颅骨极限缺损。结论:骨髓间充质干细胞可通过体外诱导培养分化为成骨细胞。不同浓度和作用时间的氯化钙对成骨细胞具有影响作用。海藻酸钠—明胶共混体系的理化性能可满足作为成骨细胞载体的需要。高压蒸汽对海藻酸钠粉末进行消毒的方法对共混体系的理化性能影响最小。共混体系无明显致染色体型畸变作用。通过注射方式在动物软组织中有异位成骨作用。可以用来进行骨缺损的修复。
参考文献：
[1]. 永生化软骨细胞为基础的工程化软骨修复软骨缺损的实验研究[J]. 方泽强, 李慧增, 王常勇, 孙远. 中国骨伤. 2003
[2]. 永生化软骨细胞修复羊关节软骨缺损的实验研究[D]. 方泽强. 中国人民解放军第四军医大学. 2003
[3]. β-TCP多孔生物陶瓷软骨组织工程支架的研发及应用研究[D]. 王思群. 复旦大学. 2009
[4]. 骨髓间充质干细胞构建组织工程化骨与软骨的实验研究[D]. 赵子义. 吉林大学. 2005
[5]. 海藻酸钠—明胶共混体系为载体的可注射式组织工程骨的研究[D]. 夏扬. 中国协和医科大学. 2008