靳奉理[1]2011年在《烟草根际拮抗菌的遗传多样性及系统发育分析》文中认为从贵州省遵义地区九个县市的烟草大田中采集55个烟草根际土壤样品,通过平板培养法,获得6652个细菌分离物。采用平板对峙法,以烟草黑胫病病原菌烟草疫霉(Phytophthora nicotianae)为靶标菌,获得了256株烟草根际黑胫病拮抗菌;以烟草青枯病病原菌青枯罗尔氏菌(Ralstinia solanacearum)为靶标菌,获得了178株烟草根际青枯病拮抗菌。其中31株烟草根际黑胫病拮抗菌和26株烟草根际青枯病拮抗菌具有稳定高效的拮抗作用,具有很大的生防潜力。采用BOXAIR-PCR、16S-RFLP、16S rDNA序列分析三种分子生物学方法研究了拮抗菌菌株的遗传多样性和系统发育,确定了烟草根际拮抗菌的系统发育及分类地位。BOXAIR-PCR聚类分析表明,267株烟草根际黑胫病拮抗菌在82%的相似性水平上聚在一起,并在91%的相似性水平上分成35个群。其中包括2个大群(群5,6)、21个小群和12个由单菌株组成的群;178株烟草根际青枯病拮抗菌在79%的相似性水平上聚在一起,在90.5%的相似性水平上分成41个群。其中包括2个大群(群12,13)、19个小群和20个由单菌株组成的群,表现出较大的菌株特异性。表明拮抗菌株有较强的环境适应能力,在长期进化过程中获得了丰富的遗传特性,表现出明显的遗传多样性。拮抗菌的16S-RFLP图谱显示出丰富的遗传型。267株烟草根际黑胫病拮抗菌在88.5%的相似性水平上分成25个群,其中包括2个大群(群5、6)、17个小群、6个由单菌株组成的群;178株烟草根际青枯病拮抗菌在82%的相似性水平上聚在一起,在89%的相似性水平上分成20个群,其中包括5个大群(群4、9、12、15、16)、6个小群、9个由单菌株组成的群。研究表明拮抗菌在系统发育水平上具有丰富的多样性特征。且BOXAIR-PCR聚类分析和16S-RFLP聚类分析的结果基本一致,验证了本研究的准确性。根据BOXAIR-PCR和16S-RFLP的聚类结果挑选了93株烟草根际黑胫病拮抗菌和79株烟草根际青枯病拮抗菌代表性菌株进行16S rDNA序列测定。代表菌株的16S rDNA序列分析表明,267株烟草根际黑胫病拮抗菌是由17个属构成,至少由33个种组成。芽孢杆菌属(Bacillus)、短芽孢杆菌属(Brevibacillus)、链霉菌属(Streptomyces)和假单胞菌属(Pseudomonas)是其中的优势菌属,分别占到拮抗菌总数的34.83%、17.23%、17.23%和11.99%;178株烟草根际青枯病拮抗菌是由12个属构成,至少由36个种组成。芽孢杆菌属(Bacillus)、短芽孢杆菌属(Brevibacillus)、链霉菌属(Streptomyces)和假单胞菌属(Pseudomonas)是其中的优势菌属,分别占到拮抗菌总数的40.45%、11.24%、19.66%和17.42%。研究表明烟草根际拮抗菌在系统发育水平上具有丰富的多样性特征。267株烟草根际黑胫病拮抗菌中75%的菌株是革兰氏阳性菌,仅有65株拮抗菌属于革兰氏阴性菌。其中首次发现Bacillus altitudinis、Delftia tsuruhatensis、Delftia lacustris、Streptomyces roseolus、Burkholderia arboris、Lysobacter capsici、Sinorhizobium adhaerens、Stenotrophomonas maltophilia、Advenella incenata、Kocuria palustris、Agrobacterium tumefaciens和Myroides odoratimimus对烟草黑胫病病原菌烟草疫霉具有拮抗作用;178株烟草根际青枯病拮抗菌中,革兰氏阳性菌占多数,包含135株拮抗菌,革兰氏阴性菌则仅有43株。其中首次发现Bacillus altitudinis、Bacillus silvestris、Bacillus horikoshii、Bacillus mycoides、Bacillus pseudomycoides、Brevibacillus formosus、Streptomyces tanashiensis、Streptomyces achromogenesnbrc、Streptomyces polychromogenes、Kocuria palustris、Acinetobacter lwoffii、Ensifer adhaerens、Kocuria palustris和Delftia tsuruhatensis对烟草青枯病病原菌青枯罗尔氏菌具有拮抗作用。
刘璇[2]2012年在《防治烟草黑胫病复合微生物的构建》文中研究说明烟草黑胫病（Tobacco Black Shank）是由烟草黑胫病菌（Phytophthora parasitica var. nicotianae）引起的危害烟草生产的重要病害之一，利用微生物制剂防治烟草黑胫病，是目前防治中研究的主要方向。因此，本研究从青岛即墨烟草试验基地分离烟草根际细菌，首先通过拮抗试验、抗病能力测试等方法筛选拮抗菌株；然后筛选出烟草根际固氮菌、解磷菌和解钾菌，并进行混合培养，得到对烟草具有良好促生作用的稳定细菌组合；最后将拮抗菌与稳定细菌组合进行复合，得到对烟草黑胫病有良好防治效果的复合微生物。具体结果如下：1．从烟草根际土壤中分离获得92株细菌，初筛后得到26株对烟草黑胫病菌有拮抗效果的菌株；复筛后得到拮抗效果较好的细菌7株；再依据盆栽实验结果，获得具有良好拮抗效果的拮抗菌4株，分别编号为22、24、3-4和5-2。采用菌落和菌株形态观察和16SrDNA序列分析两种方法相结合，鉴定22、24、3-4和5-2四个菌株所属的种属。结果表明，拮抗菌株22是枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）；拮抗菌株24是死谷芽孢杆菌（Bacillus vallismortis）；拮抗菌株3-4是粪产碱杆菌（Alcaligenes faecalis）；拮抗菌株5-2是淀粉液化芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）。2．利用选择性培养基，初步筛选得到固氮菌8株、解磷菌12株、解钾菌8株。对这28株分别具有固氮能力、解磷能力和解钾能力的细菌随机分组混合，在设计的12种培养基中进行继代培养，最终获得22个稳定细菌组合，每个稳定细菌组合大多含有2-3种细菌。温室盆栽试验得到10个稳定细菌组合对烟草有显著生长促进作用。抗烟草黑胫病温室盆栽试验中，得到7个有防效的微生物组合。将具有明显促生作用的微生物组合与烟草黑胫病的拮抗菌按照1：1混合，从植株盆栽试验中筛选出15个有防病作用复合微生物组合，其中防效均高于微生物组合和拮抗菌单独防效的复合微生物组合为22+6A、22+7B和5-2+11A。3．采用荧光定量PCR方法，确定了复合微生物处理对盆栽烟草根际烟草黑胫病菌数量的影响。结果表明：对照土壤中烟草黑胫病菌的分生孢子数显著高于复合微生物处理的分生孢子数，说明施用复合微生物可以明显减少土壤中烟草黑胫病菌的数量，可以达到防治烟草黑胫病的目的。4．对稳定细菌组合的组成进行鉴定，采用菌落和菌株形态观察和16SrDNA序列分析相结合的方法，鉴定6A1、6A2、7B1、7B2和7B3个菌株的种属关系。结果表明，菌株6A1为阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)；菌株6A2为产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)；菌株7B1为不动杆菌（Acinetobacter tandoii）；菌株7B2为Wautersiella falsenii（2006年新属新种）；菌株7B3为阿氏肠杆菌（Enterobacter asburiae）。
顾金刚[3]2000年在《烟草根际促生细菌的分离、筛选及防治黑胫病研究》文中指出本文进行了烟草PGPR的初步研究。研究内容包括菌株的分离、筛选和菌种鉴定；用抗生素双标记法标记研究了在灭菌土和非灭菌土、有趋化介质和无趋化介质条件下的菌株定殖部位和定殖量关系以及标记菌株在土壤中消长动态，对4株根际细菌的趋化性进行了测定；进行了防病促生机制的初步研究。 1．从云南省大理、楚雄、昆明、曲靖和玉溪等地采烟田土样13份，按外根际、根表和内根际在不同培养基上分离的方法，分离到根际细菌753株。采用平板拮抗的方法筛选出对Pythium sp.，Rhizoctonia solani和Phytophthora parasitica var．nicotianae Tucker有拮抗作用拮抗菌97株，进一步测定这些菌株对烟草发芽率和苗期生长的影响，筛选到促生细菌20株，再通过温室的盆栽试验筛选到7株，其中2株温室相对防病效果达到42.22％和37.78％。 2．根据7株细菌的形态、培养特征和生理生化特性以及采用ID32GNATB细菌半自动鉴定系统，将RB-42、RB-78、RB-89鉴定为荧光假单胞杆菌-1（Pseudomonas fluorescens-1）、铜绿假单胞杆菌（Pseudomonas aeruginosa）、荧光假单胞杆菌-2（Pseudomonasfluorescens-2），RB-1和RB-59分别鉴定为肠杆菌属的日勾维肠杆菌（Enterobacter gergoviae）和阴沟肠杆菌（Enterobacterclocae），R2鉴定为放射性土壤杆菌（Agrobacterium radiobacter），R4鉴定为芽孢杆菌（Bacillus sp.）。 3．选用荧光假单胞杆菌RB-42和RB-89菌株进行利福平和硫酸链霉素的遗传双标记，标记菌株都能够成功定殖于烟株的根表，在灭菌土和加有趋化介质的条件下，菌株在根尖的定殖量都大于非灭菌土和不加趋化介质。菌株在根表的消长动态表明：标记菌株在烟苗根表的定殖量前期均有一个上升过程，随后逐渐下降，施入4周后，在烟苗根部仍有一定的定殖量。 4．对RB-89、RB-42、R2、RB-1等4株细菌的趋化性测定表明，4株细菌对根部收集液的趋化值都大于1。选用RB-42和RB-89菌株进行对趋化物质的测定表明，对氨基酸的趋化性最强，对有机酸次之，对糖类物质最弱。对酪氨酸、脯氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸表现出较强的趋化性，对组表酸、苏氨酸无趋化性；菌株对有机酸的趋化性没有明显差别，RB叫2对乳酸的趋化性表现的比对其亡有机酸强． 5．本文测定了代表苗株的作用机制。测定了菌株产HCN的能力，RB－4 2、RB－5 9和m－7 8具有较高勺产肌N的能力、结合筛选过程中的促生结果比较，发现产HCN能力高的菌株其促生结果也较好．RB－一2、RB－89菌株抑制致病疫霉菌丝的生长，通过镜检，经菌株处理后的菌丝，菌丝呈手指分叉状，粗缩、变短，分枝短粗、原生质浓缩，抱子囊也发生变形，灭菌的发酵液处理致病疫霉菌丝生长也有类似结果，抑制程度有强有弱。同时证明筛选出的菌株能促进烟株对P、K营养元素的吸收。根际细菌能够引起根际PH值的下降，能够使根际微环境中 Mn、Zn、P、L、Ca、Mg离子含量增高。 通过本文的研究，发现筛选的根际细菌具有防病促生和提高烟株中K含量的能力。
董国菊[4]2012年在《荧光假单胞菌Pseudomonas fluorescens P-72-10菌株对烟草黑胫病的生防机理研究》文中指出烟草是一种重要的经济作物,由烟草疫霉Phytophthora nicotianae Breda de Haan引起的烟草黑胫病是烟草生产上的一种毁灭性真菌土传病害。该病原菌破坏性极强,烟株受害后易造成整株死亡,严重影响烟草生产。目前,生产上仍依赖于化学农药防治烟草黑胫病,但长期使用化学农药,容易诱发病原菌产生耐(抗)药性菌株,污染环境和破坏生态系统,同时烟草是叶用经济作物,农药残留会影响烟叶的品质。随着烟草及其制品向更加安全化方向发展的趋势,寻找一种安全、无毒、经济、有效和可持续发展的病害控制途径是当务之急。生物防治由于具有经济有效、且对环境安全友好的特点,被认为是一种最具潜力的、可替代化学农药的方法,现已成为植物病害防治研究的热点。鉴于此,本文以分离自连作烟田健康烟株根际土壤的5个细菌菌株为研究对象,从中筛选出对烟草疫霉具有高效拮抗作用的菌株；进一步围绕该高效菌株对病原菌的抑制机制、其在烟草幼苗根部的定殖规律以及对烟草生长的影响等方面展开系统深入的研究,初步探明该高效菌株的生防机理；在此基础上对该菌株进行鉴定并初步明确其最适的摇瓶培养条件。主要研究结果如下。高效拮抗烟草疫霉根际细菌菌株的筛选5个供试菌株中,除P-70-3菌株外,其余4个菌株对烟草疫霉均有很强的平板拮抗效果,且5个供试菌株的胞外代谢产物对病原菌也表现出不同程度的抑菌作用。其中,P-72-10菌株的拮抗效果和抑菌作用最强,平板对峙培养中抑菌带半径达13.0mm,相对抑制率为68.57%；其胞外代谢产物粗提液对病原菌的抑制作用随浓度的增加而增强,分别为24.92%(10-3)、27.18%(10-2)、39.84%(10-1)和46.03%(原液),且与对照相比差异显著(P<0.05)。P-72-10菌株对烟草黑胫病的温室控病效果该菌株的带菌培养液灌根处理烟草幼苗后,能减轻烟草植株的发病率和降低病情指数；其对抗病和感病品种的控病效果表现出一定的差别,相对防效分别为53.57%和66.37%,与对照处理相比均达到差异显著水平(P<0.05)。P-72-10菌株对烟草疫霉的抑制机制该菌株产生的挥发性代谢产物能抑制烟草疫霉菌丝的生长,相对抑制率达到32.94%。显微观察发现：对照菌丝形态饱满,细胞壁光滑,胞质均匀透明,分支正常；而平板对峙培养中受抑制菌落边缘的菌丝形态发生畸变,其菌丝不正常的分支增多,菌丝顶端细胞畸形生长,并在菌丝的顶端或中间均有泡囊形成；部分菌丝干瘪皱缩,原生质渗漏；还有部分菌丝出现扭曲集结的现象。该菌株的菌体悬浮液和无菌滤液均能诱发病原菌菌丝形态发生类似的畸变现象。该菌株能产生纤维素酶、蛋白酶和嗜铁素等抗菌物质。P-72-10菌株在烟草根部的定殖规律该菌株对抗生素利福平敏感,以利福平为标记抗生素,经不同浓度的利福平逐级选择压力诱导后,最终获得抗利福平(300μg/mL)的突变菌株P-72-10:Rifo该突变菌株的培养性状及对病原菌的拮抗能力与原始菌株无差异。通过种子细菌化,该突变菌株能成功地定殖于烟草幼苗的根部,其在根部的定殖动态呈现为先上升后下降的趋势；种子萌发出苗28天后,在烟草幼苗的根部仍能检测到P-72-10:Rif菌株,其定殖量维持在104cfu/g这一稳定的水平。扫描电镜定性观察发现P-72-10:Rif菌株在烟草幼苗根表不同部位的定殖分布呈现宏观不均匀性,根基部分布的菌体数量多于根中部,而根尖部分的细菌菌体数量最少。P-72-10菌株对烟草的促生效果及作用机制烟草种子经P-72-10菌株不同浓度的培养液浸种处理后,能促进幼根的伸长,其中,以10-1浓度促生效果最好,根长为0.53cm,而对照根长为0.47cm,与对照相比,增加了12.76%,且差异显著(P<0.05)；且种子的可溶性蛋白含量增加,总淀粉酶活性升高。培养液灌根处理烟草幼苗后,也能促进幼苗的生长及对N、P、K的吸收；增强光合效率、提高叶绿素含量；幼苗中丙二醛的积累量降低,与烟草植株抗性相关的防御酶(PPO、POD、PAL、几丁质酶和p-1,3-葡聚糖酶)活性升高,而各种防御酶活性的变化趋势不一致,其活性高峰出现时间与数量也有差异。P-72-10菌株的鉴定该菌株在King's B培养基上菌落呈乳白色,且能产生水溶性的黄绿色荧光色素；为革兰氏阴性细菌,菌体杆状、大小(8.1-16.2)×(1.8-4.8)μm,单端生鞭毛,不形成芽孢。其最适生长温度为30℃；不耐盐；能利用柠檬酸盐和丙酸盐。接触酶反应阳性,氧化酶反应阳性,精氨酸双水解酶反应阳性,苯丙氨酸脱羧酶反应阴性,脂酶反应阴性,硝酸盐还原反应阴性；水解明胶和酪氨酸,但不水解淀粉；能发酵葡萄糖、木糖和甘露醇。该菌株基因组DNA的(G+C)mol%含量为60.72mol%,16SrDNA基因序列分析显示该菌株与假单胞菌属的荧光假单胞菌多个菌株的序列同源性达到99%,在GenBank上的登陆号为：HQ888871。因此,该菌株鉴定为荧光假单胞菌Pseudomonas fluorescens。P-72-10菌株摇瓶培养条件的优化摇瓶培养条件下,当pH为7.0、培养时间达52h、培养温度为25℃时,P-72-10菌株在标准发酵培养基中能获得最大量的抗菌物质,且其抑菌活性最高；该菌株的抗菌物质不能长时间地耐受高温处理。正交试验表明该菌株在摇瓶培养条件下获得抗菌物质的最佳发酵培养基组分配比为：葡萄糖23g,硫酸铵20g,硝酸钾5.5g,氯化钠0.5g,蒸馏水1000mL,pH为7.0。综上所述,在“根际细菌-植物-病原菌”这一微生态互作系统中,P-72-10菌株对烟草疫霉具有高效的拮抗作用,表现出良好的防病促生功效,且通过种子细菌化能成功地定殖于烟草根部,是一株具有应用潜力的生防荧光假单胞菌菌株。本研究也表明根际细菌在防治植物土传病害具有较强的应用优势和前景。
赵龙玉[5]2012年在《烟草根际黑胫病拮抗菌抗生素合成的分子与生化检测》文中认为从贵州采集烟草根际土壤中，筛选到22株对烟草黑胫病菌具有较强、稳定拮抗能力的菌株。对拮抗细菌进行形态学观察生理生化检测，16S rRNA基因扩增与测序、Blast比对，完成鉴定，芽孢杆菌有14株。为研究此22株拮抗细菌能否产生依枯草菌素A（iturinA）、杆菌霉素D（bacillomycinD）、丰原素（fengycin）、表面活性肽（surfactin），用iturin A、bacillomycin D、fengycin、surfactin的特异引物通过PCR扩增这些菌株的生物合成基因，22株拮抗细菌有9株检测到iturin A生物合成基因，5株检测到bacillomycin D生物合成基因，13株检测到surfactin生物合成基因，没有菌株检测到fengycin生物合成基因。14株芽孢杆菌菌株中有6株具有iturin A生物合成基因，3株具有bacillomycin D生物合成基因，11株具有surfactin生物合成基因。Bacillus altitudinis ZAH3具有iturin A、surfactin生物合成基因，Bacillus flexus WCH1具有bacillomycin D生物合成基因，Delftia tsuruhatensis MTH23具有surfactin生物合成基因，Alcaligenes faecalis RHH48具有bacillomycin D生物合成基因，Kocuria palustris WCH21具有iturin A生物合成基因，Aqrobacterium tumefaciesYQH34具有iturin A生物合成基因，Tetrathibadter kashmirensis WCH18具有surfactin生物合成基因。利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorptionionization-time of flight-mass spectrometry, MALDI-TOF-MS）检测菌株ZAH3、WCH1、MTH23、RHH48、WCH21、YQH34、WCH18抗生素的合成。ZAH3可产生surfactin，WCH1可产生bacillomycin D， MTH23可产生surfactin， RHH48可产生bacillomycin D和fengycin， WCH21可产生iturinA和fengycin， YQH34可产生iturinA，WCH18可产生surfactin和fengycin。MALDI-TOF-MS结果与PCR结果不完全一致，菌株ZAH3通过PCR检测到iturin A生物合成基因却未通过MALDI-TOF-MS检测到iturinA，菌株RHH48、WCH21、WCH18未通过PCR检测到fengycin生物合成基因却通过MALDI-TOF-MS检测到fengycin。在不同菌株的质谱中占主要类型的抗生素不同，这表明尽管有些菌株具有多种抗生素的生物合成基因，但在一定时间只有一或两种抗生素能够大量产生，在特定条件下起作用的主要抗生素也因菌株而异，该研究的结果表明特殊菌株产生的大多数抗生素可能受细菌遗传因素影响并受环境信号诱导。本研究首次对Bacillus altitudinis、Agrobacterium tumefaciens、Delftia tsuruhatensis、Kocuria palustris、Bacillus flexus、Tetrathibadter kashmirensis进行产抗生素检测。生物防治中有与抗生素一起发挥协同作用的几种机制，然而在一定时间和特定环境条件下，抗生素在防治植物病原菌中发挥最主要作用。本研究表明从烟草根际分离的拮抗菌株具有产生多种抗生素的能力，使之具有成为生物防治工具的潜能。从分子水平上和生化水平上理解生物防治的机制有利于在农业生态系统中创建合理的拮抗物和代谢物的应用策略。
王万能[6]2003年在《烟草内生细菌对烟草黑胫病的防治作用及其机理的研究》文中研究说明烟草黑胫病是烟草上重要的毁灭性病害，从苗期到成株期都可发生，生产上主要以化学防治为主，不仅药剂难以长期持续有效，还严重污染环境和危害人体健康。利用有益微生物防治植物病害，持续有效，保护环境，是近年来研究的热点。已经报道的烟草黑胫病的生物防治主要是利用从根围分离的真菌、细菌，但由于定殖差，受环境条件制约，防效难以稳定。植物内生细菌分布于植株体内，生长繁殖相对稳定，是很好的生防菌资源。本研究论文就防治烟草黑胫病的内生细菌进行了筛选，并对其作用机理进行了初步研究。 1、本论文对烟草疫霉培养产孢方法进行了研究。通过实验，芝麻培养基、黑麦培养基、燕麦培养基可用来培养烟草疫霉，烟草疫霉在三种培养基上的平均每天生长量为1.10cm、0.78cm、0.86cm。芝麻培养基、黑麦培养基为烟草疫霉产孢子囊较好的培养基，产孢能力强，分别为2.52×10~4个孢子囊／cm~2、2.07×10~4个孢子囊／cm~2。而且孢子囊释放率高，分别为40.0％、32.1％。 2、通过分离内生细菌、平板筛选，共获得238个内生细菌菌株，对烟草疫霉有抑制作用的菌株有13个，占5.5％，都来自根茎部。通过盆栽试验，获得了对烟草黑胫病有很好防效的内生细菌118、57、93等菌株，在温室控病实验中它们的防效可达69.23％、61.53％、65.38％。为以后大田试验以及生产应用打下了一定的基础。 3、论文对内生细菌118菌株防治烟草黑胫病的机理进行了初步研究，其作用机理包括直接拮抗作用和诱导抗病作用。118菌株的发酵液虽不能抑制烟草疫霉游动孢子囊释放，但能抑制菌丝生长、游动孢子游动及萌发；而且118菌株还能诱导烟草体内POD、PPO、PAL等抗病相关酶的活性明显升高。研究其生防作用机理为以后在其他作物上开发利用内生细菌提供了一定的理论依据。
王晶晶[7]2011年在《两株生防菌对烟草黑胫病的抑制活性及其特性研究》文中研究说明本研究从采集的健康植物样品中分离微生物,从中筛选烟草黑胫病生防菌,研究其抑制活性、根际定殖特性、发酵条件和使用技术,为烟草黑胫病的生物防治奠定了基础。1、生防菌的筛选及其特性从信阳、平顶山、许昌和重庆等地采集的116份植物与土壤样品中分离得到871株根际细菌,其中61菌株对烟草疫霉菌具有拮抗活性,从中筛选K9-3和L14-2对烟草黑胫病防治具有潜力的两菌株。在室内试验中,K9-3和L14-2均抑制烟草疫霉菌的菌丝生长、游动孢子囊形成、游动孢子释放和休止孢子萌发,在盆栽试验中显著防治烟草黑胫病,其防治效果达到77.78%和96.29%。另外,K9-3和L14-2均具有根际定殖能力,以双层滤纸法检测在烟草根系定殖密度各为1.30×105cfu/cm和7.0×104cfu/cm,以盆栽检测法测定其根际定殖密度结果,两菌株均在烟草根系保持106cfu/g以上水平的定殖密度,在烟草培育期在根际土壤中定殖密度前期有下降趋势,第7d后定殖密度比较稳定,移栽第21d时均保持在5×104cfu/g以上水平。2、生防菌的鉴定根据两菌株的形态特征、生理生化特性与16S rDNA序列同源性分析, K9-3鉴定为普城沙雷菌(Serratia plymuthica),L14-2鉴定为绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)。3、生防菌使用技术本研究为了探索K9-3和L14-2的施用技术,进行K9-3和L14-2施用浓度、施用方法和施用时期对烟草黑胫病的防治效果和在烟草根际土壤和烟草根系定殖密度的影响。K9-3和L14-2均109cfu/mL和108cfu/mL浓度处理对烟草黑胫病的防治效果明显,K9-3菌株的109cfu/mL和108cfu/mL处理防治效果各为78.14%和77.78%,L14-2菌株的109cfu/mL和108cfu/mL处理防治效果各为96.38%和95.93%;处理时期为K9-3和L14-2均移栽期浸根处理时防治效果显著,其防治效果各达到59.68%和69.35%,移栽期浸根处理的基础上移栽后进行两次灌注处理均提高其防治效果,其防治效果各达到66.13%和83.87%。4、生防菌发酵条件通过单因素试验和正交试验优化了K9-3和L14-2最佳生长和表现拮抗活性的培养条件和营养条件。K9-3培养条件是温度为30℃,转速为150r/min,装液量为60%,培养基初始pH为8的条件下培养32h为最佳,其碳源、氮源和无机盐各为1% Glycerol,0.1%酵母膏和5mmol/L K_2HPO_4;L14-2的培养条件是在温度为30℃,转速为160r/min,装液量为50%,培养基初始pH为7.5的条件下培养36h为最佳,其碳源、氮源和无机盐各为1% Glycerol、0.1%蛋白胨和5mmol/L K_2HPO_4。
王成[8]2012年在《烟草黑胫病生防菌的筛选》文中提出本试验利用分离获得的烟草黑胫病菌10株，用菌丝块无创伤法接种NC1071、L8、Florida301、小黄金1025共4个鉴别寄主烟苗茎基部进行了生理小种测试。结果发现，10株黑胫病菌有6株属于1号生理小种，4株属于0号生理小种。采用栽培的KRK26、红花大金元、NC82、K326共4个品种同法进行鉴别寄主筛选，结果表明红花大金元可以代替小黄金1025作为感病品种对照。同时发现不同菌株对KRK26、K326和NC82的致病力存在明显差异，表明这3个品种可用于病菌致病力分化测定的品种使用。以筛选到的致病性强的烟草黑胫病菌gh·2作为靶细胞，采用平板对峙培养法筛选出12株对烟草黑胫病菌具有明显拮抗作用的菌株，抑菌带宽度达到6mm以上。上述12株拮抗菌株经过16SrDNA分析，结果表明，12株拮抗细菌的亲缘关系都很近，全部属于枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）或解淀粉芽孢杆菌（Bacillusamyloliquefaciens）。12株菌株进行温室促生作用测定，结果表明，12株菌株均对烟苗有一定的促生作用,尤其菌株YX-117和YX-69促生作用最好，能明显增加烟苗的叶面积、地上部分鲜重和地下部分鲜重。温室防病测定表明，12个拮抗菌株在两个不同品种的烟苗上对烟草黑胫病均具有一定的防效，12个拮抗菌株在KRK26的防效为60.00-84.14%，在红花大金元上菌株的防效仅为13.21-76.73%，其中117菌株防效最好，在KRK26品种的防效达到84.14%，在红花大金元品种的防效达到76.73%；其次为69菌株，在KRK26品种的防效达到77.25%，在红花大金元品种的防效达74.21%。用利福平标记测定了2株生防菌，YX-117和YX-69在烟株根际土壤中定殖和消长动态，结果表明，2株菌在不同品种烟苗的定殖量在同一时间段基本一致，菌悬液浓度越高，定殖量越大，在烟株根际土壤中的定殖量达到106cfu/g土。菌株的定殖量呈现逐渐减少的趋势，在接种后56d仍能检测到2株菌株大量存在。综上所述，说明YX-117和YX-6菌株在烟株根际土壤的具有很强定殖能力。
杨廷[9]2007年在《假单胞菌20～#-5菌株对烟草黑胫病的生物防治研究》文中研究说明烟草黑胫病(Tobacco Black Shank)是一种由烟草黑胫病菌[Phytophthora parasitica var．nicotianae(Breda de Hean)Tuker]引起的烟草病害，破坏性极强，对所有栽培烟草具有世界范围内的毁灭性危害，其防治十分困难。目前，人们主要是用化学农药来防治该病。然而，由于具有环境污染严重、残留药物对人畜危害大、容易诱导产生病虫害的耐药性等问题，传统的化学农药已经受到严重的质疑和挑战。与之相比，生物农药具有对哺乳动物毒性低、对环境压力小等优点。因此，生物农药的研制与开发具有很大价值和潜力。在研究烟草黑胫病生防菌的过程中，我们从土壤中分离得到一株产多种抗生素的假单胞菌Pseudomonas sp.,编号为20~#-5，初步研究表明其对烟草黑胫病菌有较强的抑制作用。本论文在此基础上，对目标菌株20~#-5抑制烟草黑胫病菌的平板拮抗作用、防治烟草黑胫病的温室控病试验、田间防效试验及其定殖规律进行了系统的研究。结果如下：1．平板拮抗试验分别用20~#-5菌及其发酵液内的活性物质对烟草黑胫病菌进行了平板拮抗试验。结果表明，20~#-5菌明显抑制了黑胫病菌的生长，对峙培养60h后，抑菌带宽达到0.5cm；镜检受抑制的黑胫病菌菌丝，发现菌丝生长畸形，菌丝壁消解。20~#-5菌发酵液内的活性物质(以下简称20~#-5菌发酵液)对黑胫病菌菌丝的生长也有抑制作用，活性物质浓度越高，抑制率越强。2．温室控病试验采用20~#-5菌发酵液对烟草黑胫病进行盆钵控病研究。20~#-5菌发酵液对烟草黑胫病发病前的处理和发病后的处理均有一定的防治效果，分别达到59.32％和10.17％，前者防效明显高于后者。温室盆栽试验表明，20~#-5菌发酵液对烟草黑胫病的预防效果远远好于治疗效果，这为田间防治提供了重要信息。3．田间防效试验发病初期，20~#-5菌发酵液对烟草黑胫病发病前的处理防效为64.39％，低于20％移栽灵防治效果的72.07％；高于58％甲霜灵-锰锌(防效为44.88％)；发病后的处理防效仅为39.88％。统计结果显示，各药剂处理的防效之间差异不显著。发病盛期，20~#-5菌发酵液对烟草黑胫病发病前的处理防效有所上升，达到75.68％，高于发病后的处理(防效为50.00％)、58％甲霜灵-锰锌(防效为36.58％)和20％移栽灵(防效为29.77％)，但其与前二者差异不显著，与后者差异显著。两个化学药剂处理的防效均有下降趋势。发病末期，20~#-5菌发酵液对烟草黑胫病发病前的处理防效仍在上升，达79.70％，显著高于58％甲霜灵-锰锌(防效为37.84％)和20％移栽灵(防效为29.16％)；也高于发病后的处理(防效为49.02％)，但差异不显著。与发病初期、盛期、末期的各对照药剂比较，20~#-5菌发酵液对烟草黑胫病发病前的处理防效和发病后的处理防效一直上升，说明其药效稳定，持效期较长。对黑胫病发病前的处理的防效明显高于发病后的处理，进一步证明20~#-5菌发酵液对烟草黑胫病主要起预防作用。4．定殖试验通过逐步提高链霉素(Streptomycin，Stre)浓度的方法，成功对20~#-5菌进行了抗链霉素标记，获得了抗200μg·ml~(-1) Stre的自发突变株，记为20~#-5~*。20~#-5~*菌在牛肉膏蛋白胨培养基中连续传代10次，仍具有稳定的抗药性，且与原始菌株具有相似的平板拮抗能力和盆栽控病效果，可以作为20~#-5菌的标记株进行定殖研究。在20~#-5~*菌的定殖试验中，所用烟草品种和土壤均与盆栽控病试验一致。结果表明，菌悬液灌根处理1d后，就能在烟草根、茎、叶内部检测到20~#-5~*菌。根内部标记菌的数量在灌根后7d里逐步上升，之后有所下降；茎和叶内部标记菌的数量在灌根后12d里一直处于上升阶段，之后也有所下降。这说明20~#-5菌具有内生性。灌根后17d，仍能在烟草根、茎、叶表面检测到标记菌株，说明20~#-5菌能够长时间定殖于烟草各组织表面。从定殖数量消长动态看，20~#-5~*菌在烟草根、茎、叶内部均有一个“由升到降”的数量变化趋势。20~#-5~*菌在根内部的定殖量明显高于茎和叶，茎和叶之间相差不大，茎稍高。
顾金刚, 方敦煌, 李天飞, 刘杏忠[10]2001年在《防治烟草黑胫病的根际细菌分离与筛选》文中提出从云南昆明、玉溪、曲靖、楚雄、大理等地 13份烟田根际土样中 ,经分离纯化得到 75 3株根际细菌。通过对黑胫病病原(Phytophthora parasitica.var. nicotiana )的平板拮抗筛选 ,共得到有抑制病原菌生长的根际细菌 97株 ,用细菌悬液浸泡烟草种子 ,通过测定烟草种子发芽率和对烟草苗期的促生作用 ,选出有较好促生作用的细菌 19株 ,再进行温室盆栽测定 ,选出对烟草黑胫病有防病促生作用的根际细菌 6株 ,分别编号为 RB- 1、R4、RB- 42、RB- 5 9、RB- 78、RB- 89。在研究过程中发现 ,从明胶、几丁质培养基和从根表上分离到的细菌 ,其防病促生作用的机率较高。在防治苗期黑胫病的温室试验中 ,RB- 42和 RB- 89菌株的相对防治效果分别达到 42 .2 2 %和 37.78%。通过形态学与生理生化初步的鉴定 ,RB- 42、RB- 78、RB- 89鉴定为假单胞杆菌 (Pseudomonasspp.) ,R4鉴定为芽孢杆菌 (Bacillussp.)
参考文献：
[1]. 烟草根际拮抗菌的遗传多样性及系统发育分析[D]. 靳奉理. 山东农业大学. 2011
[2]. 防治烟草黑胫病复合微生物的构建[D]. 刘璇. 中国农业科学院. 2012
[3]. 烟草根际促生细菌的分离、筛选及防治黑胫病研究[D]. 顾金刚. 中国农业科学院. 2000
[4]. 荧光假单胞菌Pseudomonas fluorescens P-72-10菌株对烟草黑胫病的生防机理研究[D]. 董国菊. 西南大学. 2012
[5]. 烟草根际黑胫病拮抗菌抗生素合成的分子与生化检测[D]. 赵龙玉. 山东农业大学. 2012
[6]. 烟草内生细菌对烟草黑胫病的防治作用及其机理的研究[D]. 王万能. 西南农业大学. 2003
[7]. 两株生防菌对烟草黑胫病的抑制活性及其特性研究[D]. 王晶晶. 河南农业大学. 2011
[8]. 烟草黑胫病生防菌的筛选[D]. 王成. 福建农林大学. 2012
[9]. 假单胞菌20～#-5菌株对烟草黑胫病的生物防治研究[D]. 杨廷. 西南大学. 2007
[10]. 防治烟草黑胫病的根际细菌分离与筛选[J]. 顾金刚, 方敦煌, 李天飞, 刘杏忠. 中国烟草学报. 2001