一、挤压伤大鼠血清对培养新生大鼠心肌细胞的作用（论文文献综述）
施鹏[1]（2021）在《LncRNA Fendrr调控心肌成纤维细胞活化增殖的机制研究》文中认为背景心房颤动（Atrial fibrillation,AF）指的是规律、有顺序的心房部正常生理性电活动完全丧失,取而代之为频率高达300-600次/分的无序、不协调微小颤动波,从而使心房部分或者完全失去了有效收缩,心房无法正常泵出回流血液,是一种极为常见的、发病率极高的快速心律失常。心房颤动与心力衰竭发生以及发展的关系甚为密切,是导致心源性休克、脑卒中以及肺栓塞等致死性疾病的重要因素。时至今日,心房颤动的发生和持续原因尚未全面探究明了。长链非编码RNA（Long non-coding RNA,LncRNAs）作为一类碱基累积长度超过200 nt、但是不参与蛋白编码进程的RNA,最初认为其不具有任何生物学意义,伴随着不断深入了解,发现其具有影响染色质重新构型、生物蛋白翻译、翻译后再修饰等关键进程,进而直接或者间接发挥着影响基因表达的作用。日益进展的探究证实,LncRNAs与包括心肌纤维化在内的很多种类疾病的进展以及维持具有一定程度的相关性,一定程度上证明LncRNAs能够起到对某些疾病潜在诊断的作用。目的研究的主要目的在于明确FOXF1邻近非编码发育调控RNA（Long non-coding RNA FOXF1 adjacent non-coding developmental regulatory RNA,LncRNA Fendrr）、DNA甲基转移酶3B（DNA Methyltransferase 3B,DNMT3B）以及RAS相关区域家族1A基因（Ras association domain family 1A gene,RASSF1A）在心肌纤维化标本以及模型中具体表达情况,初步明确LncRNA Fendrr在心肌成纤维细胞活化以及增殖的过程中所发挥的作用,进一步阐释LncRNA Fendrr可能通过DNMT3B增强了RASSF1A甲基化,从而在心肌纤维化持续进展中产生持续性的影响。方法构造SD（Sprague-Dawley）大鼠心房颤动心肌纤维化动物模型,采用SD大鼠左侧中下腹部皮下注射盐酸异丙肾上腺素（Isoprenaline Hydrochloride,ISO）法。现将100只无特定病原体（Specific pathogen Free,SPF）SD大鼠依次编号,采用随机抽取号码的方式将SD大鼠分成正常对照组和实验组,每个分组各为50只。对实验组SD大鼠进行左侧中下腹部皮下注射ISO处理,正常对照组的SD大鼠进行左侧中下腹部皮下注射同等剂量的生理盐水,造模14天后处死动物模型,并取出心脏标本。采用混合酶消化的方法,提取新生SD大鼠原代心肌成纤维细胞,使用浓度为10%胎牛血清的培养基在37℃,5%CO2条件下培养。将所获得的心脏标本用磷酸盐缓冲溶液（Phosphate buffered saline solution,PBS）清洗后,放入通用型组织固定液后进行标本切片处理,行苏木精-伊红染色法（Hematoxylin-eosin staining,HE染色）、天狼星红染色和Masson染色。将制备好的标本切片进行免疫组织化学法,观察DNMT3B、RASSF1A和α-平滑肌肌动蛋白（Alpha-smooth muscle actin,α-SMA）的表达情况。构建DNMT3B小干扰RNA（si RNA）以及LncRNA Fendrr过表达质粒,通过瞬时转染的实验方法作用于原代心肌成纤维细胞。将相应处理过的原代心肌成纤维细胞使用通用细胞固定液处理后,通过免疫荧光技术检测DNMT3B、RASSF1A的表达情况。通过5-溴脱氧尿嘧啶核苷（5-bromodeoxyuridine,Brd U）实验、Cell Counting Kit-8（CCK-8）实验和噻唑蓝（MTT）实验检测心肌成纤维细胞增殖活性。通过定量反转录聚合酶连锁反应（quantificational rt-PCR,q RT-PCR）检测LncRNA Fendrr、DNMT3、RASSF1A以及I型胶原（Collagen I,Col1A1）的m RNA的表达情况。提取组织以及原代心肌成纤维细胞蛋白,采用Western blotting方法观察DNMT3B、RASSF1A、α-SMA、Col1A1以及哺乳动物不育系20样激酶1（Mammalian sterile 20-like kinase 1,Mst1）的表达情况。结果心房颤动患者心脏组织中,LncRNA Fendrr的表达量明显低于窦性心律患者心脏组织,但是相对于窦性心律患者,心房颤动患者心脏组织中DNMT3B、α-SMA以及Col1A1的表达量明显增加,HE染色、天狼星红染色和Masson染色也表示心房颤动患者心肌组织混乱,组织中胶原蛋白明显变多。两组对照,经过ISO处理的实验组SD大鼠,DNMT3B、α-SMA以及Col1A1的表达量显着高于正常对照组的SD大鼠,HE染色、天狼星红染色和Masson染色也显示实验组SD大鼠心肌组织混乱,间质中表现出极为显着的胶原纤维增生。对比按照普通培养的原代心肌成纤维细胞,经转化生长因子-β1（Transforming growth factor-β1,TGF-β1）处理过后的原代心肌成纤维细胞增殖活性明显增加,LncRNA Fendrr表达量下降,DNMT3B、α-SMA以及Col1A1表达量上升。转染LncRNA Fendrr过表达质粒后的原代心肌成纤维细胞增殖活性明显降低,相对于转染空载质粒组以及正常组,DNMT3B、α-SMA以及Col1A1表达量下降。转染DNMT3B-si RNA后的原代心肌成纤维细胞,相对于阴性对照组以及正常组,α-SMA以及Col1A1表达量下降。5-氮杂-2-脱氧胞苷（5-Azad C）处理过的原代心肌成纤维细胞增殖活性明显降低,α-SMA以及Col1A1表达量下降,转染DNMT3B-si RNA后的原代心肌成纤维细胞,相对于阴性对照组以及正常组,RASSF1A表达量显着增加,5-Azad C处理过的原代心肌成纤维细胞,RASSF1A表达量显着增加。心房颤动患者心脏组织中,RASSF1A的表达量明显低于窦性心律患者心脏组织,Mst1的表达量明显高于窦性心律患者心脏组织,经过ISO处理的实验组SD大鼠,RASSF1A的表达量明显低于正常对照组SD大鼠心脏组织,Mst1的表达量明显高于正常对照组SD大鼠心脏组织,经过TGF-β1作用以后的原代心肌成纤维细胞,RASSF1A的表达量明显低于正常对照组的原代心肌成纤维细胞,Mst1的表达量明显高于正常对照组的原代心肌成纤维细胞,转染RASSF1A-si RNA处理后的原代心肌成纤维细胞,Mst1的表达量相比正常组和阴性对照组明显增加,细胞增殖活性明显增强,α-SMA以及Col1A1表达量增加。结论综上所述,本研究为LncRNA Fendrr通过干扰DNMT3B从而影响了RASSF1A甲基化进而对心肌成纤维细胞增殖活化以及心肌纤维化产生调控作用的机制提供了新思路。LncRNA Fendrr可以作为调控心肌纤维化的一个重要靶点。由此可以推测,重新恢复RASSF1A的表观遗传控制可能是治疗心肌纤维化的潜在治疗方法,其靶向调控剂可作为阻断心肌纤维化发展的有效临床药物。
胡晓[2]（2020）在《一种优化新生大鼠心肌细胞培养方法及CTRP3保护MIRI作用研究》文中研究表明目的（1）对新生大鼠心肌细胞（neonatal rat cardiomyocytes,NRCMs）的分离培养方法进行优化,寻找一种较为高效的新生大鼠心肌细胞分离培养方法;（2）研究CTRP3在心肌缺血再灌注损伤（myocardial ischemia/reperfusion injury,MIRI）中的作用。方法（1）新生大鼠心肌细胞的分离培养。无菌操作快速取得大鼠乳鼠心脏后以机械处理将心脏剪为心肌组织块;采用两种消化方法分别对心肌组织进行消化:（1）双酶消化法:0.08%胰酶和0.125%胶原酶混合（1:1）消化心肌组织,（2）0.08%胰酶+机械消化法:先用0.08%胰酶消化心肌组织后再以机械消化法消化剩余的心肌组织;用100μm的细胞筛过滤得到的细胞混悬液,然后进行差速贴壁培养;通过台盼蓝染色法检测差速贴壁分离后的细胞数量及存活率,在光学倒置相差显微镜下观察细胞的形态及特征,用共聚焦免疫荧光染色法鉴定新生大鼠心肌细胞的纯度。（2）缺氧/复氧损伤模型构建:应用氮气避氧法（三气培养箱）建立NRCMs缺氧/复氧损伤模型。（3）应用MTT法检测NRCMs对药物（CTRP3）的反应性。（4）应用比色法检测对照组、H/R组、CTRP3预处理组的乳酸脱氢酶（LDH）、超氧化物歧化物（SOD）活性,丙二醛（MDA）含量,用Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡。结果（1）两种消化方法所得原代心肌细胞在细胞形态、开始出现自发性搏动的时间等方面无显着性差异。未贴壁的心肌细胞呈圆形,折光性强。贴壁后心肌细胞伸出伪足,呈菱形、梭形、或不规则状。在铺板24h时部分心肌细胞贴壁并可观察到自发搏动。在48h细胞贴壁达98%并可观察到细胞簇之间的同幅搏动。（2）0.08%胰酶+机械消化法培养的NRCMs在细胞数量、存活率、纯度、活力等方面优于双酶消化法（p<0.05）。（3）与双酶消化法相比,0.08%胰酶+机械消化法培养的NRCMs药物反应性较好。（4）与H/R损伤组相比,CTRP3预处理细胞存活率提高,SOD活性增加,LDH活性降低,MDA含量减少,凋亡细胞减少。结论（1）0.08%胰酶+机械消化法培养的新生大鼠心肌细胞数量多、存活率高、纯度高、活力好、药物反应性好,是一种优化的新生大鼠心肌细胞分离培养方法;（2）CTRP3可能通过减轻氧化应激损伤、抑制细胞凋亡对心肌缺血再灌注损伤发挥保护作用。
彭科[3]（2020）在《右美托咪定调控HIF-1α信号通路减轻心肌缺血再灌注损伤的分子机制研究》文中研究表明第一部分 右美托咪定后处理减轻原代乳鼠心肌细胞的缺氧复氧损伤目的:探讨右美托咪定（dexmedetomidine,DEX）后处理对原代乳鼠心肌细胞缺氧复氧（hypoxia/reoxygenation,H/R）过程中心肌细胞损伤的影响。方法:（1）新生乳鼠原代心肌细胞的提取和培养。选取新生48小时内的Sprague Dawley（SD）大鼠提取和原代培养心肌细胞,并运用免疫荧光染色法鉴定心肌细胞的纯度。（2）不同浓度的右美托咪定对正常培养的原代心肌细胞的影响。将原代心肌细胞随机分为5组（每组n=6）:对照组,0.1、1、10、50μM不同浓度的右美托咪定处理24小时组。与对照组相比,观察不同浓度的右美托咪定对正常状态下培养的心肌细胞是否存在细胞毒性。（3）不同缺氧复氧时间对原代心肌细胞活力的影响。将原代心肌细胞随机分为7组（每组n=6）:对照组和6个H/R组。H/R组通过氧糖剥夺（oxygen glucose deprivation/reoxygenation,OGD/R）建立细胞 H/R 模型,分别于缺氧 3、6、12 小时+复氧3小时（H3R3、H6R3、H12R3组）以及缺氧6小时+复氧6、12、24小时（H6R6、H6R12、H6R24组）的不同缺氧复氧时间点使用cell counting kit-8（CCK-8）试剂盒检测心肌细胞活力,确定本实验条件下细胞缺氧复氧模型的作用时间点。（4）不同浓度右美托咪定后处理对原代心肌细胞H/R损伤后细胞活力和细胞毒性的影响。将原代心肌细胞随机分为5组（每组n=6）:对照组、H/R组,3个右美托咪定处理组。处理组中分别给予0.1、1、10μM不同浓度的右美托咪定后处理（即在复氧开始时加入到细胞培养基）,使用CCK-8和乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase,LDH）试剂盒检测心肌细胞活力和细胞毒性,以确定本实验中最佳的右美托咪定后处理浓度。（5）右美托咪定后处理对原代心肌细胞H/R损伤时细胞凋亡的影响。将原代心肌细胞随机分为3组（每组n=6）:对照组、H/R组、H/R+DEX组。在复氧开始时给予1 μM的右美托咪定后处理,复氧结束后采用Annexin V-FITC/PI双染法和流式细胞技术检测心肌细胞的凋亡率。（6）右美托咪定后处理对原代心肌细胞H/R损伤时缺氧诱导因子-1α（hypoxiainducible factor-1α,HIF-1α）、凋亡相关基因 B 淋巴细胞瘤-2（B-cell lymphoma-2,BCL-2）和BCL2样蛋白X（BCL2-Associated X,BAX）蛋白表达水平影响。将原代心肌细胞随机分为3组（每组n=6）:对照组、H/R组、H/R+DEX组。使用Western Blot检测各组HIF-1α、BCL-2、BAX蛋白水平的表达。（7）右美托咪定后处理对原代心肌细胞H/R损伤时HIF-1α和BAX在细胞内的定位的影响。将原代心肌细胞随机分为3组（每组n=6）:对照组、H/R组、H/R+DEX组。使用双标免疫荧光法检测各组心肌细胞内HIF-1α和BAX蛋白在细胞中的定位情况和表达水平。以上各组数据以均值±标准误表示,使用GraphPad 7软件进行统计学分析处理。结果:（1）乳鼠原代心肌细胞正常培养至72小时,经免疫荧光染色鉴定其心肌细胞纯度达98%,可稳定供以下实验使用。（2）0.1、1、1 0 μM的右美托咪定对于正常培养的心肌细胞活力均无显着影响,而高浓度的右美托咪定（50μM）则使得细胞活力降低至对照组的82.42±2.39%（P<0.01）,说明右美托咪定大于50μM的浓度时会对原代心肌细胞产生一定的细胞毒性。（3）心肌细胞的活力在H3R3、H6R3、H12R3、H6R6、H6R12、H6R24的各个不同时间点和对照组细胞相比均明显下降（P<0.01）,选取缺氧6小时复氧3小时用于后续的细胞实验（此时细胞活力下降至对照组的63.21±1.74%）。（4）与H/R组相比,使用0.1、1、10μM的右美托咪定后处理显着改善H/R损伤后的心肌细胞活力,减少LDH释放量（P<0.01）。其中浓度为1 μM的右美托咪定后处理效果最好,细胞活力与H/R组相比为75.21±2.23%vs.60.00±1.11%（P<0.01）,培养基中 LDH 释放量与 H/R 组相比为 200.8±7.37%vs.267.5 ± 5.57%（P<0.01）。因此,选取1μM的右美托咪定用于后续的细胞实验。（5）流式细胞凋亡率检测结果显示,与对照组相比,缺氧复氧过程显着增高原代心肌细胞的凋亡率至38.60±0.90%（P<0.01）,而使用1 μM右美托咪定后处理可以使H/R损伤后的心肌细胞凋亡率降低至20.94±0.96%（P<0.01）。（6）Western Blot结果显示,H/R组细胞HIF-1α和BAX的蛋白表达水平显着升高（P<0.01）,而BCL-2蛋白表达和BCL-2/BAX的比值显着降低（P<0.01）。右美托咪定后处理显着降低了 HIF-1α和BAX蛋白的表达水平（P<0.01）,并且翻转了 BCL-2蛋白表达（P<0.05）以及BCL-2/BAX的比值（P<0.01）。（7）双标免疫荧光实验结果显示,HIF-1α与BAX蛋白的表达在原代心肌细胞内存在共定位关系。在H/R组中,HIF-1α和BAX的荧光表达强度较对照组显着升高（P<0.01）,右美托咪定后处理显着降低了H/R损伤时HIF-1α和BAX的荧光表达水平（P<0.01）。结论:1 μM右美托咪定后处理可以显着减轻乳鼠原代心肌细胞缺氧复氧损伤,具体表现为改善H/R损伤导致的细胞活力下降、减轻细胞毒性、抑制LDH释放量、以及降低细胞凋亡率。右美托咪定后处理在细胞水平上减轻缺氧复氧损伤的保护作用很可能与其抑制HIF-1α蛋白的表达,调节凋亡相关蛋白的水平,从而抑制H/R损伤导致的心肌细胞凋亡有关。第二部分 右美托咪定后处理通过在转录后水平抑制HIF-1α信号减轻缺氧复氧过程中心肌细胞凋亡的分子机制目的:进一步探讨右美托咪定后处理是否通过调控HIF-1α的转录活性、抑制细胞凋亡、从而减轻缺氧复氧导致的心肌细胞损伤及其分子机制。方法:（1）HIF-1α 脯氨酰羟化酶 2（prolyl hydroxylase-2,PHD2）抑制剂 IOX2 对原代心肌细胞常氧和H/R状态下HIF-Iα和凋亡相关蛋白表达的影响。将原代心肌细胞随机分为4组（每组n=6）:对照组、对照+IOX2组、H/R组、H/R+IOX2组。IOX2是一种特异性的HIF-1α PHD2抑制剂,可通过抑制HIF-1α的降解从而增强其转录活性。IOX2的使用浓度为50μM,在复氧开始时使用右美托咪定前加入到细胞培养基之中。使用Western Blot方法检测HIF-1α、Bcl-2/adenovirus E1B 19kDa相互作用蛋白3（Bcl-2/adenovirus E1B 19kD interacting protein 3,BNIP3）、半胱氨酸蛋白酶-3 剪切体（cleaved caspase-3）蛋白水平的表达。（2）IOX2对右美托咪定后处理的原代心肌细胞H/R损伤时细胞活力的影响。将原代心肌细胞随机分为6组（每组n=6）:对照组、对照+IOX2组、H/R组、H/R+DEX组、H/R+DEX+IOX2组、H/R+DEX+溶剂组。其中溶剂为0.1%的二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide,DMSO）,用于溶解IOX2。使用CCK-8试剂盒检测各组心肌细胞的活力。（3）IOX2对右美托咪定后处理的原代心肌细胞H/R损伤时线粒体膜电位的影响。将原代心肌细胞随机分为5组（每组n=6）:对照组、H/R组、H/R+DEX组、H/R+DEX+IOX2组、H/R+DEX+溶剂组。使用JC-1荧光染色法检测各组心肌细胞线粒体膜电位（ΔΨm）水平。正常线粒体膜中,JC-1以聚合体的形式出现,在荧光显微镜下呈现出红色荧光;而凋亡细胞的线粒体膜电位ΔΨm下降或消失,JC-1以单体的形式出现,在荧光显微镜下呈现出绿色荧光。通过分析不同状态下JC-1红色/绿色荧光的比值可以得到细胞线粒体膜电位的相对数值,线粒体膜电位下降提示线粒体的结构性损伤。（4）IOX2对右美托咪定后处理的原代心肌细胞H/R损伤时HIF-1α和凋亡相关蛋白表达的影响。将原代心肌细胞随机分为4组（每组n=6）:H/R组、H/R+DEX组、H/R+DEX+IOX2 组、H/R+DEX+溶剂组。使用 Western Blot 检测各组细胞 HIF-1α和 BCL-2、BAX、BNIP3、cleaved caspase-3、聚 ADP-核糖聚合酶 1 剪切体（cleaved poly ADP-ribose polymerase 1,cleaved PARP-1）蛋白水平的表达。（5）右美托咪定后处理对原代心肌细胞H/R损伤时HIF-1α及其靶基因BNIP3的mRNA表达水平的影响。将原代心肌细胞随机分为3组（每组n=6）:对照组、H/R组、H/R+DEX 组。使用荧光定量聚合酶链反应（quantitative polymerase chain reaction,qPCR）检测各组细胞内HIF-1α及其靶基因BNIP3的mRNA表达水平。（6）通过质粒转染正常培养的原代心肌细胞以证实HIF-1α对BNIP3启动子的激活情况。合成目的基因 HIF-1α DNA,将其构建到质粒载体 pLenti-GⅢ-CMV-GFP-2A-Puro上:并合成启动子BNIP3 promoter和BNIP3启动子突变体,将其构建到双荧光酶素报告质粒载体 pLenti-miniCMV-RenLuc-PGK-Luc-SV40-GFP-2A-Puro 上。将原代心肌细胞随机分为4组（每组n=6）:BNIP3启动子组、BNIP3启动子+空载质粒组、BNIP3启动子+HIF-1α质粒组、BNIP3启动子突变+HIF-1α质粒组。将质粒转染正常培养的心肌细胞24小时后,在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）的表达强度,并使用双荧光素酶报告基因试剂盒检测转录因子HIF-1α对BNIP3启动子的激活情况。（7）IOX2对右美托咪定后处理的原代心肌细胞H/R损伤时BNIP3启动子活性的影响。将原代心肌细胞随机分为6组（每组n=6）:对照组、对照+DEX组、H/R组、H/R+DEX 组、H/R+DEX+IOX2 组、H/R+DEX+溶剂组。将报告基因 BNIP3 promoter质粒分别转染以上细胞24小时之后,按照分组情况对细胞进行H/R、DEX、IOX2的处理。使用双荧光素酶报告基因试剂盒检测BNIP3启动子的活性。以上各组数据以均值±标准误表示,使用GraphPad 7软件进行统计学分析处理。结果:（1）Western Blot结果显示,IOX2使正常培养的原代心肌细胞HIF-1α蛋白表达水平明显着升高为对照组的254.4±22.37%（P<0.01）。在H/R状态下,IOX2仍有进一步升高HIF-1α的趋势,但差异不具有统计学意义（431.1±37.86%vs.353.2±35.61%,P>0.05）。同时,IOX2并不影响BNIP3和cleaved caspase-3在正常培养的细胞和H/R状态下细胞中的表达。该结果说明IOX2可以有效的稳定HIF-1α的表达水平而并不增加细胞凋亡。（2）IOX2对于正常培养的心肌细胞活力没有明显影响。H/R造成细胞活力显着下降至对照组的60.26 ± 2.17%（P<0.01）,使用1 μM的右美托咪定后处理使细胞活力升高为77.72±1.63%（P<0.01）,而IOX2使用后细胞活力又下降为63.10±2.36%（P<0.01）。因此,IOX2逆转了右美托咪定后处理的作用,说明右美托咪定后处理通过调控HIF-1α减轻H/R导致的心肌细胞活力下降。（3）线粒体膜电位JC-1染色结果显示,H/R使原代心肌细胞的线粒体膜电位ΔΨm显着下降,即较高的绿色JC-1单体/红色JC-1聚合体比值。1μM的右美托咪定后处理减轻了线粒体膜电位ΔΨm的下降,使得红色JC-1聚合体增加,绿色JC-1单体减少。然而,IOX2的使用逆转了右美托咪定对线粒体膜电位ΔΨm的效果（P<0.01）。这提示右美托咪定后处理通过调控HIF-1α减轻H/R导致心肌细胞凋亡过程中线粒体结构损伤。（4）Western Blot结果显示,1 μM的右美托咪定后处理使H/R时原代心肌细胞的HIF-1α、BNIP3、cleaved caspase-3、cleaved PARP-1 蛋白表达水平显着减少（P<0.01）,而BCL-2/BAX蛋白表达比值显着增加（P<0.01）,IOX2则逆转了右美托咪定对上述蛋白的效果（P<0.05或P<0.01）。该结果证实右美托咪定后处理通过调控HIF-1α减轻H/R导致心肌细胞凋亡相关蛋白的改变。（5）qPCR结果显示,H/R时HIF-1α和BNIP3的mRNA表达水平显着升高（P<0.01）。1μM的右美托咪定后处理显着降低了 H/R时的BNIP3的激活（P<0.01）,但并没有明显改变HIF-1α的mRNA表达水平。该结果提示右美托咪定后处理在HIF-1α的转录后水平而非mRNA水平抑制了 HIF-1α蛋白对靶基因BNIP3的激活。（6）正常培养的心肌细胞转染BNIP3启动子/启动子突变体、HIF-1α质粒24小时后,双荧光酶素报告基因结果显示BNIP3启动子+HIF-1α质粒组的荧光素酶活性显着升高（P<0.01）,BNIP3启动子突变+HIF-1α DNA质粒组的荧光素酶活性与之相比则显着降低（P<0.01）。该结果说明合成的BNIP3启动子可以被HIF-1α DNA激活,该质粒系统的构建有效。（7）双荧光酶素报告基因结果显示,H/R时荧光素酶活性显着升高、BNIP3启动子被激活（P<0.01）,1 μM的右美托咪定后处理则降低了 H/R引起的高荧光素酶活性（P<0.01）。然而,IOX2的使用逆转了右美托咪定对BNIP3启动子活性的抑制作用（P<0.01）。该结果证实右美托咪定后处理通过调控HIF-1α的转录活性抑制了 H/R导致的BNIP3启动子的激活。结论:特异性HIF-1α脯氨酰羟化酶-2抑制剂IOX2可以稳定HIF-1α蛋白的表达水平,同时对乳鼠原代心肌细胞的活性和细胞凋亡没有不良影响。1 μM的右美托咪定后处理可以改善H/R后原代心肌细胞的活力、恢复线粒体膜电位、减轻线粒体结构损伤、调控凋亡相关蛋白 BCL-2、BAX、BNIP3、cleaved caspase-3、cleaved PARP-1 的表达水平、并在转录后水平抑制了 HIF-1α对靶基因BNIP3的激活。然而,IOX2逆转了上述效果,阻断了右美托咪定后处理对原代心肌细胞缺氧复氧的保护作用。综合本部分机制研究的结果,右美托咪定后处理通过在转录后水平作用于HIF-1α此关键靶点,抑制其对下游靶基因的激活,抑制凋亡级联反应,减少细胞凋亡,从而在细胞水平减轻原代心肌细胞缺氧复氧损伤。第三部分 右美托咪定后处理通过调控HIF-1α信号抑制细胞凋亡减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤目的:阐明右美托咪定后处理对大鼠心肌缺血再灌注（ischemia/reperfusion,I/R）过程中心肌损伤和凋亡相关蛋白表达的影响,并进一步证实右美托咪定后处理通过调控HIF-1α信号通路发挥对大鼠缺血再灌注损伤心肌的保护作用。方法:（1）大鼠心肌缺血再灌注过程中HIF-lα蛋白表达随再灌注时间的变化。取24只健康成年雄性SD大鼠随机分为4组（每组n=6）:假手术组、心肌缺血30分钟再灌注2小时、6小时、和24小时组。使用Western Blot检测再灌注2、6、24小时大鼠左心室组织中HIF-1α的蛋白表达水平,取其表达变化最显着的时刻作为后续实验的观察时间点。（2）右美托咪定后处理和IOX2对心肌缺血再灌注过程中大鼠心率的影响。使用MedLab生物医学信号处理系统监测大鼠心电图的变化。取42只健康成年雄性SD大鼠随机分为7组（每组n=6）:假手术组、假手术+DEX组、I/R组、I/R+IOX2组、I/R+DEX组、I/R+DEX+IOX2组、I/R+DEX+溶剂组。其中溶剂为5%二甲基亚砜（DMSO）+30%聚乙二醇300（PEG300）,用于溶解IOX2。再灌注开始时,经过右颈内静脉泵注右美托咪定负荷剂量6 μg/kg/h持续10分钟,追加维持剂量0.7μg/kg/h持续15分钟。IOX2组中,使用右美托咪定前经大鼠腹腔给予25μg/mg的IOX2。记录基础值、缺血15和30分钟、再灌注15、30、60分钟的心率值,并比较心率随时间变化的曲线下面积以观察心率在此期间整体的变化。（3）右美托咪定后处理和IOX2对大鼠心肌缺血再灌注过程中动脉血气、电解质、酸碱平衡的影响。上述7组大鼠于再灌注6小时经腹主动脉取血,行动脉血pH、动脉血氧分压（partial pressures of oxygen,PaO2）、动脉血二氧化碳分压（partial pressures of carbon dioxide,PaCO2）、动脉氧饱和度（arterial oxygen saturation,SaO2）、血红蛋白（hemoglobin,Hb）、红细胞压积（hematocrit,Hct）、Na+、K+、Ca2+、Cl-、HCO3-、碱剩余（base excess,BE）的分析,以了解各组动物在实验过程中内环境的是否稳定。（4）IOX2对右美托咪定后处理的大鼠心肌缺血再灌注过程中血清心肌肌钙蛋白I（cardiac troponin I,cTnI）的影响。取36只健康成年雄性SD大鼠随机分为6组（每组 n=6）:假手术组、假手术+DEX 组、I/R 组、I/R+DEX 组、I/R+DEX+IOX2组、I/R+DEX+溶剂组。给药方式同第（2）部分。于再灌注6小时取下腔静脉血,使用酶联免疫吸附测定法（Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA）检测血清cTnI的水平,以明确各组大鼠心肌损伤的程度。（5）IOX2对右美托咪定后处理的大鼠心肌缺血再灌注导致的心肌组织凋亡的影响。上述6组大鼠于再灌注6小时取左心室组织,行冰冻切片。并使用原位末端标记法（TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling,TUNEL）标记凋亡细胞断裂基因组 DNA的3’-OH末端,在荧光显微镜下检测各组大鼠心肌绀织的凋亡情况。（6）IOX2对右美托咪定后处理的大鼠心肌缺血再灌注导致的心肌梗死面积的影响。取36只健康成年雄性SD大鼠随机分为6组（每组n=6）:假手术组、I/R组、I/R+IOX2 组、I/R+DEX 组、I/R+DEX+IOX2 组、I/R+DEX+溶剂组。于再灌注 6小时,左心室组织行2%伊文氏蓝/1%氯化二苯四氮唑（Evans blue/2,3,5-triphenyl tetrazolium chloride,TTC）染色,分析心肌组织缺血危险区（area at risk,AAR）和心肌梗死区（infarct area,IA）的面积,心肌切片后以称重法分别记录其重量,心肌梗死面积最终以IA 区的承量占AAR区的市量的百分比（IA总重量/AAR总重量×100%）来表示。（7）IOX2对右美托咪定后处理的大鼠心肌缺血再灌注过程中HIF-1α和凋亡相关蛋白表达的影响。取36只雄性SD大鼠随机分为6组（每组n=6）:假手术组、I/R组、I/R+IOX2 组、I/R+DEX 组、I/R+DEX+IOX2 组、I/R+DEX+溶剂组。使用 Western Blot检测缺血再灌注、右美托咪定、IOX2干预后各组大鼠心肌组织中HIF-1α和凋亡相关蛋白 BCL-2、BAX、BNIP3、cleaved caspase-3、cleaved PARP-1 的表达水平的变化。（8）心肌缺血再灌注实验过程中各组大鼠死亡率的比较。记录和比较以上所有7部分实验中,在未达到实验终点前由于任何原因引起的的大鼠死亡情况。以上各组数据以均值±标准误表示,使用GraphPad 7软件进行统计学分析处理。结果:（1）Western Blot结果显示,缺血30分钟再灌注2、6、24小时的三组大鼠心肌组织内HIF-1α蛋白表达均较假手术组显着升高（P<0.01）,且再灌注6小时组的表达量显着高于2小时组（P<0.01）和24小时组（P<0.05）。因此,选取缺血30分钟再灌注6小时作为最佳时间点应用于后续大鼠实验。（2）心电图及心率监测结果显示,心肌缺血再灌注过程引起了大鼠心电图的显着变化,即缺血时ST段显着抬高、再灌注时出现快速型心律失常如室性心动过速、甚至室颤。右美托咪定后处理对于ST段变化和心律失常没有显着影响。实验过程中右美托咪定组的大鼠心率有减慢的趋势,但组内和组间比较的差异都不具有统计学意义（P>0.05）,各组的曲线下面积（心率×时间）也相似。（3）血气、电解质、血红蛋白的结果显示,再灌注6小时各组大鼠的动脉血pH、Pa02、PaCO2、SaO2、Hb、Hct、Na+、K+、Ca2+、Cl-、HCO3-、BE 数值都在正常范围。与假手术组相比,经受心肌I/R的大鼠PaCO2、HCO3-、BE的数值偏低,但组间比较差异不具有统计学意义（P>0.05）。因此,实验过程中大鼠的内环境保持稳定。（4）血清cTnI检测结果显示,I/R组大鼠血清cTnI浓度显着升高为9.78±0.42 ng/ml（P<0.01）,右美托咪定后处理则使cTnI降低至5.07±0.33 ng/ml（P<0.01）,但I/R+DEX+IOX2组又升高为8.19±0.43 ng/ml（P<0.01）。右美托咪定后处理显着减少了大鼠心肌I/R导致的cTnI释放,该保护作用被IOX2逆转,提示右美托咪定后处理通过调控HIF-1α减轻I/R导致的大鼠心肌组织损伤。（5）TUNEL凋亡检测结果显示,I/R组大鼠心肌组织凋亡率为36.67±1.97%（P<0.01）,右美托咪定后处理组则降低至15.59±0.80%（P<0.01）,而I/R+DEX+IOX2组又升高为28.74±1.38%（P<0.01）。此结果证明右美托咪定后处理通过调控HIF-1 α减轻I/R导致大鼠心肌组织的凋亡。（6）Evans Blue/TTC双染检测结果显示,除假手术组外的各组大鼠心肌缺血危险区AAR的面积在45%左右,组间具有可比性（P>0.05）。I/R组和I/R+IOX2组大鼠的心肌梗死面积显着升高为39.27±0.72%和41.53±1.50%（P<0.01）,右美托咪定后处理显着降低梗死面积至20.20±2.07%（P<0.01）,而IOX2又使梗死面积增加至33.90±2.06%（P<0.01）。因此,右美托咪定后处理通过调控HIF-1α减轻I/R导致的大鼠心肌梗死面积。（7）Western Blot的结果显示,右美托咪定后处理使I/R时心肌组织的HIF-1α、BNIP3、cleaved caspase-3、cleaved PARP-1 蛋白表达水平显着减少（P<0.01）,BCL-2/BAX蛋白表达比值显着增加（P<0.01）,而IOX2则逆转了右美托咪定对上述蛋白的效果（P<0.05或P<0.01）。该结果证实右美托咪定后处理通过调控HIF-1α蛋白减轻I/R导致大鼠心肌凋亡相关蛋白的改变。（8）整个实验过程中总共有9只大鼠在实验终点前死亡。死亡原因包括失血、严重心律失常（室性心动过速和室颤）、呼吸衰竭。死亡率分别为:假手术组（1/25,即4.0%）、假手术+DEX组（0/6,即0%）、I/R组（2/38,即5.26%）、I/1R+IOX2组（2/20,即 10%）、I/R+DEX 组（1/1 9,即 5.26%）、I/R+DEX+IOX2 组（2/20,即10%）、I/R+DEX+溶剂组（1/19,即5.26%）。各组死亡率的组间比较,差异不具有统计学意义（P>0.05）。结论:右美托咪定后处理可减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤,表现为降低血清cTnl水平、减轻心肌组织凋亡、减少心肌梗死面积、调控凋亡相关蛋白BCL-2、BAX、BNIP3、cleaved caspase-3、cleaved PARP-1 的表达水平。特异性 HIF-1α 脯氨酰羟化酶-2抑制剂IOX2则逆转了右美托咪定后处理的心肌保护作用和以上指标的变化。综合本部分研究结果,右美托咪定后处理通过作用于HIF-1α此关键靶点减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤。
胡君[4]（2019）在《NPY诱导心肌细胞肥大的线粒体机制及相关信号通路的研究》文中进行了进一步梳理目的:在心肌肥大发生的过程中,不同因素刺激心肌细胞后产生的分子机制各不相同,一直是心肌疾病研究的重点之一。神经肽Y（NPY）是心血管系统中已知的分布最为广泛的神经肽类激素,与多种心肌病的发生发展过程密切相关。但NPY能否通过调控线粒体相关信号途径,直接参与心肌细胞肥大和损伤的调节目前鲜有报道。本研究以体外培养的原代心肌细胞作为实验材料,检测NPY对心肌细胞线粒体功能和细胞肥大的影响,并对其潜在的分子机制进行探讨,以期为心血管疾病的诊疗和心源性猝死的法医病理鉴定提供理论依据。方法:（1）采用联合酶（胰酶和胶原酶Ⅱ型）消化法分离出生72 h内的新生SD大鼠原代心肌细胞进行体外培养,记录细胞的搏动频率并鉴定心肌细胞纯度。（2）用不同浓度的NPY分别处理心肌细胞24 h和48 h后,检测心肌胚胎基因转录水平的变化和心肌细胞面积的改变。（3）不同浓度的NPY处理心肌细胞24h后,检测线粒体氧化应激、线粒体生物合成、膜电位及细胞活性的改变。（4）运用蛋白印迹的方法检测NPY处理原代心肌细胞24 h后,Ca2+和MAPK信号传导通路的激活情况。（5）应用ROS的清除剂N-乙酰半胱氨酸（NAC）,探讨激活的信号通路与心肌细胞内ROS生成之间的关系。（6）应用Ca2+和MAPK信号通路的特异性抑制剂,探讨激活的信号转导通路在NPY诱导的线粒体功能改变和心肌细胞肥大中的作用。结果:（1）新生SD大鼠原代心肌细胞的培养和鉴定。新生SD大鼠原代心肌细胞在体外培养72 h后,心肌细胞的搏动比例和细胞搏动频率趋于稳定,免疫荧光染色结果显示90%以上的细胞表达心肌特异性标记物cTnT。因此,本实验中所采用的心肌细胞全部为原代心肌细胞,在体外培养72 h后,再用相关因子进行刺激和处理。（2）NPY诱导原代心肌细胞肥大。实时定量PCR结果显示,不同浓度（0、10、20、50、100 nM）的NPY分别处理原代心肌细胞24 h和48 h后,随着NPY浓度的上升,心肌胚胎基因ANP、BNP mRNA的表达水平明显上调,具有浓度依赖效应和时间依赖效应;对NPY处理48 h后的心肌细胞面积进行统计,结果进一步表明NPY可显着增加心肌细胞面积,诱导心肌细胞肥大,具有统计学意义。（3）NPY对线粒体氧化应激、线粒体生物合成和膜电位的影响。①NPY 增加心肌细胞内线粒体 ROS（mitochondrial reactive oxygen species,mt-ROS）和总 ROS（total reactive oxygen species,t-ROS）水平。应用线粒体超氧化物荧光探针对心肌细胞内mt-ROS生成进行特异性标记,结果显示NPY可显着增加mt-ROS染色的荧光强度,10 nMNPY即可引起mt-ROS增加2倍左右,100 nMNPY诱导mt-ROS生成的增加更加明显,具有浓度依赖效应;采用DCFH-DA荧光探针对心肌细胞内t-ROS进行标记,结果显示不同浓度的NPY处理原代心肌细胞24 h后,随着NPY浓度的增加,细胞内t-ROS的表达水平同样明显上升,具有显着性差异。②NPY增加PGC-1α、NRF-1、TFam的表达水平。蛋白印迹结果显示,与对照组相比,NPY明显上调线粒体生成的关键蛋白PGC-1α的表达水平,具有统计学意义。实时定量PCR结果显示,不同浓度的NPY可显着增加PGC-1α以及线粒体生成相关的转录因子NRF-1、TFammRNA的表达水平,具有显着性差异。③NPY降低线粒体膜电位和心肌细胞活力。JC-1荧光染色结果显示,不同浓度的NPY处理原代心肌细胞24 h后,心肌细胞线粒体膜电位逐渐降低,100 nM NPY可导致线粒体膜电位下降50%,具有统计学意义。CCK-8检测结果表明,随着NPY浓度的增加,心肌细胞活力明显降低,具有显着性差异。（4）NPY激活Ca2+和p38 MAPK信号转导通路。①NPY激活Ca2+/CaN和Ca2+/CaMK Ⅱ信号转导通路。与对照组相比,不同浓度的NPY处理原代心肌细胞24 h后,显着上调心肌细胞内CaN和p-CaMK Ⅱ的蛋白表达水平,对t-CaMK Ⅱ的蛋白表达量没有明显影响,提示NPY激活了心肌细胞内Ca2+/CaN和Ca2+/CaMK Ⅱ信号转导通路。②NPY激活p38 MAPK信号转导通路。与对照组相比,不同浓度的NPY处理原代心肌细胞24h后,显着上调细胞内p-p38的蛋白表达水平,不影响t-p38的蛋白表达量,p-p38/t-p38的比值显着增加,具有统计学意义,提示NPY可激活心肌细胞内p38 MAPK信号转导通路;与对照组相比,NPY处理不改变p-ERK、t-ERK、p-JNK和t-JNK的蛋白表达水平,提示NPY处理心肌细胞24 h后对ERK和JNK信号通路没有明显影响。（5）NPY激活的Ca2+和p38 MAPK信号通路依赖于心肌细胞内ROS的生成。蛋白印迹结果分析显示,与对照组相比,应用ROS的清除剂NAC可显着逆转100 nM NPY诱导的CaN、p-CaMK Ⅱ和p-p38 MAPK的蛋白表达水平上调,具有统计学意义。（6）Ca2+和p38 MAPK信号通路参与NPY诱导的线粒体损伤和心肌细胞肥大。①CsA、KN93、SB203580缓解NPY诱导的PGC-1α表达增加和线粒体损伤。蛋白印迹结果显示,与对照组相比,应用相关信号通路的特异性抑制剂CsA（Ca2+/CaN）、KN93（Ca2+/CaMK Ⅱ）、SB203580（p38 MAPK）处理原代心肌细胞后,可显着抑制NPY诱导的PGC-1α蛋白表达水平的增加,具有统计学意义。此外,CsA、KN93、SB203580处理原代心肌细胞后还可有效改善100 nM NPY诱导的线粒体膜电位降低和心肌细胞活力下降,具有显着性差异。②NAC、CsA、KN93、SB203580缓解NPY诱导的心肌细胞肥大。与对照组相比,应用NAC及CsA、KN93、SB203580处理原代心肌细胞后,可显着抑制100 nM NPY诱导的ANP、BNP mRNA的表达上调和心肌细胞面积增加,具有统计学意义。结论:（1）NPY可以直接诱导新生SD大鼠原代心肌细胞线粒体损伤和心肌细胞肥大。（2）NPY激活的Ca2+及p38 MAPK信号通路依赖于心肌细胞内ROS的生成。（3）线粒体氧化应激,以及进一步强制性激活线粒体生物合成,可能是NPY诱导心肌细胞肥大的机制之一。
于梦洋[5]（2016）在《β受体阻滞剂联合液体复苏对束缚挤压伤大鼠生存率及心肌损伤的影响》文中研究说明目的:挤压伤（crush injury,CI）是指挤压所致的直接损伤,其主要受损组织是骨骼肌丰富的四肢,而挤压综合征（crush injury syndrome,CS）,又称创伤性横纹肌溶解,是指长时间挤压后受损肌细胞释放其内容物入血间接导致的全身性损害。目前,国内外大多数研究集中在挤压伤解除压力后肾脏损害的病理生理变化及治疗方案的探索,但也有研究表明,在肢体解压早期即存在心肌损害,具体损伤机制及时期尚不明确。挤压伤/挤压综合征的发生过程中除单纯肢体挤压外,常常复合多种致伤因素,如饥饿、束缚应激等,这些因素都会在挤压伤心肌损害过程中产生不同程度的影响。急性应激可激活机体交感肾上腺素能神经系统（adrenergic nervous system,ANS）,引起儿茶酚胺类物质过度释放,过量的儿茶酚胺类物质与β受体结合,持续的β受体刺激将导致心功能不全甚至心衰。β受体阻滞剂是一种通过与β肾上腺素能受体竞争性结合从而阻断儿茶酚胺的激动和兴奋作用的药物。它能够减慢心率、减弱心肌收缩力、降低血压、减少心肌耗氧量,防止儿茶酚胺对心脏的损害,改善左室功能及左室重构。本研究首先通过建立大鼠束缚挤压模型,对受压过程中大鼠心电图（electrocardiogram,ECG）变化进行监测,观察生存状况,分析评价ECG对束缚挤压伤预后的指示作用。同时通过对大鼠血清及心肌组织中儿茶酚胺物质的检测,对心肌组织β1受体（beta 1-adrenergic receptor,β1AR）的表达情况进行评估,进而证明应激对束缚挤压伤过程中心肌损伤的影响。然后,我们将应用β受体阻滞剂（比索洛尔）对束缚挤压模型大鼠进行预处理,同时联合常规液体复苏治疗,通过对近期及远期指标的观察,评价其对生存率及受损心肌的影响。第一部分束缚挤压伤致大鼠心肌损伤的研究目的:建立大鼠束缚挤压模型,观察心电图及生存状况,分析评价ECG对束缚挤压伤预后的指示作用,并证明应激对束缚挤压伤过程中心肌损伤的影响。方法:50只SD（Sprague Dawley）大鼠随机（随机数字法）分为束缚挤压伤模型组（25只）和单纯饥饿对照组（25只）。分别监测72小时心电图,观察心率、ST偏移及T波高度变化,于解压后观察7天,统计生存率变化。36只SD大鼠随机（随机数字法）分为6组,挤压0h组、6h组、12h组、24h组、48h组、72h组,解压即刻经腹主动脉取血、解剖取材。全自动血生化分析仪检测血清中生化指标及心肌酶变化,苏木素伊红（haematoxylin and eosin,HE）染色观察心肌组织形态学变化,免疫组化（immunohistochemical,IHC）检测心肌组织中β-1受体蛋白表达变化,高效液相色谱-电化学法（High performance liquid chromatography,HPLC）检测血清及心肌组织中儿茶酚胺的含量变化。结果:1心电图结果:模型组大鼠心电图改变主要表现为心率减低、ST段抬高及T波高尖。对照组大鼠仅在24小时后表现出心率降低,ST段及T波均无明显变化。2生存情况:束缚挤压模型组解压前生存率为55%,解压后7天生存率为25%,对照组生存率100%。3相关分析结果:生存时间与心电图改变时间呈正相关。4生化指标及心肌酶结果:与0h组相比,BUN浓度在72h组升高（P<0.01）,血清K+浓度在48h组升高（P<0.01）,血清LDH、CK、CKMB浓度在6h组开始明显升高（P<0.01）,血清AST浓度在12h组升高（P<0.05）,ALT浓度在48h组升高（P<0.01）。5 HE染色结果:心肌组织病理变化随挤压时间延长逐渐加重。6免疫组化结果:β-1受体的平均OD值在束缚挤压6h明显减低（与0h比,P<0.01）,12h逐渐升高（与6h比,P<0.01）,24h达到峰值（与0h比,P<0.05,与12h比,P<0.01）后趋于平稳,72h平均OD值再次达到高峰（与0h比,P<0.01,与48h比,P<0.01）。7 HPLC结果:血清中,NE浓度在挤压后12h明显升高（与0h相比,P<0.05）,E和DA浓度在挤压后6h即开始明显升高（与0h相比,P<0.05）。心肌组织中,三种儿茶酚胺类物质浓度整体低于血清浓度,NE浓度变化趋势和血清NE浓度变化基本相同,E和DA浓度在束缚挤压过程中均无明显变化。结论:1束缚挤压早期即存在心肌损伤。2应激在束缚挤压伤心肌损伤过程有着重要影响。第二部分β受体阻滞剂联合液体复苏治疗束缚挤压伤大鼠生存率及心肌损伤的效果评价目的:评价β受体阻滞剂（比索洛尔）联合液体复苏治疗对束缚挤压模型大鼠生存率及受损心肌的影响。方法:175只SD大鼠随机（随机数字法）分为5组:假手术组（Sham）、束缚挤压伤组（Crush injury）、单纯β受体阻滞剂干预组（β-R）、单纯液体复苏组（SAL）、β受体阻滞剂干预联合液体复苏组（β-R&SAL）,每组35只,其中20只用于观察生存情况并进行超声检测,15只用于血液指标及组织学研究。各组于解压后观察7天,统计生存率变化,分别于解压后1天、7天、30天对各组大鼠进行超声心动检查,于挤压前、解压后1天、30天经腹主动脉取血、解剖取材,全自动血生化分析仪检测血清中生化指标及心肌酶变化,HE染色观察心肌组织形态学变化,Masson染色观察心肌组织纤维化情况,计算胶原容积分数（collagen volume fraction,CVF）。结果:1生存率结果:观察各组大鼠解压后7天生存率变化,假手术组（Sham）生存率为100%,束缚挤压模型组（Crush injury）生存率为15%,单纯β受体阻滞剂干预组（β-R）生存率为30%,单纯液体复苏组（SAL）生存率为40%,β受体阻滞剂干预联合液体复苏治疗组（β-R&SAL）生存率为55%。与模型组相比,β受体阻滞剂干预联合液体复苏治疗组生存率有所改善,差异有统计学意义（P<0.05）。2血液指标:解压后1天模型组血清AST、ALT、LDH、BUN、CR、CK及CKMB较假手术组均明显增高,β-R治疗组AST、ALT、LDH、CK、CKMB均明显降低,解压后30天,模型组各项生化指标基本恢复正常,只有LDH、CK、CKMB较假手术组仍有轻度升高,各治疗组所有指标均恢复正常。3 HE染色结果:解压后1d,Sham组大鼠心肌组织细胞结构清晰、排列整齐、胞浆染色均匀;Crush injury组可见局部心肌组织坏死、大量炎性细胞浸润、心肌细胞排列紊乱;β-R组可见部分肌纤维断裂、心肌细胞扭曲、排列紊乱;SAL组可见心肌细胞胞浆深染、肌纤维排列紊乱;β-R&SAL组可见心肌细胞胞浆染色不均匀、肌纤维排列相对整齐。解压后30d,Sham组大鼠心肌组织细胞结构清晰、排列整齐、胞浆染色均匀;Crush injury组可见大量心肌纤维断裂、扭曲、排列紊乱,局部心肌细胞深染、炎性细胞浸润;SAL组可见心肌细胞变形、胞浆深染、肌纤维排列紊乱;β-R&SAL组可见心肌细胞胞浆染色不均匀、肌纤维排列相对整齐。4 Masson染色结果:解压后1d,与Sham组相比,Crush injury组大鼠CVF%显着增加（21.43±3.82,P<0.01）,与Crush injury组相比,联合治疗组大鼠CVF%减低（17.52±3.74,P<0.01）。解压后30d,与Sham组相比,Crush injury组大鼠CVF%显着增加（35.78±5.60,P<0.01）,与Crush injury组相比,β-R组大鼠CVF%（6.92±1.99,P<0.01）,SAL组大鼠CVF%（9.59±1.86,P<0.01）及联合治疗组大鼠CVF%（2.48±1.25,P<0.01）均减低,差异有统计学意义。5超声心动结果:M型超声图可见Crush injury组大鼠在解压后1d心室壁运动幅度明显减弱,解压后30d心室腔明显增大。三个治疗组30d后有不同程度改善。模型组较假手术组左室质量（left ventricular mass,LVM）明显增加,收缩期左室容积（left ventricular volume at end-systole,LVVs）增大,收缩期左室内径（left ventricular internal diameter at end-systole,LVIDs）增大,提示心室重塑,解压后30天,β-R&SAL联合治疗组与模型组相比LVM、LVVs、LVIDs均减小,但短轴短缩率（fractional shortening,FS）、射血分数（ejection fraction,EF）及左室后壁厚度（left ventricle posterior wall thickness,LVPW）等指标并无明显改善。结论:1β受体阻滞剂联合液体复苏可有效改善束缚挤压伤大鼠生存率;2β受体阻滞剂联合液体复苏可减轻束缚挤压伤大鼠心肌组织纤维化程度,改善心室重塑。
卓荦[6]（2013）在《3,4-亚甲基二氧基甲基苯丙胺对大鼠心肌细胞Connexin43以及细胞内钙稳态的影响》文中指出【研究背景】摇头丸，其主要成分为3,4-亚甲基二氧基甲基苯丙胺（MDMA），常见于夜总会、迪吧、歌厅以及各种狂欢聚会场合，使用者多为22岁左右的年轻人。国内外研究及临床数据证实MDMA除了神经毒性之外，还具有肝毒性和心血管毒性。MDMA急性中毒可导致显着的心血管功能异常，表现为心率增加，血压增高以及心肌耗氧量增加引起高血压、心律失常、心肌缺血甚至心衰。已知的研究数据表明，MDMA可通过神经递质途径产生间接的心血管毒性作用，而其氧化代谢产物可破坏细胞抗氧化防御系统诱导氧化应激从而引起心肌细胞损伤。虽然大量的证据表明MDMA能够导致心功能异常，但是其对于心肌细胞的直接毒性作用的机制却尚未探明，MDMA是否还具有其它的心肌毒性作用仍然是未知领域。心肌缝隙连接已经被广泛证实在维持心肌的正常搏动节律中起到至关重要的作用。它能够保持心肌细胞间搏动电传导的致性和稳定性。缝隙连接蛋白的异常，包括蛋白含量，分布以及磷酸化状态的改变，都可导致致死性心律失常的发生。然而，到目前为止，尚未有研究针对MDMA诱发心律失常与心室肌细胞缝隙连接蛋白之间的关联。基于前期的理论和实验基础，我们在本课题中针对MDMA与心肌细胞缝隙连接蛋白的影响进行深入的研究，从而进步揭示MDMA直接诱导心肌毒性的分子毒理机制。【目的】1.观察MDMA急性中毒对大鼠心电功能的影响；2.观察MDMA急性中毒对大鼠心肌细胞缝隙连接蛋白43的影响；3.体外原代培养新生大鼠心室肌细胞并构建体外MDMA急性染毒模型，观察不同浓度MDMA急性染毒对于心室肌细胞CX43蛋白表达含量以及转录水平的影响；4.观察不同浓度MDMA急性染毒对于体外培养新生大鼠心室肌细胞间连接蛋白43含量以及分布的影响；5.观察不同浓度的MDMA急性染毒对体外培养新生大鼠心室肌细胞连接蛋白43磷酸化位点Ser368磷酸化状态的影响；6.观察MDMA急性染毒对于体外培养心室肌细胞内钙振荡模式以及细胞内钙离子浓度的影响。【实验方法】1.将摇头丸片剂研磨、溶解，对获得的溶液进行酸-碱反提萃取法提取MDMA有效成分，并运用气相色谱-质谱联用系统对提取物进行成分以及纯度检验；2.动物实验：将18只SPF级SD大鼠随机分为实验组和对照组。实验组大鼠腹腔注射20mg/kg MDMA后实时记录其心电图以及心率变化。对照组则给予腹腔注射无菌生理盐水后记录其心电图以及心率变化。所有大鼠在24小时后采用颈椎脱臼法处死，迅速剪取心室部分并用生理盐水冲洗干净，多聚甲醛固定、石蜡包埋并制作切片。利用H&E染色观察心肌细胞形态学变化。利用免疫组织化学法对心室肌细胞中连接蛋白43进行定量分析，并观察其分布情况。3.体外实验：选取0天或1天SPF级新生大鼠，消毒后迅速剪取心脏心室部分，利用混合组织消化液分步消化结合差速贴壁法获得纯化的心室肌细胞，置于培养箱中培养。于培养第6天，加入含有10、100、1000μM浓度的MDMA的无血清培养基进行急性染毒1小时，建立MDMA急性染毒体外模型。提取心室肌细胞总膜蛋白，利用蛋白免疫印迹法检测心室肌细胞中总连接蛋白43的表达含量的变化。同时提取细胞总RNA，利用荧光实时定量PCR法检测连接蛋白43mRNA（GJA1）表达含量的变化。4.利用免疫荧光法检测不同浓度（10、100、1000μM）的MDMA染毒的心室肌细胞缝隙连接处连接蛋白43的表达和分布改变。5.向体外培养的心室肌细胞中加入1000μM MDMA急性染毒1小时后，提取实验组和对照组心室肌细胞总蛋白，利用Western Blot法检测连接蛋白43磷酸化位点Ser368的磷酸化状态的改变，并检测心室肌细胞中PKC的含量。利用Fluo-4标记钙离子，在激光共聚焦显微镜下观察MDMA急性染毒组和对照组新生大鼠心室肌细胞内钙振荡模式的变化以及细胞内钙浓度的改变。【数据分析】所有结果采用平均值±标准差。组间比较采用双向方差分析法，两组比较采用非配对t检验法，p值小于0.05为有统计学差异。所有统计学分析采用SPSS13.0软件以及Graph prism医学统计软件。【结果】1.从摇头丸中提取的MDMA成分经质谱检验未见其它活性杂质，MDMA纯度高达95%。2.心电图结果显示急性MDMA腹腔注射后大鼠出现明显的心电图异常，表现为QRS间期延长，波幅增强，并呈现不规则变化。实时心率检测显示，实验组大鼠心率发生显着改变，大鼠心率变化起伏不定，并表现为不规则波动。实验组大鼠平均心率呈下降趋势。3.实验组大鼠心室肌细胞未见明显形态学改变，部分视野下可见心肌纤维萎缩，横纹消失，肌浆呈嗜酸性变性，散在局灶性空泡样变性。4.实验组大鼠中有2只大鼠在注射MDMA后2小时内发生自发性死亡。免疫组织化学结果显示，实验组大鼠心肌细胞连接蛋白43表达含量显着下降。自发性死亡大鼠心肌细胞可见连接蛋白43分布异常，沿心肌细胞两侧长轴方向分布。5.体外培养的新生大鼠心室肌细胞可见成片搏动。MDMA急性染毒组心肌细胞总连接蛋白43含量以及连接蛋白43mRNA表达均显着下降。免疫荧光检测见100、1000μM高浓度MDMA染毒可引起缝隙连接中连接蛋白43的含量下降及分布异常。MDMA还引起心肌细胞N-钙粘蛋白的表达显着下降。6.高浓度MDMA可导致连接蛋白43磷酸化状态改变，表现为非磷酸化状态比例上升，同时可引起磷酸化位点Ser368的磷酸化水平增加，但却对心肌细胞内PKC含量未造成影响。高浓度MDMA同时还引起心肌细胞内钙振荡模式的改变和钙离子浓度的上升。【结论】1.动物实验证实MDMA可诱发大鼠心率改变以及心电异常，甚至猝死，这些毒性作用与其引起心肌细胞连接蛋白43表达含量下降有关。2.体外实验表明MDMA可直接作用于心室肌细胞引起连接蛋白43基因转录水平以及蛋白表达显着下降，同时其引起心肌N-钙粘蛋白水平的下调与MDMA导致连接蛋白43的分布异常有关。3. MDMA可诱发心室肌细胞内钙振荡模式的改变以及细胞内钙离子浓度的增加介导相应蛋白激酶的活性引起连接蛋白43磷酸化磷酸化位点Ser368磷酸化水平升高。4.本研究首次证实了MDMA可破坏心肌细胞内钙稳态，影响心肌细胞连接蛋白43的表达、分布以及磷酸化状态，诱发心电功能障碍，从而导致心律失常的发生。这也是MDMA直接心肌毒性的潜在作用机制之。
王会云[7]（2011）在《大鼠软组织挤压伤致离体胸主动脉反应性变化》文中研究指明目的:观察大鼠软组织挤压伤对离体胸主动脉反应性变化的影响,并探讨一氧化氮（NO）在血管反应性变化中的可能作用。方法:成年SD大鼠30只随机分为对照组（C组）、挤压后8h组（C8h组）、挤压后16h组（C16h组）。大鼠用4%水合氯醛腹腔注射麻醉后俯卧位固定,挤压组大鼠于双后肢用12.5 kg标准重物持续挤压5h,之后去除重物,分别恢复自由活动和饮食8h、16h。对照组大鼠不予挤压、其余处理同挤压组。将大鼠于相应时间点放血处死,制备离体胸主动脉环（TARs）,部分TARs做去内皮处理。用离体血管张力检测技术检测TARs对乙酰胆碱（ACh）、Ca2+载体A23187、苯肾上腺素（PE）和血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）的反应张力变化;部分内皮完整、去内皮TARs用L-NNA预孵育20min后再检测对PE、AngⅡ的收缩反应张力变化。结果:（1）舒张反应变化与C组比较,C8h、C16h组TARs对10-6mol/L ACh舒张反应张力明显下降（P<0.050.01）;与C8h组比较,C16h组TARs对10-6mol/L ACh舒张反应张力进一步明显降低（P<0.01）。与C组比较,C8h、C16h组TARs对10-810-4mol/L ACh、10-810-5mol/L A23187舒张反应张力明显降低（P<0.050.01）,累积浓度舒张反应曲线明显向下移位,其中,C16h组TARs对ACh、A23187舒张反应张力降低更明显,与C8h组比较有明显差异（P<0.050.01）。（2）收缩反应变化与C组比较,C8h组TARs对10–6mol/L PE收缩反应张力呈降低趋势,C16h组TARs对10–6mol/L PE收缩反应张力明显降低（P<0.01）;C16h组TARs的收缩反应张力降低更明显,与C8h组比较P<0.01。与C组比较,C8h组和C16h组TARs对10-710-4 mol/L PE累积浓度收缩反应张力明显降低（P<0.050.01）;与C8h组比较,C16h组TARs对10-6及10-4mol/L PE收缩反应张力明显降低,差异有统计学意义（P<0.01）。与C组比较,C8h、C16h组TARs对10-810-5mol/L AngⅡ收缩反应张力明显降低（P<0.050.01）,累积浓度收缩反应曲线明显向下移位;C16组TARs对10–810–5mol/L AngⅡ收缩反应张力明显降低,累积浓度收缩反应曲线显着向下移位,与C8h组比较有明显差异（P<0.050.01）。（3）NO的作用与L-NNA预孵育前比较,C组、C8h、C16h组TARs L-NNA预孵育后对10–810–4mol/L PE、10-810-5mol/L AngⅡ收缩反应张力均明显增高（P<0.050.01）,累积浓度收缩反应曲线明显向上移位,其中,C8h、C16h组TARs L-NNA预孵育后收缩反应张力升高更显着。（4）内皮细胞的作用与内皮完整TARs比较,C组去内皮TARs对10-810-5mol/L AngⅡ收缩反应张力呈增加趋势,累积浓度收缩反应曲线略向上移位;C8h、C16h组去内皮TARs对10-810-5mol/L AngⅡ收缩反应张力显着增加（P<0.050.01）,累积浓度收缩反应曲线明显向上移位。与内皮完整TARs比较,C组、C8h组去内皮TARs对PE累积浓度收缩反应稍增加;而C16h组去内皮TARs对PE收缩反应张力降低。结论:大鼠软组织挤压伤可引起离体胸主动脉收缩和舒张反应异常,血管源性NO参与介导血管反应性异常变化。
牟艳玲[8]（2009）在《新型化合物—甲胺鸢尾素对急性心肌缺血损伤的保护作用及机制研究》文中进行了进一步梳理研究目的急性心肌缺血性损伤（Acute Myrocardial Ischemia,AMI）是严重危害我国中老年人健康的重大疾病,也是最常见的猝死原因之一。心肌缺血后的修复过程及预后与缺血心肌血管的功能状态密切相关,缺血区内是否有血管迅速生成对于心肌缺血后建立良好的侧支循环、改善缺血区血液供应、促进缺血区心肌的存活具有非常重要的意义。介入治疗如经皮冠状动脉腔内成形术（PTCA）和冠状动脉内支架是目前AMI后血运重建的常用方法,但由于介入治疗只适于直径＞2mm的动脉,对直径＜2 mm的动脉和具体负责灌注的微小血管则无能为力,且存在术后再狭窄（25%～50%）问题,以至有相当多的病人（20%～37%）不能达到完全血运重建而影响预后。除了残存血管的重新开放,近年来,诱导血管新生以重建血运挽救濒死的心肌成为治疗AMI所致心肌损伤的一个新策略,这种方法又被称为“治疗性血管新生”。虽然目前对血管新生及治疗性血管新生进行了较多的基础及临床方面的研究,各种血管生长因子及转基因治疗的促进血管新生作用己被认可,但由于多种血管生长因子本身的局限性和应用的烦琐及转基因治疗中尚存在许多问题使其在临床上的应用受到限制,所以需要寻找以诱导血管新生为靶点的更方便、有效、实用的药物来代替生长因子。我们前期的研究结果表明,从葛花中提取分离的异黄酮化合物葛花苷具有明显的耐缺氧活性和抗心肌缺血活性,亦具有明显的改善血液粘度活性及抗血栓形成作用,但是该化合物水溶性较差,使其研究受到一定的限制。因此,我们对葛花苷结构进行修饰,在保留活性基团的基础上,增加水溶性基团,克服该化合物所存在的不足,得到一个新型化合物—甲胺鸢尾素。该化合物水溶性增加,易吸收。小鼠急性毒性实验和体外细胞毒实验表明,该新型化合物毒性较低。我们拟在此基础上深入研究这一新型化合物对缺血心肌的保护作用,从其对缺血心肌心功能、缺血缺氧/再灌注损伤、促血管新生信号通路因子（HIF-1α、VEGF、NO）等多方面深入研究其作用机制,为缺血性心脏病的治疗提供新的药物靶点和创新型药物。研究方法本研究分为两大部分。第一部分采用体内外实验研究甲胺鸢尾素对心肌缺血损伤的保护作用及其机制。第二部分采用体内外实验研究甲胺鸢尾素在急性心肌缺血损伤后促进血管新生的的作用与机制。第一部分:甲胺鸢尾素改善急性心肌缺血损伤的作用及机制研究首先,体内实验观察了新型化合物甲胺鸢尾素对健康小鼠常压耐缺氧存活时间、电刺激大鼠血栓形成时间及对正常大鼠血液粘度的影响,研究甲胺鸢尾素对动物耗氧量及血液流变学的影响;分别采用异丙肾上腺素多次皮下注射和经典的冠状动脉结扎方法建立急性心肌缺血损伤模型,观察甲胺鸢尾素对缺血心肌病理改变、缺血/梗塞面积、心肌酶、心功能、血浆CGRP和ET-1水平等的影响,探讨其对心肌缺血损伤的保护作用。其次,体外实验以原代培养的Wistar乳鼠心肌细胞为研究对象,以高纯氮气（99%）饱和与否建立细胞缺血再灌注损伤（缺氧3h、再灌注6h）模型,以甲胺鸢尾素对损伤心肌细胞形态的变化及细胞存活率的影响、对损伤细胞超氧化物岐化酶（SOD）活性、丙二醛（MDA）含量、乳酸脱氢酶（LDH）的释放量、活性氧生成量、线粒体膜电位、凋亡细胞比率及细胞内钙含量等为观察指标,从细胞水平上探讨甲胺鸢尾素保护心肌细胞缺血损伤的作用机制。第二部分:甲胺鸢尾素在急性心肌缺血损伤后促血管新生的作用与机制研究采用结扎大鼠冠状动脉前降支方法造成急性心肌缺血损伤模型,观察甲胺鸢尾素连续给药30天对缺血心肌梗塞边缘区血管新生的作用、对梗塞边缘区心肌超微结构的影响;分别采用免疫组化、Western blot、实时定量PCR等方法定性、定量的观察甲胺鸢尾素对缺血心肌缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）及其调节的下游靶基因血管内皮细胞生长因子（VEGF）、内皮型一氧化氮合酶（eNOS）表达的影响;分别采用ELISA、放免、酶检测法检测甲胺鸢尾素对血清VEGF、血浆降钙素基因相关肽（CGRP）和内皮素（ET-1）水平、血清一氧化氮（NO）含量的影响;观察甲胺鸢尾素对培养的人脐静脉内皮细胞（HUVEC）增殖、迁移和管样结构形成以及缺氧损伤后NO含量的影响,明确甲胺鸢尾素在急性心肌缺血后促进血管新生的作用与机制。结果1.甲胺鸢尾素一次性腹腔注射给药300mg/kg和150mg/kg均能明显增加小鼠常压下耐缺氧存活时间（P＜0.01）;200、100mg/kg剂量可明显降低大鼠血液粘度（P＜0.01）,延长电刺激大鼠颈动脉血栓形成时间（P＜0.05）。2.甲胺鸢尾素200、100mg/kg对异丙肾上腺素所致大鼠心肌缺血损伤具有明显的保护作用,能减轻异丙肾上腺素对心肌缺血的病理性损害,稳定细胞膜,使心肌酶释放减少,与对照组比较差异显着（P＜0.05）。3.甲胺鸢尾素80mg/kg剂量组明显减轻犬急性心肌缺血程度（∑-ST）、缩小缺血范围（N-ST）、缩小心肌梗塞面积;40mg/kg剂量组有降低心肌缺血程度和缩小心肌梗塞范围的趋势,但与模型组比较无明显差异（P＞0.05）。甲胺鸢尾素80mg/kg剂量组给药后2-4h使血清磷酸肌酸激酶同功酶（CK-MB）、LDH释放量明显降低。40mg/kg剂量组给药后4h显着降低LDH释放量（P＜0.05）,对血清谷草转氨酶（AST）、磷酸肌酸激酶（CK）有降低趋势,但与模型组比较无明显差异（P＞0.05）。4.甲胺鸢尾素200mg/kg剂量组可以明显改善大鼠急性心肌梗塞后心肌病理改变;使心肌收缩压、舒张压、左室内压升高,心率减慢（P＜0.01）;血浆CGRP和ET-1水平达到稳态平衡。5.甲胺鸢尾素(10-7 M,10-6 M,10-5 M)能明显提高缺血（3h）再灌注（6h）损伤细胞存活率,提高细胞内SOD活性,明显降低细胞内MDA和ROS生成量、降低凋亡细胞比率,升高线粒体膜电位、明显降低细胞内钙含量,与模型组比较差异显着（P＜0.01）。6.甲胺鸢尾素使急性心肌缺血边缘区心肌新生毛细血管密度增加;明显改善缺血心肌的超微结构。免疫组化和Western Blot结果表明,HIF-1α和VEGF蛋白表达增加;实时定量PCR结果显示HIF-1α基因表达各组未见明显差异,而VEGF、eNOSmRNA表达升高。甲胺鸢尾素200mg/kg使血清VEGF和NO水平提高,与模型组比较显着差异（P＜0.01）。对培养的HUVEC细胞,甲胺鸢尾素预处理可使培养的HUVEC细胞增殖加快（S期和G2期细胞增多）、迁移能力增强、管样结构形成数目增多。缺血缺氧损伤模型组内皮细胞NO含量及NOS活性明显低于正常对照组（P＜0.01）,而预先用甲胺鸢尾素(10-7 M,10-6 M,10-5M)处理的各组内皮细胞内NO含量及NOS活性则明显高于模型组,显着差异（P＜0.01）。结论1.甲胺鸢尾素能明显增加耐缺氧小鼠存活时间、延长电刺激大鼠血栓形成时间、降低大鼠血液粘度;减轻异丙肾上腺素对心肌的病理性损害、减少心肌酶的释放;明显减轻冠脉结扎犬心肌缺血/梗塞面积;明显改善急性心肌梗塞后大鼠心功能,具有明显的心肌缺血保护作用,其机制可能与改善受损心肌供血、供氧,稳定细胞膜,从而调节能量代谢、改善血液流变作用有关。2.甲胺鸢尾素可提高缺血再灌注损伤细胞存活率、提高氧自由基清除能力、降低细胞活性氧水平、升高线粒体膜电位。其机制可能与增强机体抗氧化酶活性、降低缺氧再给氧产生的活性氧水平,从而改善线粒体功能、降低细胞内钙超载有关。3.缺血缺氧损伤心肌HIF-1α基因表达未见明显变化、蛋白表达增加,VEGF基因和蛋白表达均明显增加,NOS活性增强、NO合成增加,说明在我们的实验条件中缺血缺氧并不影响HIF-1α基因表达,但可减少其降解,增加其活性,启动HIF-1α-VEGF-NO信号通路的转导,代偿性起到心肌保护作用。但是随着缺血时间的延长,代偿作用减弱。因此,维持HIF-1α—VEGF—NO信号通路的转导是治疗缺血性心脏病的靶点之一。4.甲胺鸢尾素能明显增加心肌缺血边缘区微血管形成,可使HIF-1α、VEGF表达均维持在较高水平,血清VEGF、NO水平升高,说明其可以促进HIF-1α—VEGF—NO这一信号通路的转导,从而改善缺血心肌微循环和氧的供需平衡,起到“药物搭桥”治疗心肌缺血的作用。5.甲胺鸢尾素可以促进体外培养的HUVEC细胞增殖、迁移和管样结构形成,增加内皮细胞NOS合成分泌NO的能力,这可能是其发挥改善微循环、增加缺血区血供,从而产生“治疗性血管新生”的机制之一。本研究的意义与创新点心肌缺血性损伤是严重危害人类健康的重要疾病,研究防治此类疾病的药物并探讨其机制具有重要的理论意义和现实意义。本研究明确了新型化合物甲胺鸢尾素对缺血心肌的保护作用及其机制,为其防治缺血性心脏病的研究开发提供理论基础。主要创新点:1.对葛花苷进行结构修饰,得到有良好药理活性的具有自主知识产权的新型化合物—甲胺鸢尾素,申报国家专利号:200610068403.5。2.对心肌缺血模型中血浆CGRP和ET-1水平进行动态监测,明确心肌缺血发生发展的病理生理基础:明确了促进HIF-1α—VEGF—NO信号通路的转导是治疗缺血性心脏病的靶点之一。3.阐明了甲胺鸢尾素可以通过稳定细胞膜、改善微循环、降低钙超载、减轻线粒体损伤,促进HIF-1a—VEGF—NO这一信号通路的转导,从而提高促血管新生因子（HIF-1α、VEGF、eNOS）的表达,发挥心肌缺血的保护作用。4.本课题研究为中药黄酮类提取物的研究提供思路。
刘艳[9]（2009）在《乌头碱对大鼠心肌细胞毒性作用的分子毒理学机制研究》文中研究指明1研究背景有毒动植物中毒是具有中国特色法医毒理学的重要组成部分，也是我国法医毒理学研究的重点内容之一。乌头与乌头属植物是我国临床常用的重要中药，是药用有毒植物的典型代表，也为我国最早有记载的有毒植物，其主要毒性成分为乌头类生物碱，其中以含有双酯基化学结构的乌头碱毒性最强。乌头碱的主要毒性作用的靶器官，主要为心脏与神经系统。有大量研究表明，乌头碱的毒性成份，也是其药性成份，具有强心、镇痛、抗炎、抗肿瘤、降低血压、降低血管通透性等作用，广泛地被应用于临床治疗。由于乌头碱的毒性剧烈，其有效治疗剂量与中毒剂量或致死量极为接近，用药稍有不慎，如因炮制不当，或误服等，即可引起中毒甚至死亡。而利用乌头属植物及乌头碱自杀、投毒他杀的案件时有发生，可见乌头碱中毒在有毒动植物中毒中占有重要位置。为了进一步提高乌头碱中毒的诊断、治疗，规范乌头属有毒中药在疾病中的使用，同时，也为乌头碱中毒的法医学鉴定提供相关的理论依据，对乌头碱中毒机制研究，特别是乌头碱对心肌细胞的毒性作用机制研究，成为了中药研究与应用、临床急救医学和法医毒理学研究的重点问题。近年来，国内外对乌头碱心肌细胞毒性作用机制的研究，已进入到细胞质膜动态变化的分子作用机理水平。但大多仍局限于心肌细胞损伤及单个心肌细胞离子通道检测等方面，对毒物靶器官心室肌细胞群毒性作用的分子毒理学机制，特别是乌头碱对心肌细胞之间信息传递的影响机制、基因表达调控机制尚不明确。2研究目的2．1系统观察不同浓度乌头碱染毒后心肌细胞的毒理病理学变化，研究不同中毒剂量、中毒时间与病变间的效应关系，优化、规范乌头碱靶器官的细胞培养及分子毒理学研究的基础方法；2．2研究乌头碱中毒与心肌细胞DNA损伤的关系，为从分子毒理学角度研究DNA损伤与乌头碱中毒机制的关系提供基础；2．3研究乌头碱染毒对心肌细胞Ca2+依赖性蛋白激酶Cα亚型（PKCα）的表达、PKCα磷酸化水平，以及PKCα磷酸化对Cx43磷酸化表达的影响，明确其内在级联效应关系，及参与乌头碱心肌细胞毒性作用分子机制的途径；2．4研究乌头碱对心肌细胞内Ca2+调控蛋白表达的影响，观察Ca2+调控蛋白参与乌头碱心肌细胞毒性作用机制的方式；2．5研究乌头碱中毒特征及法医学鉴定注意事项。3研究方法3．1新生大鼠心肌细胞原代培养及其方法优化研究选择1～2d的SD新生大白鼠，雄雌不限，消毒后直接剪取心室肌，用胰蛋白酶等消化液消化，制作心肌细胞悬液；于37℃、5％CO2培养箱，以差速贴壁法培养原代心肌细胞，优化心肌细胞原代培养方法，提高心室肌细胞纯度、成活率和心肌细胞群整体性。选用台盼蓝染色法进行培养心肌细胞活性鉴定；采用抗心肌特异性单克隆抗体，结合间接免疫荧光法检测，对心肌细胞纯度进行鉴定。规范、优化新生大鼠心肌细胞体外原代培养的方法，为后续研究建立良好地基础。3．2乌头碱染毒模型的建立及毒性效应研究于心肌细胞原代培养第6天，更换无血清培养液培养16～18h，以去除血清干扰，再加入不同浓度乌头碱，构建心肌细胞乌头碱染毒模型，根据实验目的不同，设定不同的阳性和阴性对照。实时动态监测乌头碱染毒心肌细胞的形态、功能的变化，研究乌头碱的毒性对心肌细胞损伤的量效作用。3．3乌头碱对大鼠心肌培养细胞DNA损伤的研究新生SD大鼠24只，随机分为6组；取心室肌以差速贴壁法原代培养心室肌细胞。培养第6天，更换无血清培养液培养后，制成密度为2×105个细胞／mL的细胞悬液，分别加入浓度为0.1、0.5、1.0、2.0μmol／L的乌头碱混合液，染毒30 min；并以PBS溶液作阴性对照。采用彗星电泳技术及CASP分析软件，检测不同浓度乌头碱染毒后心室肌细胞DNA损伤程度。实验重复6次。3．4乌头碱对新生大鼠心肌培养细胞内PKCα表达的影响取12孔原代心肌培养细胞组，分成对照组（Normal）、乌头碱染毒组（ACO）、碱性磷酸酶处理组（A．P．）、AAP干预组（AAP）、AAP干预后乌头碱染毒组（AAP+ACO）、PKCα抑制剂G（o|¨） 6976干预组（G（o|¨） 6976），及AAP与G（o|¨） 6976联合干预组（AAP+G（o|¨） 6976），共7组。提取各实验组及对照组心肌细胞总蛋白，以BCA法标准蛋白曲线定量，采用Western-blotting技术，选用P-Cx43（Ser-368）蛋白抗体、NP-Cx43（Ser-368）蛋白抗体、抗PKCα蛋白抗体，及P-PKCα（Ser-657）蛋白抗体，定量检测各组在培养心肌细胞内P-Cx43（Ser-368）蛋白、NP-Cx43（Ser-368）蛋白、总PKCα蛋白，及P-PKCα（Ser-657）蛋白表达含量变化。实验重复6次。3．5乌头碱对心肌细胞PKCα及P-PKCα（Ser-657）位点磷酸化状态的影响选择兔抗鼠总PKCα多克隆抗体（稀释度为1：200）、兔抗鼠磷酸化PKCα（Ser-657）（稀释度为1：200）功能性抗体，用Fluorescein标记山羊抗兔IgG和Rhodamine标记山羊抗兔IgG（稀释度为1：100），应用激光共聚焦扫描显微镜，结合细胞图像荧光定分析技术，检测乌头碱染毒前后，心肌细胞激酶Cα亚型及其第657位丝氨酸残基（Ser657）位点，特异性磷酸化状态的改变。3．6乌头碱对大鼠心肌培养细胞Ca2+调控蛋白表达的影响取12孔原代心肌培养细胞组，运用荧光标记技术及RT-PCR技术，建立钠钙交换体（NCX）、肌浆网钙泵Ca2+-ATP酶（SERCA2）、磷酸受钠蛋白（PLB）、兰尼碱受体（RyR2），及管家基因β-actin共5个基因座的多重荧光复合RT-PCR反应体系及扩增方法，在3100 DNA测序仪中进行毛细管电泳，检测乌头碱染毒组及正常对照组心肌细胞内NCX、SERCA2、RyR2、PLB四种基因mRNA表达的差异与变化。实验重复6次。3．7乌头碱中毒10例法医学尸检资料分析收集10例乌头碱中毒死亡的法医学鉴定资料，包括系统的法医学解剖资料及组织病理学检查结果，部分案例还有案情调查、抢救病历资料等；并按年龄、性别、中毒原因、中毒类型、病理变化及特征等分类整理。结乌头碱中毒的毒理病理组织学变化，探讨乌头碱中毒法医学鉴定的注意事项。3．8实验数据的统计学分析本实验研究采用SSPS统计软件（version 10.0，USA）分析，数据以（?）±s表示。3．8．1彗星电泳结果采用CASP软件分析HDNA％、TDNA％、TL、TM、OTM，5个检测指标。计算各组平均值和标准差，以（?）±s表示，应用SSPS在方差齐性条件下做单因素方差分析，对各剂量组组间差异进行比较分析。3．8．2正常对照组和各实验组中P-Cx43（Ser-368）蛋白表达和NP-Cx43（Ser-368）蛋白表达差异、总PKCα蛋白表达和P-PKCα（Ser-657）蛋白表达相对含量分析，应用SSPS做单变量两因素方差分析（ANOVA），对组间均数的多重比较选用Games-Howell检验。3．8．3对ca2+调控蛋白NCX、SERCA2、RyR2、PLB基因mRNA表达的差异与变化，应用SSPS做t检验。4研究结果4．1原代培养心肌细胞及其方法优化在倒置相差显微镜下观察，刚接种时的心肌细胞悬浮于培养液中，为均一、分散的圆形折光颗粒；12 h后细胞已开始贴壁生长，偶尔可见个别细胞自发搏动；培养24 h后，贴壁细胞互相连接呈稀疏网状，并出现缓慢的同步化搏动；48 h后，心肌细胞在培养孔底部进一步伸展，呈现快速同步化搏动的细胞单层，搏动频率约80～120次／min；培养第6天，心肌细胞在培养孔底部充分伸展，形成稳定的同步化搏动细胞单层，频率约120次／min。采用台盼蓝染色法测定，活细胞的存活率平均达到97.33％；选用抗心肌肌钙蛋白Ⅰ（cTnⅠ）特异性单克隆抗体，结合免疫荧光法检测，心肌培养细胞平均细胞纯度为97.1％。4．2乌头碱对心肌培养细胞染毒模型的建立及毒性效应观察建立乌头碱染毒模型，与正常对照组比较，不同剂量乌头碱染毒后，心肌细胞出现非同步性搏动，搏动减慢，甚至停博。心肌细胞乌头碱染毒后，毒理病理变化与中毒剂量、中毒时间呈现一定的相关性。4．3乌头碱对大鼠心肌培养细胞DNA损伤的观察心肌培养细胞被不同浓度乌头碱染毒后，尾部DNA含量、彗尾长度、尾矩、Olive-尾矩均随乌头碱浓度增加而升高，头部DNA含量则逐渐降低，与对照组相比，均有极显着性差异（P＜0.01）；结果显示，乌头碱染毒剂量越大，心肌细胞DNA损伤越严重。4．4乌头碱对心肌培养细胞内PKCα蛋白表达的影响4．4．1对心肌细胞内P-Cx43（Ser-368）表达的观察各实验组均以Normal为参照。不同干预组对P-Cx43（Ser-368）蛋白表达均有所不同。与正常对照组比较，ACO、A．P．、G（o|¨） 6976组心肌细细胞P-Cx43（Ser-368）蛋白表达均下降；AAP、AAP+ACO、AAP+G（o|¨）9676组P-Cx43（Ser-368）蛋白表达均上升。选用Games-Howell统计方法，检验多组间均数的多重比较，显示ACO、A．P．、G（o|¨） 6976三组间，仅ACO染毒组具有统计学差异（P＜0.05）；而AAP、AAP+ACO、AAP+G（o|¨）9676三个干预组之间未见明显差异。从Western Blotting检测结果显示：ACO、A．P．、G（o|¨） 6976干预后，Cx43（Ser-368）位点磷酸化蛋白表达减少；经APP预处理后，磷酸化表达增强，且效果明显（P＜0.01）。4．4．2对心肌细胞内NP-Cx43（Ser-368）表达的观察各组NP-Cx43（Ser-368）位点磷酸化状态蛋白定量分析结果显示：与正常对照比较，A．P．组、ACO染毒组、G（o|¨） 6976组表达增强（P＜0.01），其中A．P．组表达最强。而AAP组、AAP+ACO组、AAP+G（o|¨） 6976联用组则表达降低（P＜0.01）。4．4．3对心肌细胞中总PKCα表达的观察各组总PKCα蛋白定量分析结果显示：与正常对照比较，A．P．组、ACO染毒组、G（o|¨） 6976组、AAP组、AAP+ACO组、AAP+G（o|¨） 6976联用组心肌细胞内总PKCα表达水平无显着差异（P＞0.05）。4．4．4对心肌细胞中总P-PKCα（Ser-657）表达的观察各实验组均以Normal为参照。不同实验干预组P-PKCα（Ser-657）蛋白均有不同程度的表达。正常组和ACO组心肌细胞内均有P-PKCα（Ser-657）蛋白表达，而A．P．组心肌细胞内无P-PKCα（Ser-657）蛋白表达。与正常对照组相比较，ACO组、G（o|¨） 6976组心肌细胞中P—PKCα（Ser-657）磷酸化蛋白表达显着降低（P＜0.01）。而AAP组、AAP+ACO组、AAP+G（o|¨） 6976联合处理组，磷酸化表达增强，心肌细胞P-PKCα（Ser-657）蛋白表达显着增高（P＜0.01）。4．4．5乌头碱染毒前后心肌细胞PKCα及PKCα（Ser-657）位点磷酸化状态的观察应用激光扫描共聚焦显微镜，观察免疫荧光检测结果显示：标记总PKCα的Fluorescein呈绿色荧光信号，弥散性分布于心肌细胞胞浆中。与正常对照组相比较，ACO染毒组、G（o|¨） 6976组、AAP组、AAP+ACO组、AAP+G（o|¨） 6976联合处理组总PKCα绿色荧光信号差异无显着性。标记P-PKCα（Ser-657）的Rhodamine呈红色荧光信号，弥散性分布于心肌细胞胞浆中。与正常对照组相比较，ACO染毒组、G（o|¨） 6976组，红色荧光信号显着减弱，有极显着性差异（P＜0.01）；而AAP组、AAP+ACO组、AAP+G（o|¨） 6976联合处理组红色荧光信号较正常对照组，也有极显着性差异（P＜0.01）。4．5乌头碱对大鼠心肌培养细胞Ca2+调控蛋白表达的影响多重荧光复合RT-PCR检测发现，与正常对照组比较，乌头碱染毒组RyR2、NCX基因mRNA表达增加，而PLB、SERCA2基因mRNA表达减少。4．6乌头碱中毒尸检资料分析病理变化特征主要为：①心肌灶性出血，细胞横纹不清，肌浆凝聚，细胞间质淤血；②肝可见肝细胞灶性或点状坏死，可见肝细胞脂肪变性或水样变性；③肺脏可有灶性或点状出血，灶性肺水肿；④可见部分胃粘膜有散在性点状出血；⑤偶见肾组织点状出血和散在性坏死。5研究结论5．1优化、规范心肌细胞培养方法，建立稳定的体外新生大鼠培养细胞的乌头碱染毒模式，为法医毒理学研究提供了方法学上的参考。5．2乌头碱染毒可引起心肌细胞DNA损伤，并呈明显的剂量—效应关系，推测细胞DNA损伤参与乌头碱毒性作用机制。5．3乌头碱染毒可影响PKCα本身的磷酸化状态，同时乌头碱染毒所致的PKCα（Ser657）位点蛋白磷酸化表达下降，可进一步导致心肌细胞Cx43磷酸化状态减弱。推测PKCα磷酸化、Cx43磷酸化状态的改变是乌头碱心肌细胞毒性作用机制之一。5．4乌头碱可影响心肌细胞Ca2+调控蛋白的表达，使RyR2、NCX基因mRNA表达增加，PLB、SERCA2基因mRNA表达减少，推测Ca2+调控蛋白参与了乌头碱毒性作用机制。其毒性作用机制的方式仍有待进一步研究。。Ca2+调控蛋白参与毒性作用机制有待进一步研究。5．5对10例乌头碱中毒尸检资料进行分析，总结其毒理病理变化特点，并提出乌头碱中毒法医学鉴定的注意事项。
刘水平,罗斌,李朝晖,刘小山[10]（2007）在《挤压伤大鼠血清对血管内皮细胞凋亡的作用及机制探讨》文中研究指明目的观察挤压伤大鼠血清对血管内皮细胞凋亡的影响及可能机制。方法培养小牛主动脉内皮细胞,观察挤压伤大鼠血清对培养的血管内皮细胞凋亡及胞内钙浓度的影响,并检测血浆内皮素-1（endothelin-1,ET-1）及心钠素（atrial natriuretic peptide,ANP）的含量。结果与正常大鼠血清相比,挤压伤大鼠血清致细胞的凋亡百分数由（8.26±1.75）%降为（2.75±0.90）%,胞内钙浓度由（96.98±3.95）nmol/L增加到（118.79±3.22）nmol/L,挤压伤大鼠血浆内皮素-1和心钠素含量显着增高。结论肢体挤压伤大鼠血清可抑制血管内皮细胞的凋亡,此效应可能与内皮素-1和心钠素诱发胞内钙浓度增加有关。
二、挤压伤大鼠血清对培养新生大鼠心肌细胞的作用（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、挤压伤大鼠血清对培养新生大鼠心肌细胞的作用（论文提纲范文）
（1）LncRNA Fendrr调控心肌成纤维细胞活化增殖的机制研究（论文提纲范文）
| 英文缩略词表(Abbreviation) |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法及分组 |
| 2.3 统计学处理 |
| 3 结果 |
| 3.1 心房颤动患者心脏组织中LncRNA Fendrr、DNMT3B、Col1A1 和α-SMA表达量的变化以及病理学变化 |
| 3.2 SD大鼠心肌纤维化心脏组织中LncRNA Fendrr、DNMT3B、Col1A1 和α-SMA表达量的变化以及病理学变化 |
| 3.3 TGF-β1 作用后原代心肌成纤维细胞增殖能力以及LncRNA Fendrr、DNMT3B、Col1A1 和α-SMA表达量的变化 |
| 3.4 瞬时转染LncRNA Fendrr过表达质粒后原代心肌成纤维细胞增殖能力以及LncRNA Fendrr、DNMT3B、Col1A1 和α-SMA表达量的变化 |
| 3.5 抑制DNA甲基化转移酶后,原代心肌成纤维细胞增殖能力以及Col1A1、α-SMA和 RASSF1A表达量的变化 |
| 3.6 心肌纤维化模型中RASSF1A和Mst1的表达情况以及瞬时转染RASSF1A-si RNA以后原代心肌成纤维细胞中Col1A1、α-SMA和增殖活性的改变 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 6 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 综述 LncRNAs 在心肌纤维化中的作用 |
| 参考文献 |
（2）一种优化新生大鼠心肌细胞培养方法及CTRP3保护MIRI作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略词表 |
| 引言 |
| 一、新生大鼠心肌细胞的分离培养 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 二、CTRP3 保护MIRI作用研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 结论 |
| 不足与展望 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间研究成果 |
（3）右美托咪定调控HIF-1α信号通路减轻心肌缺血再灌注损伤的分子机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 右美托咪定后处理减轻原代乳鼠心肌细胞的缺氧复氧损伤 |
| 研究目的 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论与小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 右美托咪定后处理通过在转录后水平抑制HIF-1α信号减轻缺氧复氧过程中心肌细胞凋亡的分子机制 |
| 研究目的 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论与小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 右美托咪定后处理通过调控HIF-1α信号抑制细胞凋亡减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤 |
| 研究目的 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论与小结 |
| 参考文献 |
| 结论和展望 |
| 综述 (第一部分)心肌缺血再灌注损伤和右美托咪定心肌保护作用的相关研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述 (第二部分)A systematic Review: Effects of Perioperative Dexmedetomidine Use on Postoperative Mortality and Major Morbidity in Adult Patients Who undergo Cardiac and Non-cardiac Surgery |
| References |
| 附录 |
| 个人简历及博士研究生期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（4）NPY诱导心肌细胞肥大的线粒体机制及相关信号通路的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 NPY诱导新生SD大鼠原代心肌细胞肥大 |
| 材料和方法 |
| 实验结果 |
| 小结 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 NPY诱导新生SD大鼠原代心肌细胞线粒体损伤 |
| 材料和方法 |
| 实验结果 |
| 小结 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 NPY诱导新生大鼠原代心肌细胞肥大和线粒体损伤的信号通路研究 |
| 材料和方法 |
| 实验结果 |
| 小结 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| Review |
| References |
| 中英文对照缩略词表 |
| 本课题支持 |
| 攻读博士期间公开发表的论文 |
| 致谢 |
（5）β受体阻滞剂联合液体复苏对束缚挤压伤大鼠生存率及心肌损伤的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩写 |
| 引言 |
| 第一部分 束缚挤压伤致大鼠心肌损伤的研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 β受体阻滞剂联合液体复苏治疗束缚挤压伤大鼠生存率及心肌损伤的效果评价 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 综述 心脏肾上腺素能系统与左室重塑 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（6）3,4-亚甲基二氧基甲基苯丙胺对大鼠心肌细胞Connexin43以及细胞内钙稳态的影响（论文提纲范文）
| 主要缩略语英汉对照 |
| 引言 |
| 参考文献 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 实验研究 Ⅰ |
| 前言 |
| 1. 材料和方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 4. 结论 |
| 5. 参考文献 |
| 附图 |
| 实验研究 Ⅱ |
| 前言 |
| 1. 材料和方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 4. 结论 |
| 5. 参考文献 |
| 附图 |
| 实验研究 Ⅲ |
| 前言 |
| 1. 材料和方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 4. 结论 |
| 5. 参考文献 |
| 实验研究 Ⅳ |
| 前言 |
| 1. 材料和方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 4. 参考文献 |
| 课题小结 |
| 创新点 |
| 研究展望 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（7）大鼠软组织挤压伤致离体胸主动脉反应性变化（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 序言 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 附表 |
| 附图 |
| 结论 |
| 不足之处与今后研究方向 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表的论文 |
| 缩略词中英文对照表 |
| 致谢 |
（8）新型化合物—甲胺鸢尾素对急性心肌缺血损伤的保护作用及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 文献综述 |
| 缺氧诱导因子-1:缺血性心脏病治疗新靶标 |
| 1.HIF-1结构 |
| 2.HIF-1的转录、翻译和活性调节 |
| 3.HIF-1调控的靶基因 |
| 4.HIF-1与心血管发育及生理调节 |
| 5.HIF-1与缺血性心脏病 |
| 6.HIF-1与治疗性血管新生 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 论文正文 |
| 前言 |
| 实验材料 |
| 第一部分 甲胺鸢尾素改善急性心肌缺血损伤的作用及机制研究 |
| 实验方法 |
| 实验一、甲胺鸢尾素对小鼠耐缺氧作用的影响 |
| 实验二、甲胺鸢尾素对电刺激大鼠颈动脉血栓形成时间的影响 |
| 实验三、甲胺鸢尾素对正常大鼠血液流变学的影响 |
| 实验四、甲胺鸢尾素对异丙肾上腺素致大鼠心肌损伤的影响 |
| 实验五、甲胺鸢尾素对麻醉犬冠状动脉结扎致心肌缺血的影响 |
| 实验六、甲胺鸢尾素对冠脉结扎致急性心肌缺血大鼠心功能的影响 |
| 实验七、甲胺鸢尾素对缺血/再灌注损伤乳鼠心肌细胞的保护作用及其机制研究 |
| 统计学处理 |
| 实验结果 |
| 实验一、甲胺鸢尾素对小鼠耐缺氧作用的影响 |
| 实验二、甲胺鸢尾素对电刺激大鼠颈动脉血栓形成时间的影响 |
| 实验三、甲胺鸢尾素对正常大鼠血液流变学的影响 |
| 实验四、甲胺鸢尾素对异丙肾上腺素致大鼠心肌损伤的影响 |
| 实验五、甲胺鸢尾素对麻醉犬冠状动脉结扎致心肌缺血的影响 |
| 实验六、甲胺鸢尾素对冠脉结扎致急性心肌缺血大鼠心功能的影响 |
| 实验七、甲胺鸢尾素对缺血/再灌注损伤乳鼠心肌细胞的保护作用及机制研究 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分 甲胺鸢尾素在急性心肌缺血损伤后促血管新生的作用及机制研究 |
| 实验方法 |
| 实验一、甲胺鸢尾素在大鼠缺血心肌血管新生的作用与机制研究 |
| 实验二、甲胺鸢尾素对培养HUVEC细胞增殖活性的影响与机制研究 |
| 数据处理 |
| 实验结果 |
| 实验一、甲胺鸢尾素对大鼠缺血心肌血管新生的作用与机制研究 |
| 实验二、甲胺鸢尾素对培养HUVEC细胞增殖活性的影响与机制研究 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 附录1—附表 |
| 附录2—附图 |
| Manuscript No.1 |
| Manuscript No.2 |
| Manuscript No.3 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（9）乌头碱对大鼠心肌细胞毒性作用的分子毒理学机制研究（论文提纲范文）
| 英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 参考文献 |
| 技术路线 |
| 正文 |
| 第一部分 乌头碱对新生大鼠心肌培养细胞的毒理病理学基础研究 |
| 论文一 新生大鼠心肌细胞原代培养及其方法优化研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 论文二 新生大鼠心肌培养细胞乌头碱染毒模型的建立及毒性效应研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 乌头碱对新生大鼠心肌细胞毒性作用的分子毒理学研究 |
| 论文一 乌头碱对大鼠心肌培养细胞DNA损伤的研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 论文二 乌头碱对大鼠心肌培养细胞内PKCα表达的影响 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 论文三 乌头碱对大鼠心肌培养细胞Ca~(2+)调控蛋白表达的影响 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 乌头碱中毒10例法医学尸检资料分析 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果与分析 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 总结 |
| 创新 |
| 致谢 |
| 综述 |
| 乌头碱致心律失常的心肌毒性作用分子机制研究 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 一、攻读博士研究生期间发表的论文及参编教材 |
| 二、攻读博士研究生期间主持及参与的科研课题 |
四、挤压伤大鼠血清对培养新生大鼠心肌细胞的作用（论文参考文献）
- [1]LncRNA Fendrr调控心肌成纤维细胞活化增殖的机制研究[D]. 施鹏. 安徽医科大学, 2021(01)
- [2]一种优化新生大鼠心肌细胞培养方法及CTRP3保护MIRI作用研究[D]. 胡晓. 延安大学, 2020(12)
- [3]右美托咪定调控HIF-1α信号通路减轻心肌缺血再灌注损伤的分子机制研究[D]. 彭科. 苏州大学, 2020(06)
- [4]NPY诱导心肌细胞肥大的线粒体机制及相关信号通路的研究[D]. 胡君. 苏州大学, 2019(04)
- [5]β受体阻滞剂联合液体复苏对束缚挤压伤大鼠生存率及心肌损伤的影响[D]. 于梦洋. 河北医科大学, 2016(04)
- [6]3,4-亚甲基二氧基甲基苯丙胺对大鼠心肌细胞Connexin43以及细胞内钙稳态的影响[D]. 卓荦. 华中科技大学, 2013(12)
- [7]大鼠软组织挤压伤致离体胸主动脉反应性变化[D]. 王会云. 苏州大学, 2011(06)
- [8]新型化合物—甲胺鸢尾素对急性心肌缺血损伤的保护作用及机制研究[D]. 牟艳玲. 山东大学, 2009(05)
- [9]乌头碱对大鼠心肌细胞毒性作用的分子毒理学机制研究[D]. 刘艳. 华中科技大学, 2009(11)
- [10]挤压伤大鼠血清对血管内皮细胞凋亡的作用及机制探讨[J]. 刘水平,罗斌,李朝晖,刘小山. 法医学杂志, 2007(06)