（承德医学院 河北承德 067000）
【摘要】 目的：探讨自组装方法制备Trolox-壳聚糖纳米颗粒对H2O2诱导的氧化应激损伤中SH-SY5Y 细胞的保护效果。方法：SH-SY5Y细胞分为实验组和对照组，实验组细胞加入不同浓度的Trolox和Trolox-壳聚糖。MTT法检测细胞增殖情况，倒置显微镜观察SH-SY5Y细胞形态变化。结果：药物浓度为400和600μM时，Trolox单体和Trolox-壳聚糖都具有保护作用。但与Trolox单体相比，纳米抗氧化剂能更好的保护细胞形态、显著提高细胞活力(P<0.05)。结论：该纳米抗氧化剂可有效得保护SH-SY5Y应激引发的氧化损伤，这为纳米技术更进一步应用于神经系统相关疾病的抗氧化应激治疗提供了新的实验依据。
【关键词】 壳聚糖；SH-SY5Y细胞；抗氧化剂；氧化应激
【中图分类号】R741 【文献标识码】A 【文章编号】1007-8231（2016）13-0085-02
The Protective Effect of Self-assembled Trolox-chitosan Nanoparticles On Nerve Cell Damage
LI Yanchao, Xin Zhen,Xin Siyuan,Cheng Yu.
Chengde Medical University, Hebei Chengde 067000,China,China
【Abstract】Objective To investigate the protective effect of trolox-chitosan namoparticles manufactured by self-assembled method on H202-induced oxidative stress in SH-SY5Y nerve cells. Mtthod：SH-SY5Y cells were incubated with different concentration of trolox and trolox-chitosan nanoparticles. MTT was used to detect the proliferation of SH-SY5Y cells, and inverted microscope to observe the morphology of SH-SY5Y cells. Results When the concentration of drugs were 400 and 600μM, both trolox and trolox-chitosan nanoparticles showed functions of inhibiting the oxidant damage. In addition, trolox-chitosan nanoparticles exhibited higher antioxidant activity than trolox(P<0.05). Conclusions Having an excellent antioxidant activity, trolox-chitosan nanoparticles can efficiently protect the SH-SY5Y cells from the oxidant stress.It provides a new experimental basis for the further application of nanotechnology in the nervous system related diseases of oxidation stress treatment.
【Key words】Chitosan; SH-SY5Ycells;Antioxidant;Oxidant stress
阿尔茨海默症、帕金森病、肌萎缩侧索硬化症等是严重危害人类健康的一类神经退行性疾病，是由脑中特定区域神经元发生退变而引起的慢性进行性神经系统疾病。氧化应激在脑缺血-再灌注损伤和多种神经退行性病变的病理过程中起着主要作用，保护神经元免受氧化应激的损伤，可能是防治神经退行性疾病的有效手段之一。
抗氧化剂对这些疾病的抵御作用引起了人们的广泛关注[1]。但水溶性差[2]和生物利用率低[3]却成为制约抗氧化剂应用的两大因素。纳米生物技术的出现为解决上述问题带来了可能[4]。我们前期研究中发现，我们以生物相容性好且生物可降解的壳聚糖为原料，通过表面修饰自组装制备的Trolox-壳聚糖纳米颗粒，可以有效地改善抗氧化剂的水溶性，使其能更好的保护小鼠巨噬细胞对抗氧化应激的损伤[5]。本文采用培养基中加入外源性活性氧过氧化氢（H2O2）诱导细胞凋亡氧化应激的模型，探讨了Trolox-壳聚糖纳米颗粒对H2O2诱导SH-SY5Y神经细胞氧化应激损伤的保护作用。期望所得结果可为新型纳米抗氧化剂用于预防神经系统相关疾病提供理论依据。
1.材料与方法
1.1试剂与仪器
人神经母细胞瘤细胞 (SH-SY5Y) 购自中国科学院上海细胞生物学研究所；DMEM高糖培养基：美国Gibco公司；胎牛血清：南美血源；30%过氧化氢：国药集团化学试剂有限公司；Trolox：美国Acros Organics公司；96孔板：美国Corning公司；Infinite200型酶联免疫检测仪：瑞士Tecan公司。
1.2 实验方法
1.2.1 MTT法测细胞活力 待细胞融合度达到80%～90%时，消化细胞并计数，按每孔1×104cell，100ul接种，24h后换作基础培养基并加药物至目的浓度，进行药物处理，一定时间后，换作含MTT终浓度为0.5mg/ml的基础培养基继续孵育4h，最后弃去各孔培养基，每孔加150ul DMSO溶解紫色结晶，酶联免疫检测仪测定490和570nm吸收值。
1.2.2 Trolox-壳聚糖纳米颗粒的制备 准确称取10mg Trolox，加入10ml壳聚糖溶液，在N2保护条件下，1000～2000r/min搅拌2h，即得相应粒径的水溶性Trolox-壳聚糖纳米颗粒，分别用0.45um和0.22um滤头过滤，即得到无菌的Trolox-壳聚糖纳米颗粒。
1.3 统计学方法
实验数据用均数±标准差表示，采用SPSS统计软件进行随机区组设计方法的方差分析，显著性水平为P<0.05，非常显著性水平为P<0.01。采用Origin8软件进行统计学制图。
2.结果
2.1 培养SH-SY5Y神经细胞形态的变化
倒置显微镜下观察，正常的SH-SY5Y细胞折射光性强，轴突清晰可见，贴壁状态良好；加入H2O2造模培养后，细胞折光度降低，轴突收缩，贴壁不良，有许多细胞呈悬浮状；然而预先孵育Trolox-壳聚糖纳米颗粒，可明显改善造模细胞形态，表现为细胞突触结构收缩减少，细胞贴壁状态改善。
2.2 不同浓度H2O2对SH-SY5Y细胞存活率的影响
如图1所示，在一定的时间内，随着H2O2浓度的增加SH-SY5Y细胞活力被明显抑制。当H2O2浓度为800μM、作用时间为3h时，细胞活力为对照的48.32%，接近半数抑制浓度。因此后续试验我们都采取800μM、3h这一条件。
图1 不同浓度H2O2对SH-SY5Y细胞存活率的影响。A：3h；B：6h。
2.3 Trolox(T)、壳聚糖、Trolox-壳聚糖(CT)对SH-SY5Y细胞H2O2氧化损伤的影响
如图2所示，H2O2诱导使得SH-SY5Y细胞活力明显降低(48.15%±1.27%)，400和600μM单体Trolox和纳米抗氧化剂的应用都可以提高SH-SY5Y细胞活力，相比之下，纳米抗氧化剂对细胞活力的保护比单体要高10%左右，且二者相比有显著性差异（P<0.05）。
图2：Trolox(T)、Trolox-壳聚糖(CT)对SH-SY5Y细胞H2O2氧化损伤的保护作用。
与400μM T相比，*P<0.05；与600μM T相比，#P<0.05。
3.分析与讨论
神经退变性疾病一直是困扰神经科学工作者的难题，这种疾病的发生往往伴随着大量的自由基产生，使得神经细胞受到破坏性攻击，从而加剧脑组织损伤。维生素E是生物体内最为重要的抗氧化之一。Trolox，一种维生素E的衍生物，具有与维生素E相同的抗氧化官能团，虽然因羧基的存在而具有水溶性，但溶解度不高，常常需要用二甲基亚砜或者乙醇来助溶，这难免会对细胞或生物组织产生一定的毒性。对比而言，纳米颗粒[5-6]、脂质体[7]等药物运输载体可将难溶药物包裹到纳米颗粒的内部，使得溶解度大大提供；此外，纳米药物载体容易被细胞所吞噬，进而提高细胞吸收纳米颗粒所负载药物的效率，增强药物疗效。
氧化应激诱发的自由基损伤是导致神经元凋亡的基本原因之一，因此抗氧化是保护神经元的有效途径。H2O2是公认的细胞毒素，具有很强的透膜能力，由Fenton反应生成细胞毒性极强的羟基自由基损伤细胞器和细胞质膜，可引起细胞凋亡、坏死等。由于大脑的氧利用度很高，而且神经系统的细胞内含有大量的多不饱和脂肪酸，所以中枢神经系统神经元特别容易受到氧化损伤。目前有许多学者认为阿尔茨海默病、帕金森症等多种以进行性认知障碍和记忆力损伤为主的神经退行性疾病，都与活性氧有关[8]。本实验采用H2O2建立起神经细胞的氧化应激损伤模型，考察Trolox、Trolox-壳聚糖纳米颗粒对神经细胞的保护作用，发现两者都能减轻神经细胞的受损程度且本身没有毒性，且Trolox-壳聚糖纳米颗粒的抗氧化效率明显高于Trolox单体化合物，这为新型纳米抗氧化剂用于预防神经系统相关疾病提供理论依据。
【参考文献】
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论文作者:李砚超,辛贞,辛思源,程玉
论文发表刊物:《心理医生》2016年13期
论文发表时间:2016/9/24
标签：细胞论文; 纳米论文; 损伤论文; 颗粒论文; 抗氧化剂论文; 壳聚糖论文; 神经细胞论文; 《心理医生》2016年13期论文;